化痰通絡(luò)湯對腦缺血/再灌注損傷大鼠腸道菌群的影響

曾鑫冰 唐三 謝若曦 賀驪文 鄧常清 楊筱倩 黃小平

〔摘要〕 目的 從腸道菌群探討化痰通絡(luò)湯抗腦缺血/再灌注（ischemia/reperfusion， I/R）損傷的作用機制。方法 將30只SPF級雄性大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組及化痰通絡(luò)湯高劑量組（28.66 g/kg）、化痰通絡(luò)湯中劑量組（14.33 g/kg）、化痰通絡(luò)湯低劑量組（7.16 g/kg）、陽性對照組（依達拉奉4 g/kg+丁酸梭菌5.0×108 cfu/mL），每組5只。采用大鼠局灶性腦I/R模型，給藥組在造模前2 h灌胃給藥，缺血2 h后進行再灌注，于再灌注后24 h后取腦組織和新鮮結(jié)腸糞便，氯化三苯四氮唑（triphenyl tetrazolium chloride， TTC）染色法測定腦梗死體積，16S rRNA測序檢測結(jié)腸內(nèi)容物腸道菌群變化。結(jié)果 TTC染色顯示，腦I/R后大鼠出現(xiàn)腦梗死灶，與模型組比較，化痰通絡(luò)湯高、中、低劑量組均能顯著減輕腦梗死體積，減少梗死率，且效應(yīng)具有劑量依賴性（P<0.05，P<0.01）。Alpha和Beta多樣性分析顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腸道菌群發(fā)生顯著變化（P<0.05），與模型組比較，化痰通絡(luò)湯中、高劑量組能提高大鼠腸道菌群豐富度和多樣性，并能正向調(diào)節(jié)腦I/R損傷大鼠腸道菌群和優(yōu)勢菌種（P<0.05）。結(jié)論 化痰通絡(luò)湯可能通過改善腸道菌群失調(diào)、調(diào)節(jié)腸道微生物種類和數(shù)量發(fā)揮對損傷大鼠的腦保護作用。

〔關(guān)鍵詞〕 腦缺血;再灌注損傷;腦梗死;化痰通絡(luò)湯;腸道菌群;16S rRNA

〔中圖分類號〕R259? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2023.06.004

〔Abstract〕 Objective To discuss the mechanism of action of Huatan Tongluo Decoction （HTTLD） on gut microbiota in rats with cerebral ischemia-reperfusion （I/R） injury. Methods The total of 30 SPF-grade male rats were randomly divided into? sham-operated group， model group， positive control group （Edaravone 4 g/kg+Clostridium butyricum 5.0×108 cfu/mL）， high- （28.66 g/kg）， medium- （14.33 g/kg） and low-dose （7.16 g/kg） HTTLD groups， with 5 rats in each group. The focal cerebral I/R rat model was established. The medication groups were given intragastric administration 2 h before modeling， and reperfusion was performed 2 h after ischemia. The brain tissue and fresh colon feces were taken 24 h after reperfusion. Then the cerebral infarction volume was measured by triphenyl tetrazolium chloride （TTC） staining and the changes in the gut microbiota of colonic contents were determined by 16S rRNA sequencing. Results TTC staining showed that cerebral infarction appeared in rats after cerebral I/R. Compared with model group， the cerebral infarction volume and the infarction rate in high-， medium- and low-dose HTTLD groups were significantly lower， and the effects were dose-dependent （P<0.05， P<0.01）. Alpha and Beta diversity analysis showed that compared with sham operation group， the changes in the gut microbiota of rats in model group were significant （P<0.05）. Compared with model group， HTTLD enriched and diversified the gut microbiota in medium- and high-dose HTTLD groups， and positively regulated the gut microbiota and dominant bacteria in rats with cerebral I/R injury （P<0.05）. Conclusion The protective effects of HTTLD on? rats with I/R injury may be achieved by improving the dysbiosis of gut microbiota and regulating the species and quantity of gut microorganisms.

