復(fù)方紫云膏制備工藝的優(yōu)化及質(zhì)量評價(jià)

王一帆，熊 雄，李 皓，陳 婷**

(1.昆明醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院暨云南省天然藥物藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500；2.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九二〇醫(yī)院藥劑科，云南 昆明 650032；3.大理大學(xué)藥學(xué)院，云南 大理 671003)

醫(yī)院制劑是對藥品市場的補(bǔ)充與完善，由醫(yī)院制劑室依據(jù)制劑規(guī)范或處方來制備供醫(yī)院臨床使用而市場無銷售的一種特殊制劑[1]，其特點(diǎn)是自配、自用、價(jià)廉，具有周期性并且藥品的不良反應(yīng)較少，費(fèi)用低。醫(yī)院制劑大多是基于中藥處方，有散劑、膏劑、水丸、蜜丸等劑型，方便使用，更容易被患者接受[2]。

軟膏劑攜帶方便，使用便捷，能夠提高患者用藥的依從性[3]。基質(zhì)作為藥材的載體，對藥物有釋藥性，穩(wěn)定性，透皮性[4]。復(fù)方紫云膏采用油性基質(zhì)，性質(zhì)穩(wěn)定，不會易發(fā)生變質(zhì)，涂布于皮膚上形成密閉的油膜，軟化皮膚使其柔軟，不易與水融合。此外軟膏的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)也是一個值得探討的問題，一般的軟膏要考慮外觀性狀、延展性、穩(wěn)定性、刺激性，但對于嚴(yán)重創(chuàng)傷或臨床要求無菌的軟膏需要進(jìn)行無菌檢查。

復(fù)方紫云膏又稱紫草軟膏，是一種中成藥。在《外科正宗》[5]中有記載潤肌膏，主要由麻油、紫草、當(dāng)歸組成，可用于養(yǎng)血、涼血、潤燥，可治禿瘡、白屑、頭皮干枯瘙癢等癥狀。而該醫(yī)院復(fù)方制劑的處方由紫草、白芷、冰片、蜂蠟、麻油組成，有清熱解毒、涼血止痛的作用。用于I、II度燒傷、燙傷、濕疹、手足癬等癥狀[6-8]。其中紫草作為君藥，含有大量的萘醌類色素和多糖類化合物，藥用成分的萘醌類色素包括左旋紫草素、β，β-二甲基丙烯酞紫草素、紫草素、乙酰紫草素等[9-11]，具有活血消腫、去腐生肌、解毒透疹的作用，依據(jù)現(xiàn)在臨床藥理學(xué)研究，紫草的有效成分有抗炎止痛、抑菌抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)作用、護(hù)肝、促凝血以及抑制前列腺素合成等作用[12-14]，但目前臨床上主要用于皮膚方面的疾病。白芷為臣藥，根據(jù)所查文獻(xiàn)白芷在復(fù)方制劑中主要是對濕熱之癥活血排污，治療皮膚風(fēng)邪濕熱所引起的瘙癢[15]。冰片為使藥，氣清香，能透過皮膚屏障，使藥物能夠到達(dá)病癥場所，發(fā)揮最大的藥效。麻油和蜂蠟作為該處方中的油性基質(zhì)，麻油具有生肌潤膚，能緩解濕疹濕瘡，富含維生素E，可抗氧化防治藥液霉變；蜂蠟有一定的解毒作用，讓膏體能在一定時(shí)間內(nèi)快速定型，保持膏體的穩(wěn)定性，對皮膚無刺激性[8，16，17，18]。

復(fù)方紫云膏中紫草的提取方法有很多，如醇提法、油炸法、油浸法、水煮法。本文所研究的提取方法就是采用油炸法[19]，方法簡便快捷能滿足醫(yī)療的需求。本文主要采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以左旋紫草素含量為指標(biāo)，優(yōu)選出最佳的工藝方案來提高紫草素的含量，并對其軟膏劑進(jìn)行鑒別、含量測定、穩(wěn)定性、均勻性、微生物限度檢查[20-21]，保障質(zhì)量，降低成本，提高收率。

