基于網(wǎng)絡(luò)藥理學探究當歸芍藥散入血成分治療原發(fā)性痛經(jīng)的有效性及機制*

趙藍青青,李哲,劉孜,李娜,李忠思,劉振華,熊輝

(1.承德醫(yī)學院河北省中藥研究與開發(fā)重點實驗室,承德 067000;2.承德醫(yī)學院省神經(jīng)損傷與修復重點實驗室,承德 067000;3.承德醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所,承德 067000;4.承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院藥學部,承德 067000)

當歸芍藥散最早見于《金匱要略》,由川芎、當歸、澤瀉、白術(shù)、芍藥、茯苓六味中藥組成[1],是中醫(yī)臨床治療痛經(jīng)的經(jīng)典名方。其藥理作用主要有改善內(nèi)分泌、抑制炎癥、調(diào)節(jié)平滑肌等,臨床中多用于治療原發(fā)性痛經(jīng)、慢性盆腔炎、老年癡呆癥、腎病綜合征等疾病[2]。諸多臨床應用表明,當歸芍藥散治療痛經(jīng)的療效明顯優(yōu)于布洛芬[3]、去氧孕烯炔雌醇[4]、阿司匹林[5]等西藥,且安全性高,未發(fā)現(xiàn)有明顯的毒副反應。當歸芍藥散作為多成分、多靶點共同發(fā)揮作用的中藥復方,治療原發(fā)性痛經(jīng)的藥效物質(zhì)及作用機制尚不完全明確。文獻[6-8]對當歸芍藥散進行了入血成分研究,發(fā)現(xiàn)茯苓酸、Z/E-丁烯基酞內(nèi)酯、澤瀉醇B、藁本內(nèi)酯、澤瀉醇A、洋川芎內(nèi)酯A、洋川芎內(nèi)酯I、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、阿魏酸及其代謝產(chǎn)物12個主要血中移行成分,為當歸芍藥散的作用機制研究奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。

中藥血清藥物化學研究表明,口服藥物發(fā)揮藥理作用必須依賴于進入血液循環(huán)的藥效物質(zhì)[9],因此,以入血成分詮釋作用機制,得出的結(jié)果更加客觀、嚴謹。本研究針對篩選出的當歸芍藥散12個入血成分,借助網(wǎng)絡(luò)藥理學與分子對接技術(shù),探究當歸芍藥散治療原發(fā)性痛經(jīng)的可能機制,并驗證當歸芍藥散的有效性。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1當歸芍藥散入血成分及潛在作用靶點篩選 在中國知網(wǎng)及PubMed數(shù)據(jù)庫進行2012—2022年當歸芍藥散組方入血成分的檢索。在PharmGkb、TTD及SwissTargetPrediction平臺查找其潛在作用靶標。

1.1.2原發(fā)性痛經(jīng)相關(guān)基因靶點篩選 采用OMIM(http://www.omim.org/)數(shù)據(jù)庫、GeneCards(https://www.genecards.org/)數(shù)據(jù)庫篩選并確定原發(fā)性痛經(jīng)的相關(guān)基因靶點,關(guān)鍵詞為“Primary Dysmenorrhea”。

1.1.3實驗動物 SPF級雌性SD大鼠40只,體質(zhì)量(200±20) g,購于北京華阜康生物科技股份有限公司,動物生產(chǎn)合格證號:SCXK(京)2019-0008。大鼠適應環(huán)境1周。所有實驗按照承德醫(yī)學院實驗動物中心福利和倫理原則操作。

1.1.4材料與設(shè)備 當歸飲片(批號:C25292012008)、川芎飲片(批號:C2472012004)、澤瀉飲片(批號:C386-20212002)、白術(shù)飲片(批號:C2242012003)、白芍飲片(批號:C2232012004)、茯苓飲片(批號:C045210-4001),均購于河北蓮花池藥業(yè)有限公司,由承德醫(yī)學院中藥研究所趙春穎教授鑒定為正品。苯甲酸雌二醇注射液(4 mg·L-1,批號:210214);縮宮素注射液(10 U·mL-1,批號:210201),均購于上海全宇生物科技動物藥業(yè)有限公司。布洛芬片(赤峰蒙欣藥業(yè)有限公司,批號:2102019)。HZT-A1000型電子天平(美國康州電子秤科技有限公司,感量:0.01 g)、星海旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(無錫市星海生化設(shè)備有限公司)、SOIENTZ-18N型冷凍干燥機(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