〔Keywords〕 cerebral ischemia; reperfusion injury; cerebral infarction; Huatan Tongluo Decoction; gut microbiota; 16S rRNA

中醫(yī)學(xué)認為中風多因脾胃損傷，脾失健運，內(nèi)生濁痰，久郁化火，痰熱互結(jié)，瘀滯脈絡(luò)，上蒙清竅或痰瘀互結(jié)，痹阻腦絡(luò)而發(fā)病。痰瘀互阻是缺血性腦卒中的重要病因病機，治宜痰瘀同治。因此，缺血性腦卒中急性期發(fā)展迅速，痰濁血瘀較為突出，應(yīng)當采用化痰通絡(luò)之法治療。

化痰通絡(luò)湯在中醫(yī)經(jīng)典名方半夏白術(shù)天麻湯的基礎(chǔ)上加減而成。主要由半夏、天麻、茯苓、白術(shù)、膽南星、天竺黃、香附、丹參、酒大黃組成。半夏、天麻為君藥，半夏可和胃降逆，使氣順則痰消，為治痰之要藥;天麻祛風止痛。茯苓、白術(shù)二者為臣藥，茯苓健脾利濕，白術(shù)健脾燥濕，相配可使脾旺健運、濕去痰消。膽南星有清熱化痰、熄風定驚之功效;天竺黃清熱豁痰、涼心定驚;香附乃氣病之主藥，治血者必先行氣，治痰必理氣，氣順瘀自化，血行痰自消;丹參活血化瘀;大黃有攻積滯、清濕熱、瀉火、涼血、祛瘀、解毒等功效，以上均為佐藥。全方共奏熄風化痰、活血通絡(luò)之功效，切中中風病“痰、瘀”的病機。半夏白術(shù)天麻湯出自《醫(yī)學(xué)心悟·眩暈》，主治濕痰壅遏的頭眩眼花等癥。半夏白術(shù)天麻湯之化痰通絡(luò)湯載于2017年版中華中醫(yī)藥學(xué)會頒布的《中風?。X梗死）中醫(yī)診療方案》[1]及《中醫(yī)內(nèi)科學(xué)》[2]規(guī)劃教材中，具有化痰通絡(luò)熄風之功，對治療腦梗死風痰阻絡(luò)證具有良好的療效。方中藥物配伍得當，可用于缺血性中風急性期和恢復(fù)期的治療。

腦和腸在生理、病理上密切聯(lián)系，“腦病腸治”理論指導(dǎo)中風治療是中醫(yī)整體觀念和“上病下治”治則的重要體現(xiàn)。課題組前期研究表明，化痰通絡(luò)湯能減少腦缺血/再灌注（ischemia/reperfusion， I/R）大鼠腦組織和胃腸道黏膜損傷，減輕神經(jīng)功能缺損癥狀，提高胃腸道動力、改善腸道屏障功能、減少腸道細菌代謝產(chǎn)物和毒物的釋放，從而發(fā)揮對腦缺血再灌注后“腸-腦”軸損傷的保護作用[3]。劉東坡[4]研究顯示，化痰通絡(luò)湯治療腦梗死伴頸動脈粥樣硬化臨床療效顯著，能夠明顯降低動脈粥樣硬化斑塊總積分與斑塊面積，并顯著降低斑塊不穩(wěn)定標志物基質(zhì)金屬蛋白酶9，升高基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1，改善患者臨床癥狀，從而發(fā)揮腦保護的作用。姚欣艷等[5]總結(jié)了20余年的臨床經(jīng)驗，采用化痰通絡(luò)湯治療缺血性腦卒中效果顯著，研究顯示化痰通絡(luò)湯對大腦中動脈阻塞（middle cerebral artery obstruction， MCAO）大鼠的腦保護作用可能是通過抗炎癥反應(yīng)來實現(xiàn)的。大量研究表明，組成化痰通絡(luò)湯中的藥物法半夏、大黃、白術(shù)、丹參等具有改善胃腸道功能、抑制腸道菌群移位、減少炎性因子釋放等作用[6-9]。王海僑等[10]觀察到化痰通絡(luò)湯能夠有效改善痰瘀痹阻型急性腦梗死患者腦血管血流動力學(xué)指標，從而改善患者腦部循環(huán)，減少神經(jīng)組織的損傷。

推測化痰通絡(luò)湯對腦I/R大鼠“腸-腦”軸的干預(yù)作用，可能是通過調(diào)節(jié)腦缺血后腸道菌群來實現(xiàn)的。因此，本研究以腦I/R損傷大鼠模型，研究化痰通絡(luò)湯對腦I/R后大鼠腸道菌群的影響，從而揭示化痰通絡(luò)湯“腦病腸治”的科學(xué)內(nèi)涵，并為其臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1? 動物