1 試驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

UV5紫外分光光度計(jì)(梅特勒托利多儀器(上海)有限公司)、KQ-50E型超聲波清洗器(昆明市超聲儀器有限公司)、DF-1012焦熱式恒溫加熱磁力攪拌器(上海力辰邦西儀器科技有限公司)、溫度計(jì)。BP121S型分析天平(梅特勒托利多儀器(上海)有限公司)、ME5502型天平(梅特勒托利多儀器(上海)有限公司)、HR30-IIA2型生物安全柜(青島海爾特種電器有限公司)、JB-CJ-1000FC型潔凈工作臺(蘇凈集團(tuán)安泰公司)、HPX-9082MBE型電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)、MSL.N型壓力蒸汽滅菌鍋(威海威高海盛醫(yī)用設(shè)備有限公司)。

1.2 試藥和試液

紫草(批號：01-2130101，廠家：安徽芙蓉)；白芷(批號：01-21020102，廠家：安徽毫州)；冰片(批號：200612，廠家：云南林緣香料)；蜂蠟(批號：F210102，廠家：河北徐氏蜂蠟)；麻油(批號：20220323，廠家：云南華輝盛糧油)；左旋紫草對照品(批號：200405，廠家：中國藥品生物制品檢定研究院)；無水乙醇(批號：20220221，廠家：廣東光華科技股份有限公司)；乙酸乙酯 (批號：1606101，廠家：上海申博化工有限公司)；石油醚(批號：200904，廠家：西隴科學(xué)股份有限公司)；香草醛(批號：C11695287，廠家：麥克林)；濃硫酸(批號：202101101，廠家：重慶川東化工)；氫氧化鈉(批號：202101101，廠家：重慶川東化工)；鹽酸(批號：202101101，廠家：重慶川東化工)；冰片對照品(批號：200303，廠家：中國藥品生物制品檢定研究院)；復(fù)方紫云膏(批號：220409、220410、220411)。

1.3 菌種

金黃色葡萄球菌(批號：G0042DX，廠家：廣東黃凱微生物有限公司)、銅綠假單胞菌(批號：G0055DX，廠家：廣東黃凱微生物有限公司)、大腸埃希菌(批號：G0039DX，廠家：廣東黃凱微生物有限公司)。

1.4 培養(yǎng)基

胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(批號：1096841)、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(批號：1105961)、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(批號：1106141)、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基(批號：1105961)、溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基(批號：1081171)、pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液(批號：317N031)，以上材料均來自廣東黃凱微生物有限公司。培養(yǎng)基的適用性檢查和控制菌檢查的適用性符合2020版《中國藥典》(四部)。

2 方法

2.1 現(xiàn)復(fù)方紫云膏制備工藝

將麻油升溫至 120 ℃ 加入蜂蠟使其熔化，加入白芷，調(diào)至文火并維持此溫度待至白芷焦黃，加入紫草，繼續(xù)用維持微火加熱，然后置于恒溫箱中浸漬時(shí)間，趁熱用四層紗布濾過，等冷卻至 50 ℃ 左右，加入冰片攪拌至冷即可。

2.2 復(fù)方紫云膏中左旋紫草素含量測定

按照《中國藥典》2020版一部中紫草項(xiàng)下含量測定，使用紫外分光光度計(jì)測定羥基萘醌總色素的含量，并以左旋紫草素記。

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密稱取左旋紫草素對照品 5 mg 置于 50 mL 容量瓶中，加入無水乙醇稀釋定容，搖勻。分別取 1、2、3、4、5 mL 于 25 mL 的量瓶中，加無水乙醇稀釋定容，搖勻。然后根據(jù)左旋紫草在 519 nm 處有紫外吸收，以無水乙醇作為空白對照，分別測定上述溶液的吸光度，并以吸光度為縱坐標(biāo)，左旋紫草素濃度為橫坐標(biāo)繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線并考察線性關(guān)系。結(jié)果見圖1。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.2 供試品溶液的制備

