駱駝源性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制工藝優(yōu)化及性能評(píng)價(jià)

汪星宇 邢圓瑩 徐香富 伍志強(qiáng) 李娟 郭俊利 馬 滎 施蕊 何霞紅 季超 鄭文杰

摘要：為了得出駱駝源性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制工藝的最佳組合，通過對(duì)經(jīng)真實(shí)性鑒定的駱駝肉的切肉形狀（片狀、條狀和塊狀）、蒸制時(shí)間（0、20、30、40?min）與干燥工藝（冷凍干燥、40、50、60?℃）3個(gè)關(guān)鍵標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，以成粉率為考核指標(biāo)，并以《常見畜禽動(dòng)物源性成分檢測(cè)方法?實(shí)時(shí)熒光PCR法》（GB/T?38164-2019）中駱駝源性成分實(shí)時(shí)熒光多聚核苷酸鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Real-time?Polymerase?Chain?Reaction，PCR）鑒定方法進(jìn)行脫氧核糖核酸（Deoxyribo?Nucleic?Acid，DNA）測(cè)試，檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性與均勻性，確定了條狀（4?cm×0.5?cm×0.5?cm），隔水蒸制30?min后在50?℃下烘干后成粉率最高，達(dá)到了93.72%，且研制的駱駝源性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均一性和穩(wěn)定性均經(jīng)F檢驗(yàn)，無(wú)顯著差異。該研究所建立的駱駝源性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制工藝，成粉率高且均一，為高脂肪類樣品成粉的研究提供借鑒，為動(dòng)物源性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)提供了研制工藝和技術(shù)參數(shù)，且研制的駱駝源性成分定性標(biāo)準(zhǔn)樣品達(dá)到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)樣品的技術(shù)要求，可用于對(duì)食品中駱駝源性成分檢測(cè)過程的方法驗(yàn)證與質(zhì)量控制等活動(dòng)。

關(guān)鍵詞：標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)??駱駝肉??研制工藝??響應(yīng)面??性能評(píng)價(jià)

中圖分類號(hào)：TS254.4??文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：AOptimization?and?Performance?Evaluation?of?the?Development?Process?of?Camel-Derived?Reference?MaterialsWANG?Xingyu1??XING?Yuanying1??XU?Xiangfu1??WU?Zhiqiang1??LI?Juan1??GUO?Junli1??MA?Ying1??SHI?Rui2??HE?Xiahong2??JI?Chao1??ZHENG?Wenjie1*

Key?Words：?Reference?materials;?Camel?meat;?Development?process;?Response?surface;?Performance?evaluation

駱駝在動(dòng)物學(xué)分類中歸屬于哺乳綱（Mammalia）、偶蹄目（Artiodactyla）、駝科（Camelidae）、駝屬（Camelus），其駱駝肉具有高水分、高蛋白、低脂肪及低膽固醇等特點(diǎn)[1-3]，具有一定的藥用和保健價(jià)值，對(duì)呼吸系統(tǒng)疾病、胃酸過多、高血壓及肺炎等疾病均有療效[4]。而目前針對(duì)駱駝源性成分檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)包括2項(xiàng)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)、2項(xiàng)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)和1項(xiàng)地方標(biāo)準(zhǔn)，即《常見畜禽動(dòng)物源性成分檢測(cè)方法?實(shí)時(shí)熒光PCR法》（GB/T?38164-2019）、《動(dòng)物源性飼料中駱駝源性成分定性檢測(cè)方法?PCR方法》（GB/T?21100-2007）、《出口食品及飼料中動(dòng)物源成分快速檢測(cè)方法?第4部分：駱駝成分檢測(cè)?PCR-試紙條法》（SN/T?5145.4-2019）、《出口食品中駱駝源性成分的檢測(cè)?實(shí)時(shí)熒光PCR法》（SN/T?4418-2016）和《駱駝源性成分檢測(cè)方法?實(shí)時(shí)熒光PCR法》（DB15/T?2026-2020），但尚未有相對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)來(lái)質(zhì)控檢測(cè)過程。

而在食品安全檢測(cè)體系中，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)整個(gè)檢測(cè)質(zhì)量控制體系起到核心作用，在實(shí)物標(biāo)準(zhǔn)樣品研制過程中對(duì)于樣品均一性也有著嚴(yán)格要求[5]，所以成粉工藝對(duì)于實(shí)物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制也是不可或缺的。同時(shí)，“十四五”規(guī)劃中明確提出健全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)樣品管理機(jī)制，完善協(xié)調(diào)配套的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)樣品體系[6]，現(xiàn)有的標(biāo)準(zhǔn)樣品涉及金屬[7]、農(nóng)殘[8]、微生物[9]等領(lǐng)域的研制，缺乏動(dòng)物源性成分的實(shí)物標(biāo)準(zhǔn)樣品的研制。目前，針對(duì)肉類加工工藝的研究有中華鱘[10]、雞肉[11]、鵝[12]等物種，加工工藝的因素有蒸煮時(shí)間、烘烤溫度[13-14]等條件，干燥工藝方法的研究有微波干燥、紅外干燥、烘箱、烤箱等[15-17]，但這些研究未對(duì)肉粉加工工藝有系統(tǒng)性的最優(yōu)條件比較，且未有研究對(duì)駱駝源性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的成粉工藝進(jìn)行探討。

因此，該研究針對(duì)上述問題，在已有研究的基礎(chǔ)上[18]，首先通過動(dòng)物源性鑒定通用引物對(duì)駱駝鮮肉進(jìn)行分子鑒定，然后針對(duì)切肉形狀、蒸制時(shí)間與烘干溫度3個(gè)關(guān)鍵標(biāo)準(zhǔn)樣品研制工藝參數(shù)進(jìn)行單因素和響應(yīng)面優(yōu)化，并以成粉率和脫氧核糖核酸（DeoxyriboNucleic?Acid，DNA）擴(kuò)增效率為考核指標(biāo)，進(jìn)一步評(píng)價(jià)研制駱駝源性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均一性和穩(wěn)定性，以期為駱駝源性成分實(shí)物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均一性研制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，來(lái)填補(bǔ)動(dòng)物源性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制領(lǐng)域的空白。

1?材料與方法

1.1?材料與試劑

該研究所用的駱駝肉實(shí)驗(yàn)材料購(gòu)自電商平臺(tái)，參考標(biāo)準(zhǔn)《動(dòng)物制品中動(dòng)物源性檢測(cè)基因條碼技術(shù)Sanger測(cè)序法》（GB/T?35918-2018）通過了駱駝肉真實(shí)性檢驗(yàn)。

0.5?mol/L?乙二胺四乙酸（Ethylene?Diamine?Tetraacetic?Acid，EDTA）、1?mol/L?三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液（Tris?hydrochloride，Tris-HCI）、20%十六烷基硫酸鈉（Sodium?Dodecyl?Sulfate，SDS）；氯化鈉、磷酸氫二鈉（分析純）；磷酸二氫鈉、無(wú)水乙酸鈉、異丙醇（分析純）；無(wú)水乙醇（分析純）；蛋白酶K（20?mg/mL）、RNA酶（10?mg/mL）、DL1000?DNA?Marker、6×Loading?Buffer、TB?Green?Premix?Ex?Tag?Ⅱ（Tli?RNaseH?Plus）；TE緩沖液（Tris-EDTA?buffer?solution，TE?buffer）；Ultra?GelRed（10，000×）；50×TAE緩沖液；引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.2?儀器與設(shè)備

單罐行星式球磨機(jī)（Pulverisette?6型）；熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase?Chain?Reaction，PCR）檢測(cè)系統(tǒng)（NOVO?Max100）；高速冷凍離心機(jī)（3K15型）；粉碎機(jī)（FSJ-A03E1）；SOP電子分析天平（精度0.001?g）；干燥箱（DHG-9031A）；梯度PCR儀（T100）；體式熒光顯微鏡（SMZ25）。

1.3?實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1?研制工藝單因素優(yōu)化

針對(duì)駱駝肉樣的物理形態(tài)、蒸制時(shí)間、干燥工藝分別設(shè)計(jì)了3個(gè)梯度分組實(shí)驗(yàn)。將物理形態(tài)分為片狀（2?cm×2?cm×0.5?cm）、條狀（4?cm×0.5?cm×0.5?cm）、塊狀（1?cm×1?cm×1?cm）；蒸制時(shí)間設(shè)定為0、20、30和40?min；干燥工藝分為冷凍干燥，及烘干溫度40、50、60?℃，樣品達(dá)到恒重后經(jīng)球磨儀3?000?r/min，5?min的研磨，后過80目篩（粒徑小于0.1?mm），通過成粉率進(jìn)行研制工藝優(yōu)化。每個(gè)處理重復(fù)10次。

1.3.2?研制條件優(yōu)化響應(yīng)面分析

運(yùn)用Design-Expert軟件，針對(duì)物理形態(tài)（片狀（2?cm×2?cm×0.5?cm）、條狀（4?cm×0.5?cm×0.5?cm）、塊狀（1?cm×1?cm×1?cm）、蒸制時(shí)間（20、30和40?min）、烘干溫度（40、50和60℃）這3個(gè)因素，進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定最佳工藝參數(shù)組合，并參照《肉松質(zhì)量通則》（GB/T?23968-2022）進(jìn)行感官評(píng)價(jià)篩選（表1）。

1.3.3?駱駝源性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均一性檢驗(yàn)

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻一性是對(duì)標(biāo)準(zhǔn)樣物的特性量值在空間分布的均勻程度的評(píng)價(jià)，是標(biāo)準(zhǔn)樣品的重要質(zhì)量指標(biāo)之一[19]。參照《標(biāo)準(zhǔn)樣品工作導(dǎo)則（3）標(biāo)準(zhǔn)樣品定值的一般原則和統(tǒng)計(jì)方法》（GB/T15000.3-2008）規(guī)定，從同一批次制備的駱駝源性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中隨機(jī)抽取9瓶，依據(jù)《常見畜禽動(dòng)物源性成分檢測(cè)方法?實(shí)時(shí)熒光PCR法》（GB/T?38164-2019）中建立的駱駝源性成分實(shí)時(shí)熒光PCR鑒定方法進(jìn)行均一性檢驗(yàn)。

1.3.4?駱駝源性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)穩(wěn)定性檢驗(yàn)

在適宜的儲(chǔ)存條件下，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的特性值在較長(zhǎng)的一段時(shí)間內(nèi)沒有發(fā)生顯著變化，即標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性良好[20]。參照《標(biāo)準(zhǔn)樣品工作導(dǎo)則（3）標(biāo)準(zhǔn)樣品定值的一般原則和統(tǒng)計(jì)方法》GB/T15000.3-2008規(guī)定，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行兩年的穩(wěn)定性跟蹤測(cè)定，將標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)貯存在0～4℃低溫條件下保存，分別在第一年的每2個(gè)月、第二年的每3個(gè)月隨機(jī)抽取2瓶樣品，采用《常見