雄性健康SD大鼠，SPF級，體質(zhì)量220～250 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物合格證號：SCXK（湘）2019-0004，飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)SPF級動物實驗中心，室溫22～26 ℃，濕度50%～65%，實驗前適應(yīng)性喂養(yǎng)3～5 d，給藥前禁食12 h，自由飲水。實驗單位使用許可證號：SYXK（湘）2019-0009。符合湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會實驗倫理學(xué)要求，倫理審批號：LL2019100902。

1.2? 藥物

化痰通絡(luò)湯組方藥材法半夏20 g、天竺黃10 g（亳州市滬譙藥業(yè)有限公司，批號分別為1905160252、1904030462）;茯苓20 g、天麻20 g、白術(shù)15 g、丹參30 g（湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，批號分別是PR19070801、YP19070502、CK19061604、HY19052201）;膽南星10 g（四川百勝藥業(yè)有限公司，批號：180906），香附10 g、大黃15 g（湖南三湘中藥飲片有限公司，批號分別為2019050401、2018102901），均購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院門診藥房，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)左亞杰教授鑒定為正品，符合《中華人民共和國藥典》規(guī)范[11]。依達拉奉注射液（福建天泉藥業(yè)股份有限公司，批號：1910142）。

1.3? 試劑

強化梭酸培養(yǎng)基、氧氣指示劑均購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司（批號分別為20200619、20200703）;氯化三苯四氮唑（triphenyl tetrazolium chloride， TTC）購自美國Sigma公司（批號：T8877-10G）;丁酸梭菌（北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院，批號：BNCC337239）。

1.4? 儀器

日本三菱MGC厭氧培養(yǎng)罐（北京緣生化科技有限公司，型號：C-32）;麥氏比濁管（美國Pro-Lab診斷公司，型號：2350）;生物安全柜（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司，型號：BSC-1300 II A2）;比濁儀（英國Grant儀器有限公司，型號：DEN-1）;二氧化碳培養(yǎng)箱（賽默飛世爾科技有限公司，型號：3111）;超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司，型號：SW-CJ-1FD）;Illumina Miseq 測序儀（美國Illumina公司，型號：PE300）。

2 方法

2.1? 化痰通絡(luò)湯的制備

同前期實驗，設(shè)定化高劑量痰通絡(luò)湯、中劑量化痰通絡(luò)湯、低劑量化痰通絡(luò)湯（28.66、14.33、7.16 g/kg），并制備成水提物[3]。將上述中藥飲片以8倍量水浸泡30 min，加熱至沸騰并保持微沸30 min，然后過濾取藥液;殘渣再加6倍量水，加熱至沸騰并保持微沸30 min，過濾取藥液。合并2次藥液，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮至所需生藥質(zhì)量濃度為2.28 g/mL，作為高劑量灌胃濃度;中劑量在高劑量濃度基礎(chǔ)上稀釋為1.14 g/mL，低劑量在中劑量基礎(chǔ)上再稀釋為0.57 g/mL。置于4 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2? 液體培養(yǎng)基和種子液制備[12]

首先，稱取強化梭酸培養(yǎng)基38.0 g，加入蒸餾水800 mL，加熱混勻，再加水定容至1 L并平均分裝至3個錐形瓶，滅菌30 min（121 ℃，0.1 MPa），冷卻后備用。然后，取適量丁酸梭菌接種于上述培養(yǎng)基中，于CO2培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)24～48 h，采用麥氏比濁法測定菌液濁度計算濃度，待菌液濃度達到5.0×108 cfu/mL，以用于實驗。

2.3? 大鼠MCAO再灌注模型制作

依據(jù)前期方法[13]制作MCAO局灶性腦缺血模型。大鼠于頸前正中位置備皮、消毒，切開3 cm左右，鈍性分離右側(cè)頸總動脈（common carotid arteries，CCA）、頸內(nèi)動脈（internal carotid artery， ICA）、頸外動脈（external carotid artery， ECA），用手術(shù)線分別結(jié)扎ECA的遠心端并于結(jié)扎點近側(cè)凝斷ECA及其分支，對ICA遠心端進行結(jié)扎，動脈夾夾閉ICA遠心端與CCA，用尼龍線線栓從ECA經(jīng)CCA與ICA分叉部插入ICA，松開ICA上的動脈夾，將線栓插入ICA顱內(nèi)段，插入長度為（18±2） mm，到達大腦中動脈環(huán)，扎住ICA內(nèi)的線栓防止出血和線栓移動。阻斷2 h后，拔出線栓進行再灌注24 h。再灌注2 h后，采用改良的神經(jīng)功能缺損評分方法進行評分，1～3分表示造膜成功[14]。假手術(shù)組僅將CCA、ECA、ICA游離出來，不阻斷血流，其他操作同模型組。