精密稱定供試品 1 g，置于三角瓶中，精密量取無水乙醇 50 mL，超聲溶解，在冰箱內(nèi)冷藏過夜，搖勻，過濾，即得。

2.2.3 供試品的含量測定

照紫外分光光度法，在 519 nm 處測定供試品的吸光度，并將吸光度帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)，計(jì)算出復(fù)方紫云膏的含量，按左旋紫草素(C16H16O5)的吸收系數(shù)(E1% 1 cm)為242計(jì)算。

2.2.4 復(fù)方紫云膏中紫草素的含量計(jì)算公式

平均含量=(C1+C2)÷2

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

根據(jù)處方先對文中的“文火微火維持此溫度”進(jìn)行試驗(yàn)，以110～90 ℃、120～90 ℃、130～90 ℃、140～90 ℃、150～90 ℃ 的起始溫度作為考察，然后又對提取工藝中單因素進(jìn)行研究：以提取溫度(100、110、120、130、140 ℃)、提取時(shí)間(15、30、45、60、75、90 min)、 浸漬時(shí)間(0、6、12、18、24、30 h)分別進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，考察3個因素對復(fù)方紫云膏中左旋紫草素的含量影響。

2.4 正交實(shí)驗(yàn)

在單因素的基礎(chǔ)上以提取溫度、提取時(shí)間、浸漬時(shí)間為研究對象，擬定三因素三個水平，建立L9(34)的正交表，以9組提取條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，見表1。

表1 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)水平表

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

以左旋紫草素對照品的濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，得回歸方程式：y=0.0949x+0.0017，R2=0.9993線性關(guān)系較好，線性范圍為：0.004～0.020 mg/mL，見圖1。

3.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.2.1 提取溫度對復(fù)方紫云膏中左旋紫草素的影響

根據(jù)處方提取溫度條件進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所測定的左旋紫草素的含量都沒有達(dá)到規(guī)范所要求的含量。當(dāng)溫度為90～120 ℃ 時(shí)，含量是最高的但依舊沒有到達(dá) 1.3 mg/g，結(jié)果如圖2。

圖2 提取溫度(預(yù)實(shí)驗(yàn))

通過查閱文獻(xiàn)及預(yù)實(shí)驗(yàn)，重新設(shè)置溫度。隨著溫度的升高，左旋紫草素含量逐漸的升高，在 130 ℃ 時(shí)含量達(dá)到最大值。但在 140 ℃ 以上隨著溫度的升高含量急劇降低，說明有效成份發(fā)生了改變，因此確定120～140 ℃ 作為設(shè)計(jì)水平，結(jié)果如圖3。

圖3 提取溫度

3.2.2 提取時(shí)間對復(fù)方紫云膏中左旋紫草素的影響

當(dāng)提取時(shí)間在30～90 min 的范圍內(nèi)左旋紫草素的含量高，結(jié)果如圖4，因此確定此時(shí)間段作為正交試驗(yàn)分析的因素水平。

圖4 提取時(shí)間

3.2.3 浸漬時(shí)間對復(fù)方紫云膏中左旋紫草素的影響

隨著浸澤時(shí)間的增加，左旋紫草素的含量逐漸的增加，結(jié)果如圖5，確定6～24 h 的浸澤范圍為浸澤時(shí)間段進(jìn)一步考察。

圖5 浸漬時(shí)間

3.3 正交試驗(yàn)結(jié)果與方差分析

按照“1.5.1”和“1.5.2”中復(fù)方紫云膏的制備和測定方法，測定各項(xiàng)提取條件左旋紫草的含量，見表2。

表2 L(34)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果

由正交實(shí)驗(yàn)表2知：從極差R可得出，影響復(fù)方紫云膏中左旋紫草素含量的主次因素為C>A>B，最佳的提取工藝方案是A2B2C3，即提取溫度 130 ℃、提取時(shí)間 1 h、浸漬時(shí)間 24 h。是根據(jù)藥學(xué)理論及經(jīng)濟(jì)學(xué)，為了節(jié)約時(shí)間和成本，在實(shí)際應(yīng)用時(shí)浸漬時(shí)間可選用 12 h。從方差分析表3可知浸澤時(shí)間和提取溫度的P<0.05，具有顯著性，為主要的影響因素；提取時(shí)間的P>0.05，無顯著性差異。

