復(fù)方柏連制劑對(duì)小鼠抗炎鎮(zhèn)痛作用及濕熱型UC模型大鼠TNF-α、IL-6、IL-1β表達(dá)的影響*

郭媛媛,朱志坤,王飄,王五兵,李思琪,陳凌云,余曉玲

(1.云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院藥劑實(shí)驗(yàn)室,昆明 650500;2.昆明市中醫(yī)醫(yī)院藥劑科,昆明 650500)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)是以大腸黏膜及黏膜下層持續(xù)性炎癥為特征的慢性非特異性疾病,具有易復(fù)發(fā)、難治愈的特點(diǎn)[1-2]。UC發(fā)病機(jī)制較復(fù)雜,其癥狀主要有腹瀉、黏液膿血便、反復(fù)腹痛等[3],中醫(yī)認(rèn)為 UC 屬 “泄瀉”“腸癖”“臟毒”“滯下”“下血”“腸風(fēng)”的范疇[4-5]。近年,越來(lái)越多的臨床試驗(yàn)證明,具有多靶點(diǎn)、多成分的中藥輔助治療有利于緩解UC癥狀,具有療效可靠、副作用少、復(fù)發(fā)率低的優(yōu)勢(shì)[6]。

復(fù)方柏連方為治療UC的經(jīng)驗(yàn)方,具有清熱除濕、活血化瘀、收斂止痢及促進(jìn)潰口愈合等作用,在臨床上療效顯著,為方便患者使用,在原湯劑基礎(chǔ)上制成復(fù)方柏連灌腸劑(compoundbailianenema)和復(fù)方柏連凝膠劑(compoundbailiangel),本文通過(guò)對(duì)兩種制劑的毒理和藥效進(jìn)行研究,為臨床應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明小鼠,無(wú)特定性病原體(SPF)級(jí),6～8 周齡,體質(zhì)量為(20±2) g;SD 大鼠,SPF 級(jí),體質(zhì)量為150～180 g,購(gòu)買(mǎi)于昆明醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心,許可證號(hào)為:SYXK(滇)2020-0004,飼養(yǎng)于云南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心 SPF 級(jí)動(dòng)物房,室溫:(22±3) ℃,相對(duì)濕度:55%～60%。

1.1.2藥物與試劑 復(fù)方柏連灌腸劑(昆明市中醫(yī)醫(yī)院提供,每瓶200 mL,批號(hào):210915)、復(fù)方柏連凝膠劑(昆明市中醫(yī)醫(yī)院提供,每瓶200 g,批號(hào):211010)、阿司匹林(上海皓鴻生物醫(yī)藥科技有限公司,批號(hào):Lc1210006)、柳氮磺吡啶腸溶片(上海信誼天平藥業(yè)有限公司,批號(hào):09211015)、冰醋酸(廣東光華科技股份有限公司,批號(hào):20190526)、0.9%氯化鈉水溶液(安徽靚水亭醫(yī)療器械有限公司,批號(hào):20220224)、蜂蜜(昆明道地中藥飲片廠,批號(hào):211101)、豬油(臨沂經(jīng)開(kāi)區(qū)裕升食用油有限公司,批號(hào):20220108)、紅星二鍋頭白酒(北京紅星股份有限公司,批號(hào):20211205)、4% 多聚甲醛(北京蘭杰柯科技有限公司,批號(hào):21348860)、水合氯醛(成都市科隆化學(xué)品有限公司,批號(hào):2019121301)、2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)(Sigma-Aldrich貿(mào)易有限公司,批號(hào):SLCK4178)、乙醇(天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司,批號(hào):20220301826)、二甲苯(天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司,批號(hào):20190311)、酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測(cè)試劑盒(江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司,腫瘤壞死因子(TNF)-α:20220518-31063A、白細(xì)胞介素(IL)-1β:20220518-30206A、IL-6:20220518-30219A)。