2.4? 動物分組與給藥

將30只大鼠隨機分成假手術(shù)組、模型組、化痰通絡(luò)湯高劑量組、化痰通絡(luò)湯中劑量組﹑化痰通絡(luò)湯低劑量組（28.66、14.33、7.16 g/kg）、陽性對照組[12]（依達拉奉4 g/kg+丁酸梭菌5.0×108 cfu/mL），每組5只。各給藥組于造模前2 h開始灌胃給藥，每次給藥間隔12 h。假手術(shù)組與模型組予等量生理鹽水灌胃，同時腹腔注射等量生理鹽水?；低ńj(luò)湯各劑量組灌胃不同劑量化痰通絡(luò)湯藥液，同時腹腔注射生理鹽水。陽性藥物組予丁酸梭菌液（5.0×108 cfu/mL）灌胃，0.7 mL/次，每日2次[12];同時腹腔注射依達拉奉（4 mg/kg）[15]，每日1次。各組大鼠術(shù)后繼續(xù)同前給藥。

2.5? TTC法測定腦梗死率

于缺血 2 h 再灌注 24 h 后，戊巴比妥鈉麻醉大鼠，斷頭取腦，去除腦干和小腦，將鼠腦于-20 ℃冰箱中速凍約15 min后，置入腦切片槽，作2 mm厚的連續(xù)冠狀切片。將切片立即置于2% TTC中，避光37 ℃染色30 min，然后用4%多聚甲醛固定24 h，拍照。正常腦組織染色為紅色，梗死灶為白色。用Image-pro plus 5.1圖像分析軟件測量各腦片腦梗死面積[3]。

V=t（A1+A2+…+An）

腦梗死率=梗死區(qū)體積/正常側(cè)大腦半球體積×100%

其中，t為切片厚度，A為梗死面積，n為腦片數(shù)。

2.6? 腸內(nèi)容物DNA抽提和PCR擴增

缺血2 h再灌注24 h后，麻醉大鼠取結(jié)腸內(nèi)容物置于凍存管，液氮速凍，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。根?jù)DNA抽提說明書進行大鼠結(jié)腸內(nèi)容物微生物群落總DNA抽提，使用338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）對16SrRNA基因V3～V4可變區(qū)進行PCR擴增，每個樣本重復(fù)3次[16]。

2.7? Illumina Miseq測序

將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，利用DNA凝膠回收純化試劑盒進行回收產(chǎn)物純化，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用熒光定量儀對回收產(chǎn)物進行檢測定量。建庫后，進行測序（上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司）。

2.8? 統(tǒng)計學(xué)分析

使用fastp軟件（https：//github.com/OpenGene/fastp，v 0.20.0）對原始測序序列進行質(zhì)量控制，使用FLASH軟件（http：//www.cbcb.umd.edu/software/flash，version 1.2.7）進行拼接，對每條序列進行物種分類注釋，比對Silva 16S rRNA數(shù)據(jù)庫（v 138），設(shè)置比對閾值為70%。

本實驗數(shù)據(jù)均用“x±s”表示，多組樣本間采用Kruskal-Wallis H檢驗。以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1? 化痰通絡(luò)湯對缺血再灌注后腦梗死體積的影響

假手術(shù)組無梗死灶形成，腦梗死率為0。與假手術(shù)組比較，模型組出現(xiàn)明顯梗死灶，腦梗死率顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，各藥物組梗死體積均明顯減少，腦梗死率顯著下降（P<0.05，P<0.01）?；低ńj(luò)湯高劑量組降低腦梗死率的作用顯著優(yōu)于化痰通絡(luò)湯中劑量組、化痰通絡(luò)湯低劑量組（P<0.05，P<0.01）。詳見圖1—2。

3.2? 各組大鼠腸道菌群物種注釋與評估

6組共收集30個結(jié)腸內(nèi)容物樣品（每組5個樣品）全部建庫合格，共獲得951 766 816個原始堿基數(shù)目，經(jīng)過濾嚴格處理得到1 581 008條高質(zhì)量優(yōu)化序列數(shù)目，序列平均長度為424 bp，序列長度分布在401～440 bp內(nèi)，以97%相似度聚類，共獲得864個OUT，歸屬于13個門、196個屬。