1.2方法

1.2.1入血成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 利用R語言得到12種入血成分及篩選所得的原發(fā)性痛經(jīng)疾病靶點的交集基因,通過Cytoscape3.6.1版軟件完成入血成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建,進行拓撲學分析。

1.2.2靶點生物過程與代謝通路分析 利用DAVID數(shù)據(jù)庫研究基因本體(Gene Ontology,GO)生物學過程和京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and gnomes,KEGG)信號通路分析,預測其治療原發(fā)性痛經(jīng)的主要機制,并將P值排序前二十的結(jié)果做氣泡圖進行可視化。

1.2.3分子對接 利用篩選出的復方關(guān)鍵成分和核心靶蛋白,采用AutoDock Vina 1.2.3版軟件進行分子對接,最后將結(jié)合活性較強的結(jié)果利用PyMOL 2.4版軟件繪制三維圖進行可視化展示。

1.2.4動物實驗評價當歸芍藥散治療原發(fā)性痛經(jīng)的有效性

①藥物制備 當歸芍藥散灌胃液:稱取飲片當歸3 g、川芎8 g、澤瀉8 g、茯苓4 g、白術(shù)4 g、芍藥16 g,粉碎至50目篩,置于1000 mL圓底燒瓶加入10倍量50%乙醇浸泡60 min,加熱回流2 h,藥液經(jīng)濾紙濾過;加入8倍量50%乙醇加熱回流1.5 h。合并2次濾液,再次過濾,減壓濃縮至無醇味,-40 ℃預凍后用冷凍干燥法制成疏松粉末,即當歸芍藥散凍干粉,以蒸餾水配置成濃度為0.33 g·mL-1的混懸液備用。布洛芬灌胃液:布洛芬片研至粉末狀,以0.5%羧甲基纖維素鈉溶液配置成濃度為0.005 4 g·mL-1的混懸液備用。

②原發(fā)性痛經(jīng)模型的復制 40只SD雌性大鼠按照隨機數(shù)字表法分為對照組、原發(fā)性痛經(jīng)模型組、陽性藥組和當歸芍藥散組4組,每組10只。

造模方法參考文獻[10],模型組、陽性藥組與當歸芍藥散組皮下注射苯甲酸雌二醇10 d(第1、第10天,1 mg·kg-1;第2—9 天,0.5 mg·kg-1),第10天給藥30 min后,給予縮宮素25 U·mL-1腹腔注射,對照組注射同等劑量的0.9%氯化鈉溶液。造模后大鼠出現(xiàn)扭體反應且次數(shù)顯著增多,即為模型復制成功。當歸芍藥散組以劑量10 mL·kg-1灌胃當歸芍藥散混懸液10 d,每天1次;陽性藥組以劑量10 mL·kg-1灌胃布洛芬混懸液10 d,每天1次;對照組及模型組灌胃給予純化水。末次給藥60 min后,各組大鼠充分麻醉暴露腹腔,收集子宮組織,以10%甲醛溶液固定。

③當歸芍藥散有效性評價 觀察并記錄各組大鼠注射縮宮素后30 min內(nèi)的扭體次數(shù)。造模及給藥期間對各組大鼠進行體質(zhì)量監(jiān)測,并觀察一般體征。

子宮組織置于10%甲醛溶液固定24 h以上,石蠟包埋,切片,蘇木精-伊紅(HE)染色,進行鏡檢觀察。

1.2.5統(tǒng)計學分析 采用SPSS 25.0版軟件進行數(shù)據(jù)分析,多組比較采用單因素方差分析,以GraphPad Prism 8.0作圖,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1入血成分與原發(fā)性痛經(jīng)靶點收集 當歸芍藥散中入血成分12個[6-8],其中當歸中5個,川芎中7個,白芍中2個,澤瀉中2個,茯苓中1個,白術(shù)中未發(fā)現(xiàn)入血成分,入血成分靶點296個,入血成分信息見表1。以“Primary Dysmenorrhea”為關(guān)鍵詞,從OMIM及GeneCards數(shù)據(jù)庫篩選出疾病靶點共517個,取交集得到入血成分與原發(fā)性痛經(jīng)的靶點26個,見圖1。