1.1.3儀器 CP124C 電子分析天平(奧豪斯儀器有限公司,感量:0.01 mg)、T-1000電子天平(美國(guó)雙杰兄弟有限公司,感量:0.1 mg)、高速離心機(jī)(湖南儀器儀表總廠離心機(jī)廠,離心半徑12 cm)、正置白光拍照顯微鏡(日本尼康公司,NIKON ECLIPSE C1)。

1.2方法

1.2.1急性毒性實(shí)驗(yàn) 因復(fù)方柏連制劑毒性低,動(dòng)物灌腸給藥受藥物濃度和體積限制,測(cè)不出半數(shù)致死量(LD50),故進(jìn)行最大給藥量實(shí)驗(yàn)[7]。取昆明小鼠30只,雌雄各半,采用隨機(jī)數(shù)字表法分為3組,每組10只,分為正常對(duì)照組、復(fù)方柏連灌腸組、復(fù)方柏連凝膠組。給藥前動(dòng)物禁食不禁水12 h,正常對(duì)照組予以0.9%氯化鈉溶液每只灌腸0.8 mL,復(fù)方柏連灌腸組(2.02 g·mL-1)予以復(fù)方柏連灌腸劑每只灌腸0.8 mL,復(fù)方柏連凝膠組(2.02 g·g-1)予以復(fù)方柏連凝膠劑每只灌腸0.8 g。各組均24 h內(nèi)灌腸 2 次,觀察并記錄給藥后30 min、2 h及隨后14 d小鼠外觀、行為、飲食、排泄物及毒性反應(yīng),每日稱(chēng)體質(zhì)量;記錄14 d內(nèi)死亡小鼠數(shù),死亡小鼠立即解剖,觀察其內(nèi)臟病理變化。所有小鼠實(shí)驗(yàn)第15天脫頸處死,解剖觀察臟腑病理變化。

1.2.2黏膜刺激實(shí)驗(yàn) 取SD大鼠 40 只,雌雄各半,采用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組、空白凝膠組、復(fù)方柏連灌腸組、復(fù)方柏連凝膠組,每組 10 只。復(fù)方柏連灌腸組(2.02 g·mL-1)予以復(fù)方柏連灌腸劑 5.25 mL·kg-1灌腸,復(fù)方柏連凝膠組(2.02 g·g-1)予以復(fù)方柏連凝膠劑 5.25 g·kg-1灌腸,正常對(duì)照組和空白凝膠組予以等體積0.9%氯化鈉溶液或空白凝膠灌腸。每天給藥1次,連續(xù)給藥 7 d。

1.2.3抗炎實(shí)驗(yàn) 取昆明小鼠80只,雌雄各半,采用隨機(jī)數(shù)字表法分為8組,每組10只:正常對(duì)照組(0.9%氯化鈉溶液)、陽(yáng)性對(duì)照組(阿司匹林混懸液0.2 g·kg-1)、復(fù)方柏連灌腸組和復(fù)方柏連凝膠大(34 g·kg-1)、中(17 g·kg-1)、小(8.5 g·kg-1)劑量組,各組動(dòng)物每天灌腸給藥1次,灌腸劑量為16.83 mL·kg-1,連續(xù)給藥7 d。末次給藥30 min后,每只右耳背腹兩側(cè)涂以二甲苯0.04 mL,左耳作對(duì)照,不做處理。30 min后處死動(dòng)物,剪下雙耳,用直徑8 mm的打孔器在雙耳同部位打下圓形耳片稱(chēng)質(zhì)量,計(jì)算小鼠耳脹腫率。小鼠耳腫脹率(%)=(右耳片質(zhì)量-左耳片質(zhì)量)/左耳片質(zhì)量×100%;小鼠耳腫脹抑制率(%)=(正常對(duì)照組平均腫脹度-給藥組平均腫脹度)/正常對(duì)照組平均腫脹度×100%[8]。

