九寨溝中華蟾蜍和中國林蛙腸道菌群差異分析

黃飛云， 向朋， 尚可， 楊宇， 趙春霖， 岳碧松

（四川大學生命科學學院，生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室，成都 610065）

中華蟾蜍Bufo gargarizans是東亞地區(qū)演化最成功的兩棲類之一，分布范圍廣，從太平洋島嶼延伸至青藏高原，分布海拔750～3 500 m，在我國除新疆、臺灣、海南外均有分布（李蘋等，2020；楊巧等，2022）。中華蟾蜍還是傳統(tǒng)中藥，蟾酥、蟾衣均可入藥（梁智佳，2021）。中國林蛙Rana chensinensis是我國北方地區(qū)廣泛分布且具有較強陸地生活適應能力的無尾兩棲類，分布區(qū)包括黑龍江、吉林、遼寧、內蒙古、河北、山西、陜西、甘肅、青海、新疆、山東、江蘇、四川、西藏等，哈蟆油為中國林蛙雌蛙輸卵管的干制品，是重要的中藥（楊紅玉，2021；孫敬蒙等，2022）。

腸道是動物機體最重要的消化器官，也是眾多共生微生物的主要棲息場所。腸道微生物群落作為宿主生理活動的積極參與者，可調節(jié)宿主的代謝和生理功能，從而有助于其內穩(wěn)態(tài)的平衡。同樣，腸道微生物對于機體健康的維持等方面也發(fā)揮著至關重要的作用（申喻嘉等，2021）。腸道微生物菌群結構與多樣性和免疫功能、營養(yǎng)代謝等息息相關（孫笑非等，2015；王文娟等，2017；趙零等，2022）。腸道微生物相關研究集中在人和大型脊椎動物，對兩棲類腸道微生物的研究較少。蛙類的腸道微生物以擬桿菌門Bacteroidota、變形菌門Proteobacteria、梭桿菌門Fusobacteriota 和厚壁菌門Firmicutes 為主要優(yōu)勢菌群（馬麗，2015；王建等，2018）。不同蛙類腸道微生物群落差異顯示，中國林蛙、黑斑側褶蛙Pelophylax nigromculatus和牛蛙Rana catesbeiana三者蝌蚪在疣微菌門Verru?comicrobiota、鯨桿菌屬Cetobacterium、鄰單胞菌屬Plesiomonas和氣單胞菌屬Aeromonas中具有顯著差異（慕丹陽，2018）。而中華蟾蜍腸道微生物結構在個體自身發(fā)育過程中具有顯著變化，但相關研究還未引起廣泛關注。白筱（2017）的研究顯示，中華蟾蜍蝌蚪在發(fā)育過程中腸道變形菌門的豐度降低而擬桿菌門和梭桿菌門的豐度提高，厚壁菌門內的細菌種類發(fā)生變化，放線菌門Actinobacteri?ota基本消失且新出現了疣微菌門。兩棲動物進化地位特殊，其腸道菌群結構對于解析脊椎動物與腸道菌群的共生機制意義重大。為了解成年中華蟾蜍和中國林蛙腸道微生物的組成，并探究兩者腸道微生物的差異，本文以同時采自四川九寨溝國家級自然保護區(qū)的中華蟾蜍和中國林蛙為對象，采用16S rRNA 測序方法，對它們腸道內主要細菌類群及差異進行初步分析，為進一步深入研究提供基礎數據。

1 材料及方法

1.1 實驗材料

2021年5月，從四川九寨溝國家級自然保護區(qū)（海拔2 930 m）采集成體中華蟾蜍和中國林蛙各3 只，盡快送回實驗室后，表面沖洗消毒后解剖取消化道，收集腸道內容物于無菌離心管中，液氮保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 基因組DNA提取及16S rRNA測序

基因組DNA 提取按照試劑盒（Sigma-Aldrich，美國）要求進行，DNA 樣品檢測合格后送北京諾禾致源科技股份有限公司進行高通量測序。使用PCR 擴增通用引物343F 和798R 擴增16S rRNA基因的V3至V4可變區(qū)。

1.3 數據分析

基于Deblur 算法建立擴增序列變體（amplicon sequence variant，ASV）的特征表和特征序列，利用在線平臺（Majorbio Biotech Co.， Ltd）和QIIME 1.9.1進行腸道菌群的多樣性分析：基于ASV 表生成稀釋梯度數據用于評估高通量測序中的測序深度和數量是否足以反映該群落樣品所包含的微生物多樣性；生成物種累積曲線用以分析樣品量是否充分；通過t檢驗分析2個物種的α多樣性指數（Chaol指數、Shannon指數和Simpson指數）和Pielou指數；通過β 多樣性研究2 個物種在細菌水平組成結構的相似性，基于ASV 豐度的Bray-curis 距離繪制主成分分析圖。基于silva138/16s數據庫對ASV 進行物種分類注釋，對不同樣本在門和屬水平上的物種組成情況進行豐度統(tǒng)計分析。最后使用Kruskal-Wallis 秩和檢驗進行線性判別分析，以獲得2個物種之間的標志性微生物。

