咖啡酸國家一級純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制*

蘇斌,張寶喜,畢研才,龔寧波,楊世穎,張麗,呂揚(yáng),杜冠華

(1.山東濟(jì)世藥業(yè)有限公司質(zhì)量部,濟(jì)南 271100;2.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院·中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所晶型藥物研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100050;3.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院·中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所藥物靶點(diǎn)研究與新藥篩選北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100050)

咖啡酸屬酚酸類化合物,廣泛存在于多種中藥材植物中,如一枝黃、杜仲、薄荷、蒲公英等。研究發(fā)現(xiàn),咖啡酸具有廣泛的藥理活性,如抗菌、抗病毒、抗炎、抗氧化、抗癌等作用,近年來又逐漸發(fā)現(xiàn)其在糖尿病腎病、心肌細(xì)胞保護(hù)、免疫系統(tǒng)疾病等方面具有較好活性[1-5]。鑒于咖啡酸化學(xué)成分存在于多種中藥材中,《中華人民共和國藥典》將其列為冬葵果等中藥材質(zhì)量評價(jià)的有效或指標(biāo)成分,在冬葵果、杠板歸、牽牛子等多種中藥材的鑒別檢查中亦作為對照品使用[6]。因此,研究咖啡酸純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對于我國中藥相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量控制具有重要的科學(xué)意義。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是具有可溯源性和準(zhǔn)確量值的測量標(biāo)準(zhǔn),其基本功能是可以復(fù)現(xiàn)、保存與傳遞量值,保證在不同時(shí)間與空間中量值的可比性與一致性。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的特性量值是作為分析測量中的“量具”和“標(biāo)準(zhǔn)”,在校準(zhǔn)儀器、評價(jià)方法、確定材料成分、考核人員水平以及生產(chǎn)過程中的質(zhì)量控制方面起著重要的標(biāo)準(zhǔn)的作用[7-8]。2005年國際標(biāo)準(zhǔn)化組織/標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)委員會(ISO/REMCO)對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、基準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)賦予了新的定義[9-10]。

我們根據(jù)中華人民共和國計(jì)量法、一級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制技術(shù)規(guī)范(JJF 1006-1994)、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)管理辦法與《中華人民共和國藥典》等相關(guān)技術(shù)文件[11-14],研制了咖啡酸化學(xué)純度有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),具有溯源性和量值傳遞功能,可應(yīng)用于相關(guān)化學(xué)藥品、中藥產(chǎn)品、保健品的質(zhì)量監(jiān)控,為實(shí)現(xiàn)我國準(zhǔn)確定量檢測藥品與相關(guān)物質(zhì)提供了標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)資源和物質(zhì)純度標(biāo)準(zhǔn)。

根據(jù)有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制要求,筆者在本實(shí)驗(yàn)完成了咖啡酸純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性檢驗(yàn)、短期穩(wěn)定性考察、長期穩(wěn)定性考察等系列研究,并采用質(zhì)量平衡法與庫侖滴定法兩種不同原理的檢測分析技術(shù),實(shí)現(xiàn)了對咖啡酸化學(xué)純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)聯(lián)合定值,建立了不同技術(shù)方法的不確定度評估數(shù)學(xué)模型,確保了標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值結(jié)果的科學(xué)性和準(zhǔn)確性。

1 儀器與試劑

1.1儀器 Agilent 1200 型高效液相色譜儀(配置:四元梯度泵,自動進(jìn)樣器,DAD檢測器,Agilent chemstation色譜工作站);庫侖滴定儀(自制,雙鉑電極,電流指示器);XS 105型分析用天平(METTLER TOLEDO公司,感量:0.01 mg);TU-1901 型雙光束紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)。研究使用的高效液相色譜儀、紫外分光光度計(jì)、分析用天平等儀器及玻璃器皿、移液槍等均經(jīng)國家計(jì)量院校準(zhǔn),庫侖滴定儀經(jīng)國家一級亞砷酸根溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(GBW 08666)校準(zhǔn)。