表3 方差分析表

3.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

根據(jù)上述的提取條件，在潔凈間平行進(jìn)行三次驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，按照紫外分光光度法，供試品溶液的制備：照“2.2.2”，供試品溶液的含量測定：照“2.2.3 ”進(jìn)行測定，實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如表4。

表4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4 質(zhì)量檢驗(yàn)

4.1 檢驗(yàn)項(xiàng)目

4.1.1 性狀

本品為紫紅色半固體，有清涼香氣。

4.1.2 鑒別

紫草的鑒別 分別取三批樣品約 2 g，加乙醇 5 mL，振搖，放置后液體顯紅色，加氫氧化鈉試液5滴，液體變?yōu)樗{(lán)色，再加稀鹽酸使溶液呈酸性后，液體由藍(lán)變成紅，本項(xiàng)結(jié)論3批樣品中都含有紫草。

冰片的鑒別 分別取3批樣品約 20 g，進(jìn)行微晶升華，得到的白色升華物后，加無水乙醇 1 mL 使其溶解搖勻，作為供試品溶液。另精密稱取冰片對照品 10 mg，加無水乙醇 1 mL 制成每 1 mL 含 10 mg 的溶液，作為對照品溶液。按薄層色譜法，用毛細(xì)管吸取上述兩種溶液各 10 uL 分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-石油醚[沸程為60～90 ℃](2∶19)為展開劑，將薄層版放入展開缸中展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，在 105 ℃ 加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，本項(xiàng)結(jié)論三批樣品中都含有冰片。

4.1.3 含量測定

依據(jù)“3.3”的提取工藝條件，“2.1”制備方法制備3批藥品，按2.2.3項(xiàng)分別測定含量，結(jié)果如表4，質(zhì)量分?jǐn)?shù)都大于1.3(mg/g)。本項(xiàng)結(jié)論三批樣品符合質(zhì)量要求。

4.2 微生物限度檢查

4.2.1 微生物計(jì)數(shù)

1)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：

培養(yǎng)基準(zhǔn)備：按用量均以 121 ℃ 滅菌 15 min 備用。

試驗(yàn)材料準(zhǔn)備：均以 121 ℃ 滅菌 30 min 備用。

2)供試液制備：

從樣品中分別取 10 g，加入滅菌含 20 mL 的十四烷基異丙酯及玻璃珠的錐形瓶中，混勻，加入pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液至 100 mL 制成1∶10的供試液。

3)計(jì)數(shù)方法：

平皿法中的傾注法

4)陰性對照：

用無菌的pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替供試液，照供試液同法進(jìn)行操作，培養(yǎng)，計(jì)數(shù)。

5)凈化工作臺沉降菌動態(tài)檢測：

將4個胰酪大豆胨瓊脂平皿以無菌方式帶入操作室，在操作臺上下左右各放一個，在微生物限度檢查的同時(shí)，打開蓋子，放置后蓋好皿蓋，置30～35 ℃ 培養(yǎng) 48 h。統(tǒng)計(jì)平板上菌落數(shù)：上0個，左0個，下0個，右0個，平均0個。(應(yīng)不超過1個)

6)表面微生物檢測：

將4個胰酪大豆胨瓊脂平皿以無菌方式帶入操作室。待試驗(yàn)結(jié)束后，取2個瓊脂平皿，在操作臺左右各放一個，打開蓋子，培養(yǎng)基表面與操作臺直接接觸，均勻按壓接觸碟底板，確保全部瓊脂表面與取樣點(diǎn)表面均勻充分接觸，接觸約 10 s，再將蓋子蓋上，置30～35 ℃ 培養(yǎng) 48 h。統(tǒng)計(jì)平板上菌落數(shù)：左0個，右0個，平均0個。(應(yīng)不超過1個)

另取2個胰酪大豆胨瓊脂平皿，打開蓋子后，單手五指按壓培養(yǎng)基表面，確保手與全部瓊脂表面均勻充分接觸 10 s，再蓋上蓋子，雙手分別取后置置30～35 ℃ 培養(yǎng) 48 h。取出檢查，統(tǒng)計(jì)平板上菌落數(shù)：左0個，右0個，平均0個。(應(yīng)不超過1個)