圖1 藥物與疾病的交集基因

表1 入血成分的基本信息

2.2入血成分-原發(fā)性痛經(jīng)靶點網(wǎng)絡(luò) 運用Cytoscape3.6.1版軟件,以入血成分與疾病靶點構(gòu)建“當歸芍藥散入血成分-疾病靶點網(wǎng)絡(luò)”,可視化分析得531個節(jié)點,577條邊,連線表示入血成分與疾病靶點之間的相互作用,見圖2。

藍色橢圓形代表入血成分;黃色方形代表入血成分與疾病交集靶點;紫色菱形代表疾病基因。

2.3PPI網(wǎng)絡(luò) 通過STRING網(wǎng)站對共同靶點進行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)分析,見圖3,利用Cytoscape3.6.1版軟件對數(shù)據(jù)進行可視化分析,度值越大,節(jié)點的顏色越深、圖形越大;兩點間連線越粗,節(jié)點間相互作用越強。其中核心靶點有VEGFA、腫瘤壞死因子(TNF)、白細胞介素(interleukin,IL)-6、ESR1、PTGS2等。

圖3 蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

2.4GO和KEGG通路富集分析 GO富集分析得1603個富集條目(P<0.05),其中生物過程主要富集在調(diào)節(jié)炎癥反應、調(diào)控細胞因子、調(diào)節(jié)內(nèi)皮屏障、參與類固醇激素代謝、增強配體-受體活性、調(diào)節(jié)應答神經(jīng)應激反應等方面,排名前十的富集結(jié)果見圖4。篩選出68條信號通路(P<0.05),主要涉及IL-17、腫瘤壞死因子、MAPK、花生四烯酸代謝、雌激素等信號通路。KEGG分析排名前二十的條目見圖5,所得氣泡圖中圖形越大、顏色越綠,說明P值越小,富集越顯著。

圖4 GO富集分析

圖5 KEGG 信號通路(前20條)富集分析

2.5分子對接 將入血成分-疾病網(wǎng)絡(luò)篩出的關(guān)鍵成分與度值排名靠前的靶蛋白分子對接,結(jié)果顯示結(jié)合能均為負值,數(shù)值越小表明二者之間親和力越高,見表2?？梢暬治霭l(fā)現(xiàn),Z-丁烯基酞內(nèi)酯、芍藥內(nèi)酯苷、洋川芎內(nèi)酯I三個關(guān)鍵成分與各蛋白結(jié)合能力較強,各成分均與PTGS2結(jié)合能力最強,見圖6。

圖6 關(guān)鍵成分與核心靶點蛋白PTGS2對接

表2 關(guān)鍵成分與核心靶點的分子對接評分表

2.6當歸芍藥散有效性評價 注射縮宮素后30 min內(nèi)模型組、陽性藥組及當歸芍藥散組的扭體次數(shù)均顯著高于對照組(0次)(P<0.01),模型復制成功;當歸芍藥散組及陽性藥組扭體次數(shù)分別為(10.67±6.54)和(11.50±7.81)次,均顯著少于模型組(27.8±11.19)次(P<0.01)。造模給藥的10 d內(nèi)模型組體質(zhì)量較對照組增長緩慢,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),給藥結(jié)束后當歸芍藥散組與模型組間體質(zhì)量差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見圖7-A及圖7-B。組織病理學分析,模型組較對照組出現(xiàn)嚴重子宮內(nèi)膜剝脫及水腫;當歸芍藥散組及陽性藥組較模型組子宮內(nèi)膜剝脫及水腫程度明顯減輕,見圖8。綜上,當歸芍藥散可改善由苯甲酸雌二醇聯(lián)合縮宮素誘導的原發(fā)性痛經(jīng)模型大鼠痛經(jīng)反應。