1.2試劑 乙腈(色譜純,Fisher Chemical);異丙醇(色譜純,Fisher Chemical);冰醋酸(分析純,北京化學(xué)試劑公司);溴化鉀(分析純,北京化學(xué)試劑公司);鹽酸(分析純,北京化學(xué)試劑公司);純水;流動相使用前均過孔徑0.2 μm微孔濾膜。

2 方法與結(jié)果

2.1高純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物制備 咖啡酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物原料由東北產(chǎn)地的蒲公英中藥材提取、分離、純化獲得。 采用四大光譜技術(shù)進(jìn)行咖啡酸純度標(biāo)準(zhǔn)候選物樣品進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證研究:UV(乙腈)λmax:320.5 nm、294.0 nm、239.0 nm、216.5 nm、191.5 nm;IR:3 431.7,3 231.7,3 025.0,2 830.4,2 563.9,1 644.7,1 619.4,1 600.7,1 530.7,1 449.6,1 374.7,1 352.0,1 326.1,1 296.1,1 280.0,1 217.7,1 174.3,1 120.3,974.8,968.6,935.4,900.2,871.9,849.7,816.8,801.7,779.9,736.6,699.1,647.8,603.0,576.0,458.6 cm-1;H-NMR(d6-DMSO):δppm:6.2(1H,d,J=15.9Hz,H-6),6.7(1H,d,J=8.2Hz,H-7),6.9(1H,dd,J=8.2Hz,J=1.85Hz,H-2),7.0(1H,d,J=1.85Hz,H-8),7.4(1H,d,J=15.85Hz,H-5),9.1(1H,s,H-1),9.5(1H,s,H-3),12.1(1H,s,O-H)。13C-NMR(d6-DMSO):δppm:114.6(C-1),115.1(C-6),115.7(C-7),121.1(C-5),125.7(C-2),144.6(C-4),145.5(C-3),148.1(C-8),167.9(C-9);ESI-MSm/z:181.0(M++1);以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[15],可確定標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物樣品為咖啡酸。

2.2定值方法的方法學(xué)研究 咖啡酸純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)采用質(zhì)量平衡法與庫侖滴定法2種不同原理的方法進(jìn)行聯(lián)合定值。其中質(zhì)量平衡法是首先采用高效液相色譜面積歸一化法,測定候選物中主成分含量,再扣除候選物中無紫外吸收的雜質(zhì)成分含量,從而獲得待測標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物的化學(xué)純度。

2.2.1高效液相色譜法研究

(1)色譜條件 色譜柱:Agilent Eclipse XDB C18(150 mm×4.6 mm,5 μm)。流動相:梯度洗脫,A相:0.5%冰醋酸溶液(含5%異丙醇);B相:乙腈。5%Bisocratic (9 min);5%～25%B linear(5% min-1,4 min);25%B isocratic(9 min);25%～5%B linear(5% min-1,4 min);5%B isocratic(9 min)。流速:1.0 mL·min-1,柱溫:35 ℃,進(jìn)樣量:10 μL。有關(guān)物質(zhì)檢測濃度:500 μg·mL-1。記錄色譜圖及峰面積,利用Agilent Chemstation色譜工作站處理數(shù)據(jù),采用面積歸一化法進(jìn)行純度測定。

(2)線性范圍 精密稱取咖啡酸純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品25.0 mg,10%乙腈溶解并定容至25 mL量瓶,搖勻,配制成濃度為1 000 μg· mL-1的儲備液。分別精密量取儲備液0.1,0.5,1.0,2.5,5.0,7.0 mL,用10%乙腈定容至10 mL容量瓶中,配制成系列濃度分別為10.0,50.0,100.0,250.0,500.0,700.0 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別精密度量取各濃度溶液10 μL注入液相色譜儀,記錄色譜圖及峰面積。按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析。以樣品濃度(X,μg·mL-1)為橫坐標(biāo),以峰面積(Y)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,回歸線性方程為Y=32.556X+33.788,相關(guān)系數(shù)R2=0.999 9(n=6)。結(jié)果表明,在10.0～700.3 μg·mL-1濃度范圍內(nèi),咖啡酸峰面積與濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