物種分布均勻Pan/Core物種分析用于描述隨著樣本量增加物種總量和核心物種量變化的情況。Pan物種，即泛物種，是所有樣本包含的物種總和，用于觀測隨著樣本數(shù)目增加，總物種數(shù)目的增加情況。Pan物種分析結(jié)果可解釋樣本包含的物種總和，說明本次測序樣本量足夠。詳見圖3a。Core物種，即核心物種，是所有樣本共有物種數(shù)目，用于觀測隨著樣本數(shù)目增加，共有物種數(shù)目的減少情況。Core物種分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)各組總數(shù)目增加，共有物種減少的趨勢趨于平坦，表明各組樣本量滿足評估物種豐度和核心物種數(shù)的要求。詳見圖3b。Shannon曲線主要用來評價菌群多樣性，Shannon值越大說明樣品的物種多樣性越高，本研究各組曲線趨于平坦，表明各組樣本微生物多樣性滿足測序要求。詳見圖3c。Anosim用來檢驗組間的差異是否顯著大于組內(nèi)差異，如圖所示，證實6組之間的組間差異是顯著大于組內(nèi)差異的（P<0.01），表明分組有意義。詳見圖3d。

3.3? Alpha多樣性分析

Alpha多樣性分析反映微生物群落的豐富度和多樣性。常用的Alpha多樣性指數(shù)包括Sobs指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、Ace指數(shù)、Chao指數(shù)等。如表1所示，與假手術(shù)組比較，模型組Sobs指數(shù)、Ace指數(shù)、Chao指數(shù)、Shannon指數(shù)降低（P<0.05），Simpson指數(shù)增高（P<0.05）。說明腦I/R后，大鼠腸道菌群的多樣性和豐富度均顯著下降。與模型組比較，化痰通絡(luò)湯中、高劑量組、陽性對照組Sobs指數(shù)、Ace指數(shù)和Chao指數(shù)增高（P<0.05），說明化痰通絡(luò)湯、丁酸梭菌+依達拉奉有助于提升腦I/R后大鼠腸道菌群的豐富度。同時，化痰通絡(luò)湯中、高劑量組Simpson指數(shù)降低、Shannon指數(shù)增高（P<0.05），說明中、高劑量化痰通絡(luò)湯也可以提升腦I/R大鼠腸道菌群的多樣性。陽性對照組與模型組比較，Simpson指數(shù)降低、Shannon指數(shù)增高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）?；低ńj(luò)湯低劑量組雖然上述各指標的變化趨勢與化痰通絡(luò)湯中、高劑量組一致，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。各給藥組之間比較，化痰通絡(luò)湯高劑量組與化痰通絡(luò)湯低劑量組、陽性對照組相比，Sobs指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、Chao指數(shù)顯著升高（P<0.05），說明高劑量的化痰通絡(luò)湯對改善腦I/R后大鼠腸道菌群的豐富度和多樣性的效果最好。詳見表1。

3.4? Beta多樣性分析

主成分分析（principal component analysis， PCA），通過分析不同樣本菌落組成可以反映樣本間的差異和距離，樣本物種組成越相似，反映在PCA圖中的距離越近。主成分1（principal component， PC1）貢獻度為80.11%，主成分2（principal component， PC2）貢獻度為13.69%，二者貢獻度之和為93.8%，故二者能全面地反映群落組成信息?；赑CA分析結(jié)果，將不同分組樣本在PC1軸上作箱線圖。不同分組樣本的中位值較近，表明樣本物種組成較相近。模型組與假手術(shù)組距離較遠，而假手術(shù)組與化痰通絡(luò)湯中、高劑量組距離非常接近，說明MACO大鼠腸道菌群組成發(fā)生改變，而化痰通絡(luò)湯中、高劑量具有不同程度調(diào)節(jié)腦I/R大鼠腸道菌群組成的作用。詳見圖4。

3.5? 物種分布

大鼠腸道菌群優(yōu)勢菌群主要是厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes）3大菌門。在門水平上結(jié)果見圖5。各組大鼠腸道菌群在門水平不同的群落豐度有顯著性差異，與假手術(shù)組比較，模型組擬桿菌門、放線桿菌門（Actinobacteriota）、脫硫弧菌門（Desulfobacterota）豐度顯著降低（P<0.05，P<0.01）;與模型組比較，化痰通絡(luò)湯高劑量組擬桿菌門群落、脫硫菌門群落豐度升高（P<0.05），化痰通絡(luò)湯中劑量組放線桿菌門群落、脫硫菌門群落豐度升高（P<0.05），且化痰通絡(luò)湯高劑量組擬桿菌門群落豐度升高顯著優(yōu)于化痰通絡(luò)湯低、中劑量組和陽性對照組（P<0.05）。詳見表2。

