PBMC中磷酸二酯酶6C的表達水平與2型糖尿病及血糖血脂異常的關(guān)系*

徐 建,趙 樂,黃瑞賢,張晶晶,陳 浩,陳學(xué)琴,丁元林,孔丹莉

廣東醫(yī)科大學(xué)流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計學(xué)教研室,廣東東莞 523808

2型糖尿病(T2D)是一種以機體糖耐量異常和胰島素抵抗為主要特征的慢性高血糖癥,其診斷和防治效果還尚未達到較為理想的狀態(tài)[1]。WHO指出,2021年全球已超過4.2億糖尿病患者,預(yù)計到2030年將增至5.78億,并且約有一半患有T2D的成年人未被診斷[2]。T2D也是我國主要的糖尿病類型(占糖尿病的90%以上),其未診斷人數(shù)比例也較高,并且肥胖和超重人群糖尿病患病率顯著增加,以及糖尿病控制不佳會增加發(fā)生嚴(yán)重并發(fā)癥的風(fēng)險[3]。研究發(fā)現(xiàn),磷酸二酯酶6(PDE6)在視桿細胞和視錐細胞的光傳導(dǎo)中起著至關(guān)重要的作用,其基因突變會導(dǎo)致各種各樣的視網(wǎng)膜退行性疾病[4],并且糖尿病是糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)的主要危險因素[5],以及血中PDE6的亞基PDE6C的mRNA表達水平在DR患者中顯著下調(diào)[6],這提示PDE6可能與T2D的發(fā)生發(fā)展有關(guān),但目前PDE6與T2D之間的相關(guān)研究還尚未充分報道。因此,本研究旨在探討外周血單個核細胞(PBMC)中PDE6相關(guān)基因表達水平與T2D及其血糖血脂之間的關(guān)系,為今后完善T2D防治措施和深入開展相關(guān)研究提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1T2D芯片表達數(shù)據(jù)的獲取 通過GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds)獲取同時含有T2D患者和健康對照人群PBMC的mRNA芯片表達數(shù)據(jù),并排除2組中研究對象均小于5例或T2D患者合并其他嚴(yán)重疾病的芯片數(shù)據(jù),如視網(wǎng)膜退行性疾病、糖尿病酮癥酸中毒、嚴(yán)重感染、嚴(yán)重心腦血管疾病、嚴(yán)重肝腎功能障礙或惡性腫瘤等。

1.2芯片數(shù)據(jù)的預(yù)處理和PDE6相關(guān)基因表達數(shù)據(jù)的提取 首先,對每個納入的芯片數(shù)據(jù)進行標(biāo)準(zhǔn)化和數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化(如log2對數(shù)轉(zhuǎn)化),并根據(jù)各芯片數(shù)據(jù)GPL號中注釋信息將基因探針轉(zhuǎn)換成基因名,然后通過Gene數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene) 檢索PDE6相關(guān)基因并進行文獻回顧,最終確定和提取PDE6A、PDE6B、PDE6C、PDE6D、PDE6G和PDE6H[7-8]的基因表達數(shù)據(jù)納入本研究。

1.3納入研究基因的meta分析和T2D潛在關(guān)鍵基因的篩選 采用R語言進行meta分析、森林圖繪制、Egger檢驗和敏感性分析。其中,采用標(biāo)準(zhǔn)化均數(shù)差(SMD)作為合并效應(yīng)量。通過I2統(tǒng)計量評價研究間的異質(zhì)性,若I2<50%,則選用固定效應(yīng)模型(FEM)進行效應(yīng)量的合并,反之則選用隨機效應(yīng)模型(REM)[9]。采用Egger檢驗和漏斗圖判斷是否存在發(fā)表偏移。敏感性分析則采用逐一剔除納入芯片研究的方法(即逐一剔除法)進行效應(yīng)量合并,并比較FEM和REM的合并效應(yīng)量,若合并效應(yīng)量方向發(fā)生改變,則提示結(jié)果不穩(wěn)健[9]。最后,將在meta分析或敏感性分析中差異有統(tǒng)計學(xué)意義的基因篩選為T2D潛在關(guān)鍵基因。