(3)儀器精密度 精密稱取咖啡酸純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)12.5 mg,加10%乙腈溶解,并定容至25 mL量瓶中,配制成濃度為500.0 μg·mL-1的溶液,搖勻,備用。精密量取溶液10 μL注入液相色譜儀,重復(fù)進(jìn)樣6次。計(jì)算6次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均峰面積RSD值為0.04%,<2.0%,表明利用高效液相色譜法測定咖啡酸純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的檢測分析儀器精密度良好。

(4)方法精密度 按“2.1.3”項(xiàng)下方法配制供試品,共6份。精密量溶液10 μL注入液相色譜儀,重復(fù)進(jìn)樣3次。計(jì)算獲得6份樣品平均峰面積的RSD值為0.15%,<2.0%,表明利用高效液相色譜法測定咖啡酸純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的檢測分析方法具有良好的精密度。

2.2.2庫侖滴定法

(1)反應(yīng)原理 電極材料:雙鉑電極;發(fā)生電極反應(yīng):2Br—=Br2+2e;電解電流:0.9872 mA;指示終點(diǎn):電流上升法,電流超過20 μA停止電解;電解質(zhì)組成:8N鹽酸：2M 溴化鉀：冰醋酸=1：1：2?？Х人岱肿恿繛?80.15。反應(yīng)原理見圖1。

(2)線性范圍 精密稱取10.28,12.43,14.11,16.91,18.31,20.91 mg,置于10 mL量瓶中,使用甲醇定容,待用。分別移取100 μL的供試溶液樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。利用咖啡酸樣品量與溴庫侖滴定反應(yīng)時(shí)間之間的定量關(guān)系進(jìn)行測定,記錄反應(yīng)時(shí)間。以咖啡酸純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的進(jìn)樣量為橫坐標(biāo),以平均反應(yīng)時(shí)間為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,回歸線性方程為:Y=1 078.8X+0.541 2,相關(guān)系數(shù)R2為0.999 8(n=6)。結(jié)果表明,在0.10～0.21 mg質(zhì)量范圍內(nèi),物質(zhì)進(jìn)樣量與反應(yīng)時(shí)間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

(3)儀器精密度 精密稱取15.01 mg,置于10 mL量瓶中,加入甲醇溶解并定容。進(jìn)樣體積為100 μL,重復(fù)測定6次,記錄反應(yīng)時(shí)間。計(jì)算6次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的的反應(yīng)時(shí)間的RSD值為0.42%,表明利用庫侖滴定法測定咖啡酸純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的檢測分析儀器精密度良好。

(4)方法精密度 按“2.2.3”項(xiàng)下方法配制供試品,共6份。進(jìn)樣量為100 μL,記錄反應(yīng)時(shí)間。計(jì)算相同重量的6份樣品的平均反應(yīng)時(shí)間的RSD為0.18%,<2.0%,表明采用庫侖滴定法咖啡酸純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的檢測分析方法具有良好的精密度。

2.3均勻性檢驗(yàn) 從500支咖啡酸純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)最小包裝中隨機(jī)數(shù)字表法抽取15 支樣品,每支平行取樣3 次,加10%乙腈配制成500 μg·mL-1的溶液,按照“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行均勻性檢驗(yàn),采用HPLC 面積歸一化法進(jìn)行測定,獲得45個(gè)均勻性檢驗(yàn)數(shù)據(jù),結(jié)果見表1。

表1 均勻性檢驗(yàn)測定結(jié)果

采用單因素方差分析對均勻性檢驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,F=1.76;查F檢驗(yàn)臨界值表知:F0.05(14,30)=2.04,F

表2 方差分析結(jié)果

2.4穩(wěn)定性考察

2.4.1短期穩(wěn)定性考察 對包裝后標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品進(jìn)行高溫實(shí)驗(yàn)(60 ℃)、高濕實(shí)驗(yàn)[(90±5)%,25 ℃]、光照實(shí)驗(yàn)[照度(4 500±500) lx],并分別于0,7,14 d對經(jīng)過高溫、高濕、光照后的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品進(jìn)行檢測,每個(gè)時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)抽樣3瓶樣品,每瓶進(jìn)3針,采用HPLC法檢測樣品純度,結(jié)果見表3。

