糖尿病足潰瘍感染患者創(chuàng)面Bcl-2、PDGFR-α表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系研究

向 林,董 靖,劉 敏,向光大

中部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院內(nèi)分泌科,湖北武漢 430070

糖尿病足潰瘍(DFU)是糖尿病患者嚴(yán)重慢性并發(fā)癥之一,據(jù)統(tǒng)計(jì),約25%的糖尿病患者會(huì)發(fā)生DFU[1]。同時(shí)DFU也是導(dǎo)致糖尿病患者截肢的主要原因,在所有非創(chuàng)傷性截肢病例中,DFU大約占40%左右[2]。此外,DFU還會(huì)增加患者心腦血管疾病以及死亡風(fēng)險(xiǎn),給患者及其家庭帶來沉重的心理和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[3]。感染作為DFU患者創(chuàng)面愈合遷延不愈、反復(fù)發(fā)生的重要原因之一,也是導(dǎo)致DFU病情加重、致殘、致死的主要原因。研究表明,相較于未感染的DFU患者,伴感染患者的截肢風(fēng)險(xiǎn)增高15.5倍[4]。DFU患者易發(fā)生感染的主要原因在于這些患者多伴有神經(jīng)病變、血管病變,前者可導(dǎo)致痛溫覺減退、足部畸形,增加皮膚破潰風(fēng)險(xiǎn),引發(fā)感染;后者可導(dǎo)致足部干燥破裂,病原菌入侵引發(fā)感染[5]。臨床認(rèn)為DFU感染的發(fā)生機(jī)制可能與局部高血糖、炎癥反應(yīng)失衡、生長(zhǎng)因子及其受體表達(dá)異常等有關(guān)[6]。血小板源生長(zhǎng)因子(PDGFR)是一種堿性多肽生長(zhǎng)因子,只有與靶細(xì)胞膜上的特異性受體PDGFR-α結(jié)合后才能發(fā)揮作用,并直接或間接參與創(chuàng)面愈合的調(diào)控[7];B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2是一種原癌基因,該基因與胰島B細(xì)胞的凋亡相關(guān)[8],可通過增加其凋亡數(shù)量,導(dǎo)致高血糖的出現(xiàn),進(jìn)而間接影響創(chuàng)面愈合。但目前有關(guān)于Bcl-2、PDGFR-α的研究多集中于小鼠模型或人皮膚潰瘍,對(duì)于Bcl-2、PDGFR-α表達(dá)與DFU愈合的關(guān)系鮮有報(bào)道。故本研究旨在探究DFU感染患者創(chuàng)面Bcl-2、PDGFR-α表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取本院2019年3月至2021年6月診治的125例DFU患者作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)符合DFU診斷指南[9];(2)無血液、自身免疫性相關(guān)疾病;(3)患者臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)非糖尿病引起的潰瘍;(2)潰瘍組織存在明顯壞死、骨髓炎;(3)入組前1個(gè)月接受生長(zhǎng)因子等敷料或高壓氧治療;(4)合并惡性腫瘤或心腦血管疾病者。根據(jù)是否發(fā)生感染分為感染組(87例)和未感染組(38例)。兩組患者一般資料比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。見表1。