1.2.4鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn) 取昆明小鼠 80 只,分組及給藥同“1.2.3”抗炎實(shí)驗(yàn)。末次給藥1 h 后,腹腔注射 0.6% 冰醋酸溶液,每只10 mL·kg-1,觀察記錄15 min內(nèi)小鼠扭體次數(shù)[9],計(jì)算扭體抑制率。小鼠扭體抑制率(%)=(正常對(duì)照組平均扭體次數(shù)-給藥組平均扭體次數(shù))/正常對(duì)照組平均扭體次數(shù)×100%。

1.2.5TNBS/乙醇致大鼠UC實(shí)驗(yàn)

①動(dòng)物模型建立。取SD大鼠 120 只,雌雄各半,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,采用隨機(jī)數(shù)字表法分為 10 組,除正常對(duì)照組外,其余各組均參考文獻(xiàn)[10]建立大腸濕熱模型。于造模第11天禁食24 h,給予造模藥液(TNBS 100 mg·kg-1+50%乙醇)0.8 mL,用直徑約1.5 mm的8 f導(dǎo)尿管插入肛門(mén)上段約8 cm處一次性注入上述混合試劑[11],提拉大鼠尾巴倒立30 s,讓藥液與腸道充分接觸,造出UC大鼠模型。大鼠出現(xiàn)腹瀉、稀便、血便等指標(biāo)即為造模成功。

②給藥方法。將造模成功大鼠全部給予正常飼料和純凈水喂養(yǎng),并隨機(jī)分為 9 組,模型對(duì)照組(0.9%氯化鈉溶液)、空白凝膠組、陽(yáng)性對(duì)照組(柳氮磺吡啶腸溶片混懸液0.36 g·kg-1)、復(fù)方柏連灌腸組和 復(fù)方柏連凝膠高(20.4 g·kg-1)、中(10.2 g·kg-1)、低(5.1 g·kg-1)劑量組、外加正常對(duì)照組。各組動(dòng)物每天灌腸給藥1次,灌腸劑量為10.10 mL·kg-1,連續(xù)給藥14 d。

③觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

(1)DAI 評(píng)分計(jì)算:每日觀察大鼠一般情況后,根據(jù)便血情況并結(jié)合體質(zhì)量變化進(jìn)行小鼠疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)分(disease activity index,DAI),DAI 評(píng)分=體質(zhì)量下降分?jǐn)?shù)+糞便性狀分?jǐn)?shù)+便血分?jǐn)?shù)[12]。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

表1 DAI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

(2)血清中 TNF-α、IL-6、IL-1β測(cè)定:于大鼠末次給藥1 h后用10%水合氯醛(3 mL·kg-1)腹腔注射麻醉,立即剖腹取腹主動(dòng)脈血約8 mL,靜置30 min,以3 000 r·min-1離心15 min,離心半徑為12 cm,分離上層血清,置于-20 ℃冰箱內(nèi)保存,采用ELISA法測(cè)定,測(cè)定炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β的含量。

(3)損傷結(jié)腸長(zhǎng)度及 CMDI 評(píng)分的測(cè)定:每組大鼠采血結(jié)束后,隨即解剖,統(tǒng)一在距肛門(mén)約2 cm處往上取結(jié)腸組織,肉眼觀察腸黏膜的損傷程度,按結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)(colon mucosa damage index,CMDI)進(jìn)行評(píng)分,用大頭針固定結(jié)腸,測(cè)量結(jié)腸長(zhǎng)度。0分:無(wú);1分:輕度充血,水腫,表面光滑,無(wú)糜爛或潰瘍;2分:充血水腫,黏膜粗糙呈顆粒狀,有糜爛或腸粘連;3分:高度充血水腫,黏膜表面有壞死及潰瘍形成,潰瘍最大縱徑<1.0 cm,腸壁增厚或表面有壞死及炎癥;4分:在3分基礎(chǔ)上潰瘍最大縱徑>1.0 cm或全腸壁壞死。