2 結果分析

2.1 測序質量評估

3 只中華蟾蜍和3 只中國林蛙腸道細菌16S rRNA的有效序列數量為70 027～86 992，ASV數量為282～551，覆蓋度均在96%以上（表1），中華蟾蜍和中國林蛙共有的ASV 為440，而特有的ASV 分別為313和539，表明中國林蛙腸道細菌具有更高的多樣性。物種累積曲線趨于平緩（圖1：A）；稀釋曲線也隨著樣本數的增加逐步趨于漸近線（圖1：B），表明測序數據量已覆蓋樣品中的絕大多數物種，測序數據合理可靠。

圖1 樣本測序可靠性分析Fig. 1 Reliability analysis of sample sequencing

表1 樣本ASVTable 1 Sample ASVs

2.2 菌群結構的α多樣性分析

中國林蛙腸道菌群的群落豐富度和群落多樣性均比中華蟾蜍的高（表2）。

2.3 菌群結構的β多樣性分析

中華蟾蜍和中國林蛙的腸道菌群結構表現出明顯差異，且中國林蛙腸道菌群結構在個體間差異較大（圖2）。

2.4 腸道菌群在門級水平上的差異

在門級水平上，中華蟾蜍和中國林蛙的腸道細菌主要屬于厚壁菌門、疣微菌門、擬桿菌門、脫硫桿菌門Desulfobacterota 和變形菌門，約占總數的99.00%。在中華蟾蜍腸道中，疣微菌門最豐富，占48.40%，其次是厚壁菌門和擬桿菌門，分別占30.89%和16.89%；而在中國林蛙腸道中，厚壁菌門和擬桿菌門細菌較豐富，分別占45.08% 和22.90%，其次是疣微菌門和脫硫桿菌門（圖3）。

圖3 中華蟾蜍和中國林蛙腸道菌群在門級水平的相對豐度Fig. 3 Relative abundance of the intestinal flora of Bufo gargarizans and Rana chensinensis at phylum level

2.5 腸道菌群在屬級水平上的差異分析

中華蟾蜍和中國林蛙腸道菌群中，豐富度在1%以上的有17 個屬級單元，分別占這2 種動物腸道菌群的69.82%和41.37%，其中，阿克曼菌屬Ak?kermansia最豐富，分別占48.35%和10.75%，其次是布雷茲納基亞屬Breznakia、脫硫弧菌屬Desulfo?vibrio、擬桿菌屬Bacteroides、另枝菌屬Alistipes和理研菌屬Rikenella，其他各屬占比較?。ū?）。

表3 中華蟾蜍和中國林蛙腸道菌群主要屬（0.1%以上）的ASV豐度Table 3 Abundance of ASVs in the main genera （>0.1%） of the intestinal flora of Bufo gargarizans and Rana chensinensis

2.6 線性判別分析

線性判別分析顯示，中華蟾蜍和中國林蛙腸道菌群中，有16 個類群的豐度存在顯著差異（圖4）。其中，中華蟾蜍腸道菌群中的疣微菌門、阿克曼菌科Akkermansiaceae、疣微菌目Verrucomi?crobiales 和阿克曼菌屬的豐富度均顯著高于中國林蛙（P<0.05），而振螺目Oscillospirales、疣微菌科Ruminococcaceae、沙氏別樣桿菌Alistipes shahii、產己酸菌屬Caproiciproducens、顫螺旋菌科Oscillospi?raceae、瘤胃球菌屬Ruminococcus UBA1819、內臟臭氣桿菌Odoribacter splanchnicus、酪酸梭菌屬Anaer?otruncus、腸桿菌屬Intestinibacter、棍狀厭氧菌屬An?aerorhabdus furcosa_group、巴斯德氏菌目Pasteurel?lales的豐度均顯著低于中國林蛙（P<0.05）。

圖4 線性判別分析Fig. 4 Linear discriminant analysis

3 討論

腸道微生物菌群是動物健康和生理功能的重要參與者，它們在營養(yǎng)物質吸收與代謝、免疫應激與疾病等方面發(fā)揮著重要作用（Shiet al.，2017；Heet al.，2020）。在人類、家禽和哺乳動物微生物的研究中較廣泛（林璋等，2016；Makiet al.，2019），但對蛙類的研究卻少見報道。蛙類的腸道微生物菌群以擬桿菌門、變形菌門、梭桿菌門和厚壁菌門為主要優(yōu)勢菌群（馬麗，2015；慕丹陽，2018；王建等，2018）。在本試驗中，中華大蟾蜍的核心優(yōu)勢菌群為擬桿菌門、疣微菌門和厚壁菌門，這3 種占據了腸道微生物門級水平90%以上。中國林蛙的腸道優(yōu)勢菌群為擬桿菌門、厚壁菌門、疣微菌門和變形菌門，這4 種占據了腸道微生物門級水平80%以上。因此，推測厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門和疣微菌門是兩棲類腸道中的固有菌群，菌群組成比例受基因、年齡、性別和環(huán)境等因素的影響。劉文舒等（2020）研究表明，兩棲動物與人類和家禽等的腸道微生物菌群結構具有明顯差異。說明在復雜的生長環(huán)境下，腸道微生物易受環(huán)境、發(fā)育等因素影響而產生明顯差異。

