西蘭花總黃酮提取工藝優(yōu)化研究*

文 瑤

(廣東藥科大學(xué) 藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

西蘭花(BrassicaoleraceaL.var.italica，Plenck)原產(chǎn)于地中海東部沿岸邊，是一種十字花科植物[1]。西蘭花富含維生素、黃酮和多酚等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，具有降血糖、抗氧化等功能[2]，所以受到越來(lái)越多的消費(fèi)者的青睞。因此，對(duì)西蘭花展開深入研究有非常重要的意義。國(guó)內(nèi)外對(duì)西蘭花總黃酮的提取方法主要有：乙醇回流提取[3]、超聲輔助法提取[4]等。其中，超聲波輔助法提取西蘭花總黃酮是一種較綠色、新穎的提取工藝，具有提取效率高、操作方便且溶劑用量較少的優(yōu)點(diǎn)[5]。因此，本實(shí)驗(yàn)采用超聲輔助提取法提取西蘭花總黃酮，為西蘭花后續(xù)更好地開發(fā)利用其潛在的藥用價(jià)值提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

西蘭花粉(江蘇省)；無(wú)水碳酸鈉(天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司)；乙醇(天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司)；NaOH(天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司)；亞硝酸鈉(天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司)；硝酸鋁(天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

參考江石平[6]等的實(shí)驗(yàn)方法配制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色法，在 510 nm 處測(cè)吸光度。以蘆丁質(zhì)量濃度為橫軸，以吸光度為縱軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到蘆丁的回歸方程為Y=3.3381X+0.0385，R2=0.9992。由此可得西蘭花總黃酮提取率的計(jì)算公式：

ρ為西蘭花樣品溶液中總黃酮的質(zhì)量濃度，mg/mL；V為西蘭花總黃酮溶液的體積，mL；D為西蘭花溶液的稀釋倍數(shù)；m為西蘭花粉的質(zhì)量，g。

1.2.2 單因素試驗(yàn)

以西蘭花總黃酮提取率為指標(biāo)，采用控制變量法分別考察超聲溫度(40、50、60、70、80 ℃)、液料比(10、15、20、25、30 mL/g)、超聲功率(120、160、200、240、280 W)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(50%、60%、70%、80%、90%)和超聲時(shí)間(30、40、50、60、70 min)對(duì)西蘭花總黃酮提取率的影響。

1.2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化西蘭花總黃酮的提取工藝方法

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、超聲時(shí)間(B)、料液比(C)為自變量，西蘭花總黃酮提取率為響應(yīng)值，利用Box-Behnken中心設(shè)計(jì)方法進(jìn)行因素水平設(shè)計(jì)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 超聲溫度的選擇

如圖1所示，隨著提取溫度的升高，西蘭花總黃酮的提取率逐漸增大， 60 ℃ 時(shí)，提取率達(dá)到最大。當(dāng)提取溫度超過 60 ℃ 后，提取率反而有所下降，造成這種現(xiàn)象可能是提取溫度太高導(dǎo)致乙醇揮發(fā)，進(jìn)而料液比增大，導(dǎo)致雜質(zhì)溶出量增加，最終總黃酮提取量減少。故選 60 ℃ 作為響應(yīng)面中心點(diǎn)。

圖1 超聲溫度對(duì)西蘭花總黃酮提取率的影響

2.1.2 超聲時(shí)間的選擇

如圖2所示，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，西蘭花總黃酮的提取率先增大后減少。在提取時(shí)間為 60 min 時(shí)，提取率最高，之后繼續(xù)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，提取率反而出現(xiàn)下降的趨勢(shì)，這可能是提取時(shí)間過長(zhǎng)造成黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)被破壞，從而導(dǎo)致提取率降低。故選擇 60 min 為響應(yīng)面中心點(diǎn)。

圖2 超聲時(shí)間對(duì)西蘭花總黃酮提取率的影響

2.1.3 料液比的選擇

如圖3所示，隨著液料比的逐步增大，西蘭花總黃酮的提取率出現(xiàn)先增大后降低的趨勢(shì)，在液料比為25∶1(mL/g)時(shí)為最佳。繼續(xù)加大液料比反而出現(xiàn)提取率降低的現(xiàn)象，這可能是與此時(shí)黃酮類化合物已基本溶解，若繼續(xù)增加液料比，提取率不僅不會(huì)有顯著的增加，反而會(huì)有降低的趨勢(shì)，甚至出現(xiàn)浪費(fèi)溶劑的現(xiàn)象。故選擇25∶1(mL/g)為響應(yīng)面中心點(diǎn)。