①與對照組比較,P<0.01;②與模型組比較,P<0.05。

圖8 4組大鼠子宮組織病理變化(×200)

3 討論

原發(fā)性痛經(jīng)(primary dysmenorrhea,PD)是生殖器官無器質(zhì)性病變引起的痛經(jīng),主要癥狀包括下腹部痙攣性疼痛,伴有惡心、嘔吐、腹瀉、頭暈等表現(xiàn)[11]。西醫(yī)認為PD的病因可能與前列腺素、縮宮素、血管加壓素、神經(jīng)遞質(zhì)、遺傳及心理等多種因素關(guān)系密切[12],常用治療藥物有解熱鎮(zhèn)痛類、激素類及非甾體抗炎藥物,雖然療效確切,但是易引起眩暈、頭痛、胃腸道不良反應及產(chǎn)生耐藥性[13]。當歸芍藥散作為中醫(yī)治療痛經(jīng)的經(jīng)典名方,已被制成顆粒劑廣泛用于脾虛、肝郁、血虛等痛經(jīng)的治療。經(jīng)動物實驗驗證,當歸芍藥散可顯著減少PD模型大鼠的扭體次數(shù)和改善大鼠子宮內(nèi)膜剝脫及水腫情況,為臨床應用有效性提供佐證,當歸芍藥散的潛在作用機制值得深入研究。

本研究明確了當歸芍藥散12個入血成分治療原發(fā)性痛經(jīng)的26個關(guān)鍵靶點,通過分子對接篩選出洋川芎內(nèi)酯I、Z-丁烯基酞內(nèi)酯、芍芍藥內(nèi)酯苷3個與PD關(guān)鍵靶點結(jié)合較強的入血成分,可初步認為是當歸芍藥散治療PD的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。3種活性成分可通過下調(diào)炎癥因子表達水平、誘導細胞凋亡、抑制細胞的周期性進程等方式發(fā)揮抗炎、抗氧化應激及保護血管等多重藥理作用[14-16]。關(guān)鍵靶點TNF可誘導炎癥反應和誘導細胞凋亡,對B細胞、T細胞、樹突細胞的發(fā)育有突出作用[17];IL-6對子宮有收縮作用,誘導炎癥反應,進而導致子宮上皮局部組織缺血缺氧引發(fā)痛經(jīng)[18];VEGFA促進內(nèi)皮細胞生長,擴張血管,增加血管通透性[19];ESR1刺激血清中肥大細胞釋放疼痛物質(zhì)而產(chǎn)生痛經(jīng)[20];PTGS2促進前列腺素的合成,造成平滑肌痙攣性收縮導致痛經(jīng)[21]。

KEGG通路主要富集在IL-17、TNF、MAPK、花生四烯酸代謝、雌激素、卵巢類固醇生成等信號通路,關(guān)鍵靶點中的TNF、IL-6、IL-1β、PTGS2等均在IL-17信號通路及TNF信號通路上有所富集。IL-17通路可抑制炎癥因子、趨化因子的產(chǎn)生,緩解炎癥,文獻中缺乏IL-17基因的小鼠對各種病原菌的易感性顯著增高,死亡風險增加[22-23]。TNF-α作為腫瘤壞死因子的一種亞型,促進IL-1、IL-6和IL-8等炎癥介質(zhì)的釋放,參與炎癥反應的調(diào)控[24]。MAPK信號通路[25-26]與炎癥、腫瘤等疾病關(guān)系密切,MAP激酶對多種炎癥細胞因子的表達起調(diào)節(jié)作用。綜上,當歸芍藥散對原發(fā)性痛經(jīng)的治療作用,主要通過作用于關(guān)鍵靶點,調(diào)控激素效應、調(diào)節(jié)炎癥因子的表達,抑制子宮的炎癥反應來實現(xiàn)。

本研究基于當歸芍藥散的入血成分,通過網(wǎng)絡(luò)藥理學、分子對接技術(shù)及動物實驗三種策略,分析其治療原發(fā)性痛經(jīng)的作用靶點、生物過程、信號通路及有效性,為今后全面認識當歸芍藥散的藥理作用及臨床價值提供思路與線索。