表3 短期穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)特性量值的標(biāo)準(zhǔn)值未知時(shí),用平均值一致性檢驗(yàn)法評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性,公式表述為:

短期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,經(jīng)上述3種影響因素實(shí)驗(yàn)前后標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品的化學(xué)純度未發(fā)生變化,包裝標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品在短期不同環(huán)境條件下的穩(wěn)定性良好。

2.4.2長期穩(wěn)定性 將包裝后標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品放置在常溫下長期保存,并分別于0,1,2,4,6,12個(gè)月對取樣進(jìn)行純度檢測。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)抽樣6瓶樣品,按短期穩(wěn)定性考察方法檢測樣品純度。結(jié)果見表4。

表4 長期穩(wěn)定性研究數(shù)據(jù)

2.5標(biāo)準(zhǔn)值的確定

2.5.1質(zhì)量平衡法 按“2.1.3”項(xiàng)下方法配制供試品,共10份。按上述色譜條件進(jìn)行測定,記錄色譜峰面積,并計(jì)算其相對純度。檢測結(jié)果見表5和表6。采用HPLC面積歸一化法測定標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)主成分化學(xué)純度的計(jì)算數(shù)學(xué)模型為:WHPLC=100%×A化合物色譜峰面積/A總色譜峰面積,其中WHPLC表示化合物的相對純度,A化合物色譜峰面積表示測定被測化合物色譜峰面積值,A總色譜峰面積表示測量化合物加各雜質(zhì)成分的色譜峰面積之和。首先,對10 組測量純度數(shù)據(jù)進(jìn)行格拉布斯(Grubbs) 檢驗(yàn)以剔除可疑值,計(jì)算得G=1.585,查格拉布斯臨界值表知:G0.95(10)=2.176。因G

表5 咖啡酸主色譜峰面積結(jié)果

表6 總色譜峰面積

由表5的定值數(shù)據(jù)的化合物色譜峰面積確定咖啡酸純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)主成分的純度為99.53%。鑒于高效液相色譜面積歸一化法測定純度值的局限性,根據(jù)質(zhì)量平衡法原理,需要扣除樣品中在高效液相色譜檢定波長下不出峰的水分、熾灼殘?jiān)腿軇埩舻某煞趾?。分別采用干燥失重法、熾灼殘?jiān)?、氣相色譜法測定相關(guān)物質(zhì)的含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,樣品中水分含量為0.030%,熾灼殘?jiān)鼮?.053%,溶劑殘留為0.004%,合計(jì)0.087%。

最終可得咖啡酸純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度標(biāo)準(zhǔn)值為99.53%×(100%-0.087%)=99.44%。

2.5.2庫侖滴定法 按隨機(jī)數(shù)表抽取20支標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品,采用甲乙雙人獨(dú)立操作,精密稱取約15.00 mg,置于10 mL量瓶中,使用甲醇定容,待用。利用體積計(jì)算含咖啡酸樣品量,采用100 μL進(jìn)樣量進(jìn)行實(shí)驗(yàn),記錄反應(yīng)時(shí)間。庫侖滴定法的數(shù)學(xué)模型為:x=(W/W樣)×100% =[(Q×M)/(n×F)/(mV1/V2)]×100% =[(i×t×M)/(n×F)/(mV1/V2)]×rep×100%,式中W表示反應(yīng)物質(zhì)的量 (g);W樣表示反應(yīng)樣品進(jìn)樣量 (g);V1表示實(shí)驗(yàn)進(jìn)樣量體積 (μL);V2表示容量瓶體積 (μL);Q表示通過電極的電量(C);i表示電流(A);t表示時(shí)間(s);M表示反應(yīng)物質(zhì)分子量;n表示電子數(shù);F表示法拉第常數(shù) (96 486.57庫侖/當(dāng)量),測定結(jié)果見表7。對得到的20組咖啡酸化學(xué)純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度值采用格拉布斯檢驗(yàn)進(jìn)行可疑值的剔除,經(jīng)計(jì)算得G甲=1.576,G乙=1.504。查格拉布斯臨界值表知:G0.95(10)=2.176。因G值均小于G0.95(10),故無可疑值存在。2次獨(dú)立檢測數(shù)據(jù)的t檢驗(yàn)結(jié)果為0.12,小于臨界值2.10,表明兩次獨(dú)立檢測數(shù)據(jù)無顯著性差異。