(4)結(jié)腸病理學(xué)變化:另取病變結(jié)腸組織約2 cm于4%多聚甲醛溶液中固定,制成病理切片,常規(guī)蘇木精-伊紅(HE)染色,觀察組織病理學(xué)變化。

2 結(jié)果

2.1急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 14 d內(nèi)各組小鼠活動(dòng)正常,皮毛光滑,飲食及大、小便未見(jiàn)明顯異常,無(wú)死亡小鼠,給藥后實(shí)驗(yàn)組體質(zhì)量增長(zhǎng)與正常對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖1)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束處死所有小鼠,解剖肉眼觀察小鼠心、肝、脾、肺、腎、結(jié)腸等主要臟器未見(jiàn)明顯異常。

圖1 急性毒性實(shí)驗(yàn)對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響

2.2黏膜刺激實(shí)驗(yàn)結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組及正常對(duì)照組大鼠每日給藥后毛發(fā)色澤及排泄物均正常,直腸病理檢查結(jié)果均正常,黏膜完整,無(wú)潰瘍,黏膜腺體間無(wú)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),淺表無(wú)糜爛及不典型增生,可見(jiàn)散在杯狀細(xì)胞。給藥期間無(wú)死亡大鼠。見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠結(jié)腸組織的病理切片圖(HE)

2.3抗炎實(shí)驗(yàn)結(jié)果 對(duì)照組小鼠在給予二甲苯致炎后,右耳明顯腫脹,腫脹率達(dá)65.32%。與正常組相比,陽(yáng)性藥阿司匹林對(duì)二甲苯致小鼠耳廓腫脹具有明顯的抑制作用(P<0.01),復(fù)方柏連灌腸劑和凝膠劑大、中、小劑量均可顯著抑制二甲苯引起的小鼠耳腫脹。表明復(fù)方柏連灌腸劑和凝膠劑具有一定的抗炎作用,見(jiàn)表2。

表2 復(fù)方柏連制劑對(duì)二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響

2.4鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)結(jié)果 與對(duì)照組相比,陽(yáng)性藥阿司匹林對(duì)醋酸致小鼠疼痛具有明顯的抑制作用(P<0.01),復(fù)方柏連灌腸劑和凝膠劑大、中、小劑量均能明顯減少小鼠扭體次數(shù),給予復(fù)方柏連灌腸大劑量時(shí)小鼠扭體次數(shù)顯著減少(P<0.01),抑制率為51.07%,見(jiàn)表3。

表3 復(fù)方柏連制劑對(duì)醋酸致小鼠扭體次數(shù)的影響

2.5TNBS/乙醇致大鼠UC實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5.1DAI評(píng)分 模型對(duì)照組與正常對(duì)照組 DAI 評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),提示造模成功。給藥14 d后,相較于模型對(duì)照組,給藥組 DAI 評(píng)分顯著降低(P<0.05或P<0.01),提示給藥組癥狀減輕,給藥可緩解UC大鼠疾病癥狀。見(jiàn)表4。

表4 復(fù)方柏連制劑對(duì)UC大鼠DAI評(píng)分的影響

2.5.2損傷結(jié)腸長(zhǎng)度及CMDI評(píng)分 治療14 d后,模型對(duì)照組與正常對(duì)照組損傷結(jié)腸長(zhǎng)度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),其中,陽(yáng)性組、復(fù)方柏連灌腸、復(fù)方柏連凝膠大劑量組損傷結(jié)腸長(zhǎng)度顯著增加(P<0.05);與模型組相比,陽(yáng)性組與各給藥組CMDI評(píng)分降低(P<0.05)。見(jiàn)表5。