在屬水平上的分布，各組大鼠腸道菌群優(yōu)勢菌屬構(gòu)成如圖6所示。各組大鼠腸道菌群在屬水平的優(yōu)勢物種主要有14種，以群落相對豐度>0.023為篩選條件[7]，其中在志賀菌屬（Escherichia-shigella）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）、norank_f_Muribaculaceae、杜氏桿菌屬（Dubosiella）、擬普雷沃菌屬（Alloprevotella）、紅蝽菌屬_UCG-002（Coriobacteriaceae_UCG-

002）、普雷沃菌屬（Prevotella）群落豐度具有顯著性差異（P<0.05，P<0.01）。詳見圖6。與假手術(shù)組比較，模型組雙歧桿菌屬、norank_f_Muribaculaceae、杜氏桿菌屬、紅蝽菌屬_UCG-002群落相對豐度顯著降低（P<0.05，P<0.01），表明腦缺血再灌注后大鼠上述腸道菌群在屬水平發(fā)生明顯變化;與模型組比較，化痰通絡(luò)湯中劑量組雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）、norank_f_Muribaculaceae、杜氏桿菌屬（Dubosiella）、紅蝽菌屬_UCG-002（Coriobacteriaceae_UCG-002）、普雷沃菌屬（Prevotella）群落相對豐度顯著升高（P<0.05，P<0.01），化痰通絡(luò)湯高劑量組norank_f_Muribaculaceae、擬普雷沃菌屬（Alloprevotella）、紅蝽菌屬_UCG-002（Coriobacteriaceae_UCG-002）、普雷沃菌屬（Prevotella）群落豐度具有顯著升高（P<0.05），陽性對照組norank_f_Muribaculaceae、杜氏桿菌屬（Dubosiella）、紅蝽菌屬_UCG-002（Coriobacteriaceae_UCG-002）群落豐度顯著升高（P<0.05），而化痰通絡(luò)湯低劑量組腸道菌群各菌落間相對豐度比較，差異無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）?；低ńj(luò)湯不同劑量組間比較，化痰通絡(luò)湯中劑量組雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）群落豐度顯著高于化痰通絡(luò)湯高劑量組（P<0.05），杜氏桿菌屬（Dubosiella）、紅蝽菌屬_UCG-002顯著高于低劑量組（P<0.05）;化痰通絡(luò)湯高劑量組norank_f_Muribaculaceae顯著高于化痰通絡(luò)湯低劑量組（P<0.05）。說明不同劑量的化痰通絡(luò)湯能調(diào)節(jié)不同的優(yōu)勢菌群，增加益生菌的豐度。詳見表3。

3.6? LEfSe多級物種差異判別分析

LEfSe分析根據(jù)分類學(xué)組成對樣本按照不同的分組條件進行線性判別分析（linear discriminant analysis， LDA），運用LDA估計這些差異物種對組間區(qū)別的影響大小。LDA值大于設(shè)定值的物種（morestrict設(shè)為4，指只有物種在多組中都存在差異），才能被認為是組間具有統(tǒng)計學(xué)差異的標記物。本研究發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組腸道菌群的優(yōu)勢物種為梭菌綱（Clostridia）、放線桿菌門、放線菌綱（Actinobacteria）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）、雙歧桿菌科（Bifidobacteriaceae）、雙歧桿菌目（Bifidobacteriales）、毛螺菌目（Lachnospirales）、毛螺菌科（Lachnospiraceae）、消化鏈球菌目（Peptostreptococcales-Tissierellales）、紅蝽菌目（Coriobacteriales）、紅蝽菌綱（Coriobacteriia）、Eggerthellaceae、Adlercreutzia;化痰通絡(luò)湯中劑量組優(yōu)勢物種為丹毒絲科（Erysipelotrichaceae）、丹毒絲目（Erysipelotrichales）、杜氏桿菌屬;化痰通絡(luò)湯高劑量組優(yōu)勢物種為擬桿菌綱（Bacteroidia）、擬桿菌門（Bacteroidota）、擬桿菌目瘤胃球菌科（Ruminococcaceae）?；低ńj(luò)湯低劑量組和陽性對照組組間物種差異不明顯（LDA值<3.5）。詳見圖7。