表1 兩組一般資料比較

1.2方法 患者入院后均給予常規(guī)清創(chuàng)處理,根據(jù)患者具體情況每1～3 d進(jìn)行1次換藥,清除表面壞死組織。取患者創(chuàng)面中的新鮮肉芽組織,放入液氮中冷卻,然后將組織標(biāo)準(zhǔn)本轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱中保存。將肉芽組織研磨呈粉末狀,加1 mL Trizol溶液混勻,室溫靜置5 min。加0.2 mL氯仿溶液,搖勻,室溫靜置3 min。在4 ℃、離心力12 000×g的情況下離心15 min。取上層水相,以1∶1的體積加異丙醇,在4 ℃、離心力12 000×g的情況下離心15 min。棄去上清液,加1 mL的75%的乙醇溶液,震蕩洗滌,在4 ℃、離心力7 500×g的情況下離心5 min。棄去上清液,自然風(fēng)干5～10 min。加入去離子水洗滌,于55 ℃下恒溫孵育10 min,提取總RNA。引物序列:PDGFR-α上游和下游(5′-3′)分別為GACACTGGGAGATTCGGAGC 和AGAGATCATTGGAGGCCGTG。Bcl-2上游和下游(5′-3′)分別為AAGATTGATGGGATCGTTGC和GCGGAACACTTGATTCTGGT。內(nèi)參上游和下游(5′-3′)分別為CCGCATCTTCTTTTGCGTCG和TCCACCCATGGCAAATTCCA。PCR反應(yīng)條件設(shè)置:95 ℃ 5 min,進(jìn)入循環(huán)反應(yīng),95 ℃ 15 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s,循環(huán)40次,在每個(gè)循環(huán)的第3個(gè)階段進(jìn)行熒光信號(hào)收集。采用SDS v2.0.1軟件對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行處理,采用2-ΔΔCt法計(jì)算各個(gè)目的基因的mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

1.3觀察指標(biāo) (1)比較感染組和未感染組DFU患者Bcl-2、PDGFR-α表達(dá)水平。(2)根據(jù)國際DFU工作組以及美國感染病學(xué)會(huì)制定的DFU感染分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[10]對(duì)DFU感染患者進(jìn)行分級(jí),分為輕度感染、中度感染以及嚴(yán)重感染,其中將只有皮膚或皮下組織出現(xiàn)感染,紅斑在傷口周圍延伸<2 cm,為輕度感染;紅斑距創(chuàng)面邊緣≥2 cm,感染深至皮膚和皮下組織以下更深的組織,為中度感染;體溫>38 ℃或<36 ℃,心率為90次/分,呼吸速率>20次/分或二氧化碳分壓(PaCO2)<4.3 kPa(32 mmHg),白細(xì)胞計(jì)數(shù)>12 000/mm3或<4 000/mm3或>10%,滿足上述任意兩項(xiàng)及以上者即為嚴(yán)重感染。分別比較不同感染程度患者Bcl-2、PDGFR-α表達(dá)水平,并分析感染程度與表達(dá)水平的相關(guān)性。(3)隨訪半年,主要通過門診隨訪或電話隨訪方式進(jìn)行,期間無失訪人員。將患者未愈合、截肢、死亡等納入預(yù)后不良組,將創(chuàng)面皮膚完全附帶或形成結(jié)痂,達(dá)到愈合標(biāo)準(zhǔn)的患者納入預(yù)后良好組,收集患者臨床資料,分析影響DFU感染患者預(yù)后的因素,并分析Bcl-2、PDGFR-α表達(dá)對(duì)于預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值。

2 結(jié) 果

2.1感染組和未感染組Bcl-2、PDGFR-α表達(dá)水平的比較 感染組患者Bcl-2、PDGFR-α表達(dá)水平均顯著低于未感染組(P<0.05),見表2。

表2 感染組和未感染組Bcl-2、PDGFR-α表達(dá)水平比較

2.2不同感染程度Bcl-2、PDGFR-α表達(dá)水平比較 Bcl-2、PDGFR-α表達(dá)水平:嚴(yán)重感染者<中度感染者<輕度感染者,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表3。

表3 不同感染程度Bcl-2、PDGFR-α表達(dá)水平比較

2.3Bcl-2、PDGFR-α表達(dá)水平與感染嚴(yán)重程度相關(guān)性 Bcl-2、PDGFR-α表達(dá)水平與感染嚴(yán)重程度均呈負(fù)相關(guān)(r=-0.280、-0.516,P<0.05)。

2.4影響DFU感染患者預(yù)后的單因素分析 預(yù)后不良組患者Bcl-2、PDGFR-α表達(dá)水平顯著低于預(yù)后良好組(P<0.05),其余指標(biāo)單因素分析差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 影響DFU感染患者預(yù)后的多因素分析

表4 影響DFU感染患者預(yù)后的單因素分析或n(%)]