表5 治療14 d后各組大鼠損傷結(jié)腸長(zhǎng)度及CMDI評(píng)分

2.5.3結(jié)腸病理改變 正常對(duì)照組鏡下可見(jiàn)腸組織各層結(jié)構(gòu)清晰,黏膜上皮完整,腸腺數(shù)量豐富,排列緊密,未見(jiàn)明顯潰瘍及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。模型對(duì)照組和空白凝膠組鏡下可見(jiàn)腸組織大面積潰瘍,少量上皮細(xì)胞壞死,固有層可見(jiàn)多量腸腺壞死,結(jié)構(gòu)消失,結(jié)締組織增生,伴多量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),黏膜下層結(jié)締組織增生,有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),以中性粒細(xì)胞為主[14-15]。與正常對(duì)照組相比,給藥組炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度、腺體修復(fù)程度有不同程度改善,陽(yáng)性組恢復(fù)效果最好。見(jiàn)圖3。

①正常對(duì)照組;②空白凝膠組;③模型對(duì)照組;④陽(yáng)性組;⑤復(fù)方柏連灌腸大劑量組;⑥復(fù)方柏連灌腸中劑量組;⑦復(fù)方柏連灌腸小劑量組;⑧復(fù)方柏連凝膠大劑量組;⑨復(fù)方柏連凝膠中劑量組;⑩復(fù)方柏連凝膠小劑量組。

2.5.4血清中TNF-α、IL-6、IL-1β含量變化 與正常對(duì)照組比較,模型對(duì)照組中TNF-α、IL-6及IL-1β 的含量顯著升高(P<0.01),表明造模成功。復(fù)方柏連灌腸和復(fù)方柏連凝膠大、中、小劑量組及陽(yáng)性組均能明顯降低UC大鼠的損傷指數(shù),其中復(fù)方柏連凝膠大劑量組與陽(yáng)性組作用相當(dāng)(P>0.05),復(fù)方柏連灌腸和復(fù)方柏連凝膠大劑量組作用均優(yōu)于中、小劑量組(P<0.05或P<0.01)。見(jiàn)表6。

表6 復(fù)方柏連制劑對(duì)血清中TNF-α、IL-6、 IL-1β的影響

3 討論

目前UC的發(fā)病機(jī)制尚未明確,中醫(yī)認(rèn)為該病主要由濕邪侵襲腸道,濕熱和脾胃虛弱導(dǎo)致,并將其分為7種證型。本研究參考相關(guān)文獻(xiàn),基于“病證結(jié)合”原則,建立的 UC 大腸濕熱證模型能夠更好地體現(xiàn)中醫(yī)病機(jī)和西醫(yī)病理的特點(diǎn),更符合藥效的觀察和評(píng)價(jià)。并選取 TNF-α、IL-6、IL-1β 作為炎癥評(píng)價(jià)指標(biāo),以上指標(biāo)在 UC 的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用[16],并與 UC 的疾病活動(dòng)呈正相關(guān)。TNF-α 是一種具有生物活性的炎癥物質(zhì),可與腫瘤壞死因子受體-1 結(jié)合,促進(jìn)炎癥因子產(chǎn)生[17-18];IL-1β 屬于Th1分泌的細(xì)胞因子,可由巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生,促進(jìn)炎癥反應(yīng),刺激T淋巴細(xì)胞活化和B淋巴細(xì)胞抗體的分泌,直接介導(dǎo)UC患者炎癥的發(fā)生[19];IL-6是促炎因子,能與靶細(xì)胞表面IL-6受體識(shí)別并結(jié)合成復(fù)合物,調(diào)控炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)[20]。本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛯?duì)照組大鼠的腸組織中TNF-α、IL-1β、IL-6活性均顯著升高,與UC發(fā)病機(jī)制一致。復(fù)方柏連制劑大、中、小劑量組及陽(yáng)性組均能降低小鼠耳腫脹率,減少扭體次數(shù),且與模型對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);均能明顯降低UC大鼠的腸損傷指數(shù)。表明復(fù)方柏連灌腸劑和凝膠劑有較好的抗炎鎮(zhèn)痛、清熱除濕作用,對(duì)UC有一定的治療作用,為該制劑進(jìn)一步應(yīng)用于臨床提供了基礎(chǔ)。