為了實現有效調控腸道菌群以維持宿主健康，必須深入了解腸道菌群與驅動因子間的關系。腸道菌群通常是在多種驅動因子協同影響下，厘清這些因子的效應依然是一個挑戰(zhàn)。Song 等（2021）研究發(fā)現，變形菌門是冬眠期成體中華蟾蜍小腸菌群的最豐富細菌門類，假單胞菌屬Pseu?domonas可能是中華蟾蜍小腸菌群適應冬眠過程的關鍵細菌。在個體發(fā)育層面，中華蟾蜍在變態(tài)過程中，腸道微生物種群多樣性會減少，種群組成也會發(fā)生變化，這些變化與其采食、生活環(huán)境、腸道形態(tài)和體質量降低等因素改變有關。在這一過程中，中華蟾蜍腸道微生物中疣微菌門、阿克曼菌、腸桿菌屬、雙歧桿菌屬Bifidobacterium和Alpin?imonas菌的豐度均隨著蝌蚪體重減少而改變（白筱，2018）。此外，由于水陸兩棲的獨特生活史及皮膚的高滲透性，兩棲動物比其他類群對環(huán)境變化更加敏感，因此推測環(huán)境對其具有重大影響。黃皓（2019）的研究顯示，來自伊春的東北林蛙Rana dybowskii與哈爾濱的黑龍江林蛙Rana amu?rensis腸道中的微生物群落格局存在顯著差異。綜上所述，兩棲類腸道菌群結構的差異應為物種本身及環(huán)境因素共同作用的結果。在門級水平顯示，中華蟾蜍腸道中疣微菌門豐度最高，中國林蛙腸道中厚壁菌門豐度最高。在屬級水平中，僅中華蟾蜍腸道微生物中的阿克曼菌屬高于中國林蛙，其他水平均顯著低于中國林蛙。推測中華蟾蜍較低的腸道多樣性與其發(fā)育完全相關，而疣微菌門和阿克曼菌屬的高豐度與其高海拔環(huán)境及體重降低相適應。此外，中國林蛙腸道中變形菌門水平顯著高于中華蟾蜍，同時在屬級水平分析中發(fā)現，Haemophilus、腸桿菌屬、Ralstonia和Anaero?stignum等的豐度也較高，表明中國林蛙比中華蟾蜍帶有更多的條件致病菌。水生動物腸道中存在大量的條件致病菌，對宿主健康造成潛在威脅。宋萍（2011）的研究表明，弧菌屬Vibrio、氣單胞菌屬是水生動物腸道中的常見病原菌屬。當受到外界壓力時，中國林蛙腸道中的條件致病菌會大量增殖，然而這些致病菌的來源還需要進一步探究，但這些發(fā)現為中國林蛙細菌疾病的防治提供了參考。

本研究中，相較中國林蛙，中華蟾蜍腸道中的阿克曼菌屬這一類群顯著升高，占48.35%的高豐度。阿克曼菌是一種革蘭氏陰性厭氧菌，它可以利用腸道黏蛋白作為唯一的碳源和氮源進行生長（Macchioneet al.，2019；Zhanget al.，2019），其主要代謝產物為丙酸，因此它與宿主的腸道屏障功能、免疫功能、營養(yǎng)吸收和疾病息息相關（趙凡，李春保，2017；Hagi & Belzer，2021）。韓偉等（2019）在人類蛋白組分析中得知，阿克曼菌可以降解胃腸道黏蛋白的酶，如糖苷酶、硫酸酯酶等，說明阿克曼菌在腸道菌群中扮演著重要角色。之前的研究發(fā)現，阿克曼菌具有恢復腸道屏障功能、抑制腸道病菌、減少內毒素敗血癥的作用（馮澤猛等，2016；Derrienet al.，2017）。推測中華蟾蜍腸道中檢測到的高豐度阿克曼菌對于其腸道內的條件致病菌有一定的抑制作用。同時，阿克曼菌也與肥胖密切相關，肥胖或者超重的孩子腸道中阿克曼菌含量顯著降低，相比之下，正常孩子腸道中的含量則保持了一個較高的水平，在小鼠實驗中也得到了相似的結果（Wang，2021；Wanget al.，2022）。益生菌在水生動物生產中的應用越來越廣泛，可作為添加劑以提高動物生長、免疫和抗病性，作為調水劑改善水質，但是非宿主來源的益生菌在使用過程中存在潛在風險，宿主來源的益生菌更值得關注和挖掘。鑒于阿克曼菌的豐富功能且較為稀缺，后續(xù)可基于培養(yǎng)組學的方法分離中華蟾蜍源阿克曼菌進行評估、基因組測序和動物實驗，探究該種源在動物飼養(yǎng)保護上的應用，豐富我國益生菌資源。