2.5影響DFU感染患者預(yù)后的多因素分析 以DFU感染患者預(yù)后是否良好為因變量,以Bcl-2、PDGFR-α表達(dá)為自變量,進(jìn)行Logistic回歸分析,結(jié)果顯示Bcl-2、PDGFR-α表達(dá)降低是導(dǎo)致DFU感染患者預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素(P<0.05)。見表4。

2.6Bcl-2、PDGFR-α表達(dá)對(duì)于DFU感染預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值 Bcl-2、PDGFR-α表達(dá)對(duì)于DFU感染患者預(yù)后均具有較好的預(yù)測(cè)價(jià)值,而兩者聯(lián)合預(yù)測(cè)曲線下面積(AUC)、特異度分別為0.765、71.83%,高于Bcl-2、PDGFR-α表達(dá)水平單項(xiàng)用于預(yù)測(cè)。見表5和圖1。

圖1 Bcl-2、PDGFR-α表達(dá)水平用于DFU感染患者預(yù)后預(yù)測(cè)的ROC曲線分析

表5 Bcl-2、PDGFR-α表達(dá)對(duì)于DFU感染預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值

3 討 論

DFU患者因自身免疫力較低,多伴有神經(jīng)病變或血管病變,創(chuàng)面愈合情況較差,極易發(fā)生感染,而感染會(huì)進(jìn)一步加重患者病情,兩者相互作用,從而影響患者預(yù)后[11]。盡管近年來不斷有新型廣譜抗菌藥物出現(xiàn),同時(shí)較多的綜述或指南均給予了包括局部清創(chuàng)、外科干預(yù)、抗菌藥物等DFU感染治療方案[12-13],但感染的發(fā)生率仍存在上升趨勢(shì)。既往研究表明約71%的DFU患者會(huì)發(fā)生感染[14]。在本研究中,DFU患者的感染發(fā)生率為69.6%,與既往上述研究結(jié)果相類似,進(jìn)一步證實(shí)了DFU的易感染性。而DFU患者因多種并發(fā)癥的存在,增加了抗菌藥物的選擇難度,促使患者預(yù)后變差。故早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療對(duì)于DFU患者的預(yù)后至關(guān)重要。