1.4T2D潛在關(guān)鍵基因與血糖血脂指標(biāo)的相關(guān)分析以及其在其他PBMC芯片數(shù)據(jù)中的差異分析 通過提取芯片數(shù)據(jù)中的血糖血脂指標(biāo)數(shù)據(jù),包括空腹血糖(FBG)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、甘油三酯(TG)和總膽固醇(TC),然后分別與T2D潛在關(guān)鍵基因進行兩變量間的相關(guān)分析。眾多研究已指出,肥胖、胰島素抵抗(IR)和空腹血糖異常(IGF)影響著T2D的發(fā)生發(fā)展[10-12]。為進一步了解PDE6C在肥胖、胰島素抵抗和空腹血糖異常中的表達情況,4個芯片數(shù)據(jù)(GSE87005、GSE19790、GSE21321和GSE32575)中的PDE6C mRNA表達數(shù)據(jù)被納入研究,并采用上述同樣的方法對納入研究的芯片數(shù)據(jù)進行數(shù)據(jù)預(yù)處理和T2D潛在關(guān)鍵基因數(shù)據(jù)的提取,然后進行相應(yīng)的差異分析。

2 結(jié) 果

2.1本研究納入芯片數(shù)據(jù)的基本情況 本研究共納入8個PBMC芯片數(shù)據(jù),包括健康人群、IS、IR、肥胖、空腹血糖異常(IFG)和T2D人群,共計155個研究對象,見表1。

表1 本研究納入PBMC的mRNAs芯片數(shù)據(jù)的基本情況

2.2T2D組和健康對照組PDE6相關(guān)基因的meta分析 本次meta分析納入了5個芯片數(shù)據(jù)(GSE163980、GSE156993、GSE193626、GSE23561和GSE21321)的67例研究對象(T2D組33例,健康對照組34例)。分析結(jié)果顯示,與健康對照組相比,僅PDE6C的下調(diào)表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義[SMD和95%CI為-0.72(-1.24,-0.19),P<0.05],見表2、圖1。通過Egger法檢驗發(fā)現(xiàn),僅PDE6H存在發(fā)表偏倚(P<0.05),見表2,其中PDE6C的漏斗圖見圖2。另外,敏感性分析發(fā)現(xiàn),經(jīng)逐一剔除GSE156993和GSE21321后,PDE6C的合并效應(yīng)不再穩(wěn)健,見圖3;其他結(jié)果均穩(wěn)健。上述結(jié)果提示PDE6C可能是T2D潛在關(guān)鍵基因。

圖1 T2D組和健康對照組PDE6C的森林圖結(jié)果

圖2 PDE6C的漏斗圖結(jié)果

圖3 T2D組和健康對照組PDE6C的敏感性分析結(jié)果

表2 T2D組和健康對照組PBMC中PDE6相關(guān)基因表達的meta分析結(jié)果

2.3臨床資料的統(tǒng)計描述和差異分析以及與PDE6C之間的相關(guān)分析 在本研究中,GSE156993提供了臨床資料的相關(guān)數(shù)據(jù),經(jīng)差異分析和相關(guān)分析發(fā)現(xiàn),T2D組中的FPG、HbA1c、TC和TG水平均高于健康對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);并且FPG、HbA1c、TC和TG均與PDE6C呈負相關(guān)關(guān)系(Pearson相關(guān)系數(shù)依次為-0.835、-0.817、-0.759和-0.755,P<0.05),見表3。上述結(jié)果表明T2D中血糖血脂水平升高可能與PBMC中PDE6C低表達水平相關(guān)。

表3 GSE156993芯片提取臨床數(shù)據(jù)的差異分析和與PDE6C相關(guān)分析的結(jié)果

2.4肥胖、胰島素抵抗和空腹血糖異常人群PBMC中PDE6C的表達情況 4個芯片數(shù)據(jù)(GSE87005、GSE19790、GSE21321和GSE32575)中的PDE6C mRNA表達數(shù)據(jù)被納入該部分研究,通過一系列差異分析發(fā)現(xiàn),無論機體是否存在IR,與非肥胖者相比,肥胖者PDE6C表達僅呈上調(diào)趨勢(P>0.05),見圖4A、B和C;而肥胖個體在減肥手術(shù)(BS)治療后PDE6C的表達顯著下調(diào)(P<0.05),見圖4D,但BS并不顯著下調(diào)肥胖T2D個體中PDE6C的表達(P=0.081),見圖4E。此外,PDE6C在健康對照組、空腹血糖異常(IFG)和T2D組中呈不斷下調(diào)趨勢,但在3組間的兩兩比較中,PDE6C僅在健康對照組與T2D組之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.011),見圖4F。因此,上述結(jié)果提示機體在從正常狀態(tài)到T2D狀態(tài)的過程中,PBMC中PDE6C表達可能不斷下調(diào),并且減肥手術(shù)會使PBMC中PDE6C的表達下調(diào),但T2D中的PDE6C可能已處于一種較穩(wěn)定的低表達狀態(tài)。