4 討論

腸道菌群與腦卒中[17]、心腦血管疾病[18]、孤獨癥[19]、阿爾茨海默病[20]等疾病密切相關(guān)，對腸道菌群的研究已成為許多腦部疾病防控的新方向。“腸-腦”是中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system， CNS）與胃腸道功能相互作用的雙向調(diào)節(jié)軸，由CNS、自主神經(jīng)系統(tǒng)、下丘腦-垂體-腎上腺軸、腸神經(jīng)系統(tǒng)等組成一個神經(jīng)-內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)[21]。近年研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群可通過“腸-腦”軸與大腦實現(xiàn)相互影響，腸道菌群和“腸-腦”軸不僅能分別對胃腸道發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，他們也通過神經(jīng)-免疫-內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)相互作用，協(xié)同發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，稱為“菌群-腸-腦”軸[22]。腸道菌群作為“菌群-腸-腦”軸的核心，是腦、腸相互調(diào)控的重要媒介，可直接作用于大腦影響CNS功能。腸道菌群還可通過影響高血壓、糖尿病、肥胖、高脂血癥等危險因素，進而影響卒中的發(fā)病[23]。BENAKIS等[24]證明腸道菌群被抑制后顯著降低腦梗死體積，其作用機制依賴于調(diào)節(jié)性T細胞增加和IL-17陽性γδT細胞的降低，揭示了“腸-腦”軸及腦缺血與腸道菌群的相關(guān)性，為腦缺血的治療提供了新的思路。

本研究結(jié)果顯示，腦I/R后，大鼠出現(xiàn)腦梗死病灶，化痰通絡(luò)湯高劑量組、化痰通絡(luò)湯中劑量組、化痰通絡(luò)湯低劑量組可以減少腦梗死體積，效應(yīng)具有劑量依賴性。表明化痰通絡(luò)湯可以減輕腦I/R后腦組織的損傷。

人體腸道菌群主要由厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門、放線菌門、梭桿菌門、疣微菌門、螺旋體菌門等組成，其中厚壁菌門和擬桿菌門占整個腸道菌群的80%以上，厚壁菌門與擬桿菌門之比是反映腸道菌群失調(diào)的重要指標[25]。正常情況下，腸道菌群與機體是互利共生的穩(wěn)態(tài)關(guān)系，但當正常腸道菌群的組成發(fā)生改變時，就會引起機體生理功能改變甚至導(dǎo)致病變，反之，機體的某些病變也會引發(fā)腸道菌群的變化[26-28]。研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群失調(diào)會對腦缺血模型小鼠轉(zhuǎn)歸產(chǎn)生不良影響[29]。腦卒中后腸道微生物群的組成改變，胃腸道蠕動減弱導(dǎo)致有害代謝產(chǎn)物的局部積累，炎癥反應(yīng)亢進，均能引起腸道通透性增加，影響腸道屏障功能，最終造成腸道黏膜受損，增加了消化道潰瘍、出血的發(fā)生率[30]。HOULDEN等[31]觀察到，缺血性腦損傷可在72 h內(nèi)引起小鼠盲腸腸道菌群失調(diào)，隨著梗死范圍的擴大，消化道球菌科細菌數(shù)量增多，擬桿菌門中的普雷沃菌科細菌數(shù)目減少。

本研究Alpha多樣性分析顯示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腸道菌群的豐富度和多樣性顯著下降，表明腦I/R后，存在腸道菌群的失調(diào)?；低ńj(luò)湯低、中、高劑量組均能提升腦I/R后大鼠腸道菌群的豐富度和多樣性，以化痰通絡(luò)湯高劑量組效果最為顯著。Beta多樣性分析顯示，模型組大鼠腸道菌群組成結(jié)構(gòu)與假手術(shù)組距離較遠，而化痰通絡(luò)湯中、高劑量組與假手術(shù)組距離接近，表明腦I/R可以影響正常小鼠腸道菌群的組成和結(jié)構(gòu)，化痰通絡(luò)湯能使之趨向正常。