近年來研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞因子及其受體在DFU的發(fā)生以及修復(fù)過程中具有重要作用[15]。PDGF是發(fā)現(xiàn)較早的結(jié)締組織生長(zhǎng)因子,來源于平滑肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等多種細(xì)胞。該因子可通過促進(jìn)多種細(xì)胞增殖,同時(shí)趨化合成細(xì)胞外機(jī)制,增強(qiáng)細(xì)胞黏附,形成肉芽組織,促使損傷后的組織修復(fù),可見其在創(chuàng)面愈合過程中起到十分重要的作用[16]。國內(nèi)劉洋等[17]通過對(duì)DFU患者潰瘍組織以及正常皮膚組織的PDGF表達(dá)情況進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)前者表達(dá)水平明顯降低。另國外CADAMURO等[18]研究也表明PDGFR-α可通過調(diào)節(jié)組織重塑促進(jìn)成纖維細(xì)胞的生成。本研究以DFU感染和未感染患者為研究對(duì)象,結(jié)果顯示DFU感染患者創(chuàng)面PDGFR-α表達(dá)水平明顯降低,而且隨著感染程度的增加,PDGFR-α表達(dá)水平呈現(xiàn)遞減趨勢(shì),提示PDGFR-α可能與DFU患者創(chuàng)面感染相關(guān)。分析其原因,PDGFR-α可介導(dǎo)炎癥細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等,促進(jìn)肌動(dòng)蛋白重排,促使炎癥細(xì)胞向受損部位遷移和轉(zhuǎn)運(yùn),同時(shí)介導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞,達(dá)到促進(jìn)新生血管形成的目標(biāo)。而降低或抑制PDGFR-α的表達(dá),則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞核內(nèi)PDGFR-α基因表達(dá)的降低,進(jìn)而降低生長(zhǎng)因子活性,難以發(fā)揮其生產(chǎn)的生物學(xué)作用,致使創(chuàng)面遷延不愈,增加感染風(fēng)險(xiǎn)[19]。既往已有研究表明DFU患者感染程度與潰瘍程度呈正相關(guān)[20],可見創(chuàng)面經(jīng)久不愈也是引發(fā)感染的重要因素。除此之外,高血糖被認(rèn)為也是導(dǎo)致DFU患者感染的重要因素[21],高血糖的發(fā)生會(huì)導(dǎo)致患者機(jī)體抵抗力降低,從而增加感染風(fēng)險(xiǎn)。Bcl-2是一種癌基因,可通過抗氧化通路、破壞孔道蛋白的活性、調(diào)節(jié)線粒體滲透性轉(zhuǎn)變孔道復(fù)合物的成分等機(jī)制抑制細(xì)胞凋亡,近年來研究表明該基因與糖尿病患者胰島B細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[22]。呂曉玉等[23]研究表明Bcl-2與DFU創(chuàng)面中Wnt/β-catenin通路被抑制密切相關(guān);另鄭敏等[24]也發(fā)現(xiàn)Bcl-2相關(guān)細(xì)胞凋亡機(jī)制參與了DFU創(chuàng)面病理過程。本研究結(jié)果顯示,DFU感染患者創(chuàng)面Bcl-2表達(dá)水平明顯降低,而且隨著感染程度增加,呈現(xiàn)遞減趨勢(shì),提示Bcl-2可能與DFU患者創(chuàng)面感染相關(guān)。筆者認(rèn)為,一方面Bcl-2水平的降低,導(dǎo)致抑制凋亡能力也相應(yīng)降低,進(jìn)而促使創(chuàng)面凋亡細(xì)胞數(shù)量顯著增加,出現(xiàn)組織壞死或創(chuàng)面不愈,進(jìn)而增加感染風(fēng)險(xiǎn)。另一方面,細(xì)胞凋亡增加,可能影響B(tài)cl-2家族之間的動(dòng)態(tài)平衡,進(jìn)而促使胰島B細(xì)胞凋亡受影響,促使機(jī)體發(fā)生高血糖,降低抵抗力,從而導(dǎo)致感染概率增加。感染的發(fā)生勢(shì)必會(huì)對(duì)DFU患者的預(yù)后產(chǎn)生負(fù)面影響,導(dǎo)致患者發(fā)生截肢甚至死亡[25]。故探究Bcl-2、PDGFR-α表達(dá)與DFU感染患者預(yù)后的關(guān)系十分必要。本研究通過Logistic單因素以及多因素分析,結(jié)果顯示創(chuàng)面Bcl-2、PDGFR-α表達(dá)水平降低是導(dǎo)致DFU感染患者不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,并進(jìn)一步通過ROC曲線分析得出檢測(cè)創(chuàng)面Bcl-2、PDGFR-α表達(dá)情況可為DFU感染患者預(yù)后提供一定的預(yù)測(cè)價(jià)值。DFU創(chuàng)面內(nèi)細(xì)胞過度凋亡被認(rèn)為是重要的病理特征,推測(cè)可能隨著PDGFR-α表達(dá)降低,組織修復(fù)能力減弱,同時(shí)Bcl-2抑制凋亡能力降低,細(xì)胞凋亡的增加,進(jìn)一步導(dǎo)致創(chuàng)面組織損傷加重,感染程度增加,進(jìn)而導(dǎo)致不良預(yù)后。

綜上所述,DFU患者感染的發(fā)生與Bcl-2、PDGFR-α表達(dá)密切相關(guān),且Bcl-2、PDGFR-α表達(dá)降低是導(dǎo)致患者預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素,臨床可加強(qiáng)對(duì)Bcl-2、PDGFR-α表達(dá)的監(jiān)控,進(jìn)而為預(yù)后判斷提供參考。目前本研究的局限在于未通過體外試驗(yàn)進(jìn)一步論證Bcl-2、PDGFR-α表達(dá)影響DFU感染患者預(yù)后的具體機(jī)制,這也是后期有待開展的研究方向。