本項(xiàng)結(jié)論潔凈間的表面菌和沉降菌都符合要求。

7)培養(yǎng)與計(jì)數(shù)：

取上述供試液 1 mL 于無菌的平皿中，加入提前滅菌的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)15～20 mL，混勻，置于 35 ℃ 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 5 d，觀察并計(jì)算菌落數(shù)。

取供試液 1 mL 于無菌平皿中，加入提前滅菌好的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基15～20 mL，混勻凝固，置于 25 ℃ 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 7 d，觀察并計(jì)算菌落數(shù)。

另外取上述“(4)”陰性對照液同上述操作。結(jié)果見表5。

表5 微生物計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4.2.2 控制菌檢驗(yàn)方法

根據(jù)《中國藥典》2020版四部通則1107規(guī)定，皮膚給藥制劑不得檢測出金色葡萄球菌和銅綠假單胞菌。

1)陽性對照組：

35 ℃ 連續(xù)培養(yǎng) 22 h 的銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌用pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液制備成每 1 mL 含菌量不大于100cfu的菌液。取上述菌液 1 mL 加入 9 mL pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液中混勻后加入 100 mL 的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基在 35 ℃ 中培養(yǎng)18～24 h。

2)供試液組：

取“上述2.1.5.1中(2)”的溶液 10 mL，加入胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基至 100 mL，制成1∶10供試液。

3)陰性對照組：

用稀釋液代替菌液進(jìn)行制備方法同上。

4)增菌培養(yǎng)：

過程見表6。P(5)選擇和分離培養(yǎng)

表6 增菌培養(yǎng)

金色葡萄球菌：取上述增菌液劃線接種到甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基，在 35 ℃ 的培養(yǎng)基中培養(yǎng) 24 h，觀察并判斷菌種。

銅綠假單胞菌：取上述增菌液劃線并接種到溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基，在 35 ℃ 的培養(yǎng)基中培養(yǎng) 24 h，觀察并判斷菌種。結(jié)果見表7。

表7 控菌檢查結(jié)果

由上可得3批復(fù)方紫云膏符合要求。

4.3 裝量差異

藥品在進(jìn)行質(zhì)量檢驗(yàn)的過程中也包括重量差異，該復(fù)方制劑采用的是最低裝量檢驗(yàn)法，結(jié)果見表8。

表8 裝量差異

本項(xiàng)結(jié)論三批藥品的裝量都大于95%，符合規(guī)定。(2020版中國藥典(四部)通則∶至 50 g 規(guī)定不少于標(biāo)示的95%)

5 討論

該醫(yī)院制劑復(fù)方紫云膏采用了較為傳統(tǒng)的油炸法進(jìn)行提取，雖然增加了藥物脂溶性成分的溶出，在臨床上取得了較好的療效。但是存在著油炸的過程溫度較高的問題，使制備過程中不穩(wěn)定性因素增多，不容易控制。紫草作為主藥，有效成分會隨著油溫的增加而減少，尤其實(shí)在 140 ℃ 以上，左旋紫草的含量減少至55%。本實(shí)驗(yàn)對該復(fù)方制劑的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，減少有效成分的損失。最后實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示最佳的提取工藝為提取溫度 130 ℃，提取時(shí)間為 30 min，浸漬時(shí)間為 24 h，然后根據(jù)此工藝條件，平行制備3批，對工藝進(jìn)行驗(yàn)證后，表明提取工藝穩(wěn)定性優(yōu)良，可行性高，重復(fù)性好，符合醫(yī)院制劑復(fù)方紫云膏的質(zhì)量要求，可以為其生產(chǎn)提供參考。

此外質(zhì)量檢驗(yàn)在醫(yī)院制劑中仍然是非常值得關(guān)注的問題，醫(yī)院制劑有其特殊性，是藥品生產(chǎn)企業(yè)無法代替的。為保證自制制劑的質(zhì)量，加強(qiáng)檢驗(yàn)是有效的手段之一[22]。