圖3 液料比對(duì)西蘭花總黃酮提取率的影響

2.1.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)的選擇

如圖4所示，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，西蘭花總黃酮的提取率出現(xiàn)先增大后下降的趨勢(shì)，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)，提取率達(dá)到最大值，這可能是60%乙醇的溶液極性與黃酮類化合物的極性相當(dāng)，故選擇60%乙醇為響應(yīng)面中心點(diǎn)。

圖4 乙醇濃度對(duì)西蘭花總黃酮提取率的影響

2.1.5 超聲功率的選擇

如圖5所示，隨著超聲功率的逐漸增大，西蘭花總黃酮的提取率出現(xiàn)先增大后降低的現(xiàn)象。在超聲功率為 240 W 時(shí)達(dá)到最大值，超過 240 W 時(shí)提取率出現(xiàn)降低的趨勢(shì)，這原因可能是過高的超聲功率使其黃酮類成分被破壞分解，從而導(dǎo)致提取率出現(xiàn)下降的趨勢(shì)。因此，選擇 240 W 為響應(yīng)面中心點(diǎn)。

圖5 超聲功率對(duì)西蘭花總黃酮提取率的影響

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化

2.2.1 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析

依據(jù)Box-Benhnken法，經(jīng)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析后，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比和超聲時(shí)間3個(gè)因素作為自變量，西蘭花總黃酮的提取率作為因變量，選擇三因素三水平進(jìn)行響應(yīng)面分析。得到優(yōu)化實(shí)驗(yàn)共17組，詳見表1。多元回歸擬合結(jié)果詳見表2。

表1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果表

表2 回歸分析結(jié)果表

通過Design Expert 13.0.1.0 軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行二元回歸分析，得到以西蘭花總黃酮得率為響應(yīng)值的回歸方程：即總黃酮得率Y=2.66-0.0616A-0.0764B-0.1006C+0.0342AB+0.00313AC+0.0019BC-0.1904A2-0.1496B2-0.1283C2，回歸系數(shù)R2=0.9870，說明該模型擬合度良好，模型的F值為255.78、P<0.0001，說明該模型極顯著；失擬項(xiàng)P值為0.5436>0.05，影響不顯著，證明非試驗(yàn)因素對(duì)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響不大。實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，若F值越大，P值越小，即該因素對(duì)響應(yīng)值影響越大，反之則表示該因素對(duì)響應(yīng)值影響越小，故根據(jù)表2中的F值和P值可知，三因素對(duì)西蘭花總黃酮的提取率的影響大小為液料比>超聲時(shí)間>乙醇體積分?jǐn)?shù)。

2.2.2 響應(yīng)面交互作用分析

依據(jù)回歸模型作出相應(yīng)的響應(yīng)曲面圖，響應(yīng)面坡度越陡峭表示兩因素交互作用越大，反之則表示兩因素交互作用不顯著。等高線呈橢圓形，則表示兩因素交互作用影響較大，否則反之。由圖6～8可見，超聲時(shí)間和乙醇體積分?jǐn)?shù)的交互影響最大，其次是乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比的交互影響，再其次是超聲時(shí)間和料液比二者的交互影響。

圖6 乙醇體積分?jǐn)?shù)與超聲時(shí)間的交互作用對(duì)西蘭花總黃酮提取率的影響

圖7 乙醇體積分?jǐn)?shù)與液料比的交互作用對(duì)西蘭花總黃酮提取率的影響

圖8 液料比與超聲時(shí)間的交互作用對(duì)西蘭花總黃酮提取率的影響

2.3 比較實(shí)驗(yàn)分析

通過響應(yīng)面軟件分析得到，料液比為1∶23(g/mL)、乙醇體積分?jǐn)?shù)為54%、超聲時(shí)間 53 min。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得到的總黃酮提取率為 2.69 mg/mL，預(yù)測(cè)值為 2.54 mg/mL，兩者較為接近，說明此條件下提取西蘭花總黃酮比較可靠且具有一定的參考價(jià)值。普通水提法得到的總黃酮提取率為 1.06 mg/mL，表明用超聲輔助法提取西蘭花總黃酮比普通水提法的提取率更高，具有一定的可行性。

3 結(jié)論

本文使用超聲輔助法提取西蘭花總黃酮，單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果為超聲溫度 60 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)度60%、料液比1∶25(g/mL)、超聲功率 240 W 和超聲時(shí)間 60 min。通過響應(yīng)面分析法確定西蘭花總黃酮的最佳提取工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)54%、料液比1∶23(g/mL)、超聲時(shí)間 53 min。通過驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得到優(yōu)化后的提取率為 2.69 mg/g，普通水提為 1.06 mg/g。實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)西蘭花總黃酮進(jìn)一步的深入研究和開發(fā)應(yīng)用具有很大的實(shí)用價(jià)值。