研究表明，“菌群-腸-腦”軸對微生物及代謝產(chǎn)物的調(diào)控能夠有效改善和預(yù)防神經(jīng)精神疾病，腸道菌群代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸直接或間接對阿爾茨海默病、帕金森病以及孤獨癥等神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)揮作用[32]。擬桿菌類、雙歧桿菌類、消化鏈球菌類、梭菌類、瘤胃球菌類細菌可以代謝產(chǎn)生短鏈脂肪酸（主要包括乙酸、丙酸、丁酸），腸道內(nèi)游離的短鏈脂肪酸可以通過單羧酸轉(zhuǎn)運蛋白穿過血腦屏障[33]，進入大腦調(diào)節(jié)神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細胞的功能[34-35]。研究表明，小鼠補充丁酸可以促進腦內(nèi)海馬神經(jīng)的再生，短鏈脂肪酸水平與中風嚴重程度和預(yù)后恢復(fù)水平呈負相關(guān);norank_f_Muribaculaceae、杜氏桿菌屬于擬桿菌門，擬桿菌是整個腸道的重要菌群之一;顫螺旋菌與健康呈正相關(guān)，在炎癥疾病中豐度降低;普雷沃菌可能在多發(fā)性硬化癥患者中有潛在的治療作用，發(fā)揮“益生菌”的作用;丹毒絲菌也可產(chǎn)生短鏈脂肪酸，參與腸道物質(zhì)和能量的代謝[36-37]。

本研究結(jié)果表明，在門水平上，與假手術(shù)組相比，模型組擬桿菌門、放線桿菌門（Actinobacteriota）、脫硫弧菌門（Desulfobacterota）豐度顯著降低（P<0.05，P<0.01）?；低ńj(luò)湯高、中劑量組能不同程度升高擬桿菌門、放線桿菌門及脫硫菌門群落豐度，表明化痰通絡(luò)湯可以調(diào)節(jié)缺血性腦卒中后的腸道菌群失調(diào)，促進優(yōu)勢菌群的恢復(fù)。在屬水平上，主要的優(yōu)勢物種有14種，其中7種具有顯著性差異?；低ńj(luò)湯中劑量組能顯著升高腸道雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）、norank_f_Muribaculaceae、杜氏桿菌屬（Dubosiella）、紅蝽菌屬_UCG-002（Coriobacteriaceae_

UCG-002）、普雷沃菌屬（Prevotella）群落相對豐度，化痰通絡(luò)湯高劑量組能顯著升高norank_f_Muribaculaceae、擬普雷沃菌屬（Alloprevotella）、紅蝽菌屬_

UCG-002（Coriobacteriaceae_UCG-002）、普雷沃菌屬（Prevotella）群落豐度。且化痰通絡(luò)湯中劑量組升高雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）屬群落豐度的效應(yīng)顯著優(yōu)于化痰通絡(luò)湯高劑量組（P<0.05），升高杜氏桿菌屬（Dubosiella）、紅蝽菌屬_UCG-002的效應(yīng)顯著優(yōu)于化痰通絡(luò)湯低劑量組（P<0.05）;化痰通絡(luò)湯高劑量組升高norank_f_Muribaculaceae的效應(yīng)顯著優(yōu)于化痰通絡(luò)湯低劑量組（P<0.05）。說明化痰通絡(luò)湯能調(diào)節(jié)腦I/R腸道的優(yōu)勢菌群，且不同劑量調(diào)節(jié)的優(yōu)勢菌群不同。

LEfSe分析結(jié)果顯示，化痰通絡(luò)湯高劑量組優(yōu)勢菌種為擬桿菌綱、擬桿菌門、擬桿菌目、鼠桿菌科、norank_f_Muribaculaceae、普雷沃菌科、顫螺旋菌目、顫螺旋菌科、普雷沃菌屬、瘤胃球菌科，化痰通絡(luò)湯中劑量組優(yōu)勢菌為丹毒絲科、丹毒絲目、杜氏桿菌屬，說明中、高劑量的化痰通絡(luò)湯可能通過上調(diào)大鼠腦I/R后腸道產(chǎn)短鏈脂肪酸類和減輕炎性反應(yīng)的菌種含量、調(diào)整腸道菌群的結(jié)構(gòu)，從而改善代謝途徑、減少炎癥因子的釋放，對缺血腦組織產(chǎn)生保護作用。

綜上所述，腦缺血再灌注后，大鼠出現(xiàn)腦組織損傷，同時腸道菌群的種類和豐度發(fā)生顯著改變?；低ńj(luò)湯能通過調(diào)整和改善大鼠腸道菌群的組成結(jié)構(gòu)，恢復(fù)大鼠“菌群-腸-腦”軸的平衡，減輕腦組織缺血性損傷。其機制可能與恢復(fù)腸道菌群的多樣性和豐度，調(diào)節(jié)腸道益生菌有關(guān)，但由于腸道微生物菌群的復(fù)雜性，腦-腸相互作用的具體機制尚不清楚，尚待進一步研究。

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