注:A、D數(shù)據(jù)來源為GSE32575;B、C數(shù)據(jù)來源為GSE87005;F數(shù)據(jù)來源為GSE21321。

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn),PDE6在視桿細胞和視錐細胞的異常水平會導(dǎo)致視網(wǎng)膜病變[4],并且糖尿病會增加發(fā)生視網(wǎng)膜病變的風(fēng)險[5],但是目前PDE6與T2D和(或)DR之間的關(guān)系還尚未完全清楚,以及PDE6在PBMC中的表達水平的相關(guān)研究還未見充分報道。因此,本研究通過T2D、肥胖、IR和IFG等多個GEO芯片數(shù)據(jù)綜合探討了PDE6與T2D之間的關(guān)系。

首先,通過meta分析發(fā)現(xiàn),與健康對照組相比,PDE6A、PDE6B、PDE6D、PDE6G和PDE6H在T2D患者PBMC中的mRNA表達水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),僅PDE6C可能在T2D患者中顯著下調(diào)表達。此外,BUTT等[6]在研究中指出,血中PDE6C的mRNA水平在DR患者中顯著下調(diào)。雖然PDE6C主要在視錐細胞中表達并參與PDE6的合成和光傳導(dǎo)作用[7],但已有研究指出視網(wǎng)膜特異性標(biāo)志物表達情況可能與外周血中的表達情況一致,如視紫紅質(zhì)[13]和RPE65[14]。因此,這些結(jié)果暗示血中PDE6C表達下調(diào)可能反映了視錐細胞的減少或功能異常,并且可能與DR有關(guān)。

其次,目前已有研究指出視網(wǎng)膜病變嚴(yán)重程度與糖尿病病程、隨機血糖和HbA1c呈正相關(guān)關(guān)系,并且肥胖、胰島素抵抗、空腹血糖異常和減肥手術(shù)等均會影響T2D的發(fā)生發(fā)展[11-12,15-16]。因此,本研究初步探討了PBMC中PDE6C在T2D發(fā)生發(fā)展過程中的大致變化情況。研究發(fā)現(xiàn),FPG、HbA1c、TC和TG均與PBMC中PDE6C表達水平呈負相關(guān)關(guān)系,并且機體在從健康、IFG到T2D狀態(tài)的過程中,PBMC中PDE6C的mRNA表達水平可能逐漸下調(diào),并在T2D階段出現(xiàn)顯著下調(diào)表達。

另外,研究已表明,減肥手術(shù)治療能改善T2D狀態(tài)[15-16]。在本研究中指出,相比于非肥胖者,無論機體是否存在IR,肥胖者PDE6C表達水平變化差異均無統(tǒng)計學(xué)意義;但BS治療后會下調(diào)PBMC中PDE6C的mRNA表達,這提示BS后可能只會引起短暫的PDE6C表達下調(diào);相反,BS治療卻對肥胖T2D患者PDE6C的表達影響較小,這也可能提示PDE6C在T2D患者PBMC中已處于一種較穩(wěn)定的低表達狀態(tài)。

最后,根據(jù)上述結(jié)果可表明,PBMC中長期出現(xiàn)PDE6C表達下調(diào)可能提示機體存在較大的T2D發(fā)生風(fēng)險。然而,由于本研究尚不能獲得較為完整的數(shù)據(jù),并且分析結(jié)果來源于多個芯片數(shù)據(jù),目前暫無法充分評估不同芯片研究的異質(zhì)性。

綜上所述,PBMC中下調(diào)表達的PDE6C可能與T2D及血糖血脂水平異常有關(guān),PDE6C可能是一種與T2D有關(guān)的生物標(biāo)志物。但本研究仍存在不足之處,在今后還需相應(yīng)的體內(nèi)外實驗和多中心臨床研究來證實本研究結(jié)論的可靠性。