表7 咖啡酸化學(xué)純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的庫侖滴定定值檢測結(jié)果

庫侖滴定法確定的咖啡酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的化學(xué)純度標(biāo)準(zhǔn)值為99.531%。

表8 咖啡酸純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)兩種原理方法定值結(jié)果

2.6不確定度評定

2.6.1定值引入的不確定度定度分量分別為:u(A主色譜峰)=3.344 1;u(A總色譜峰)=3.501 8。

由“5.1”項(xiàng)下測定結(jié)果可知,咖啡酸化學(xué)純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中的水分、無機(jī)雜質(zhì)與溶劑殘留的含量測定值均小于 0.1%,對定值結(jié)果影響較小,故由其引入的不確定度可以忽略不計(jì)。

計(jì)算質(zhì)量平衡法測量的合成不確定度0.002 93。

(2)庫侖滴定法定值測量引入的不確定度 由純度計(jì)算數(shù)學(xué)模型可知,庫侖滴定法引入的不確定度評定分量見表9。

表9 庫侖滴定法的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度評定分量

根據(jù)表7數(shù)據(jù)計(jì)算獲得由庫侖法試驗(yàn)引入的各種不確定度分量值,詳細(xì)結(jié)果見表9中相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度列數(shù)據(jù)。計(jì)算庫侖滴定法測量的合成不確定度1.83×10-3。

由表1計(jì)算獲得樣品均勻性引入不確定度值為2.23 ×10-9,因均勻性產(chǎn)生的不確定度較小,可以忽略。

2.6.3樣品穩(wěn)定性引入不確定度 根據(jù)樣品長期穩(wěn)定性考察數(shù)學(xué)模型,斜率的不確定度為:

由表4計(jì)算獲得樣品穩(wěn)定性引入的不確定度值St=12×Sa=3.348×10-5,由此值可知,因長期穩(wěn)定性產(chǎn)生的不確定度較小,可以忽略。

2.6.4合成不確定度計(jì)算

故總合成不確定度僅由定值方法不確定度引入,計(jì)算獲得總合成不確定度值為3.45×10-3。

2.6.5擴(kuò)展不確定度計(jì)算 數(shù)學(xué)模型為U=kuc(總),式中U表示擴(kuò)展不確定度;k表示包含因子;uc(總) 表示總合成不確定度。k取 2,置信水平P為95%,計(jì)算擴(kuò)展不確定度值為0.69%。

2.7定值結(jié)果及不確定度表示 咖啡酸純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度值為(99.5±0.7)%,k=2,P=0.95。

3 討論

論文首次采用2 種質(zhì)量平衡法和庫侖滴定法不同原理技術(shù)方法對咖啡酸純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行聯(lián)合定值研究,有效克服了僅采用單一原理技術(shù)方法定值帶來的分析方法缺陷和不足,使純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠,為藥品相關(guān)純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制提供了技術(shù)方法參考。

本文研制的咖啡酸純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)具有準(zhǔn)確的純度標(biāo)準(zhǔn)值和不確定度,在國內(nèi)外屬首次研制,并已經(jīng)獲得國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局批準(zhǔn)為國家一級計(jì)量有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),證書編號為GBW09529。該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)具備量值溯源和傳遞功能,不僅可用于相關(guān)中藥材、中成藥、提取物、藥物中間體等產(chǎn)品的質(zhì)量控制,還可用于儀器校準(zhǔn)、新方法確認(rèn)等研究,具有非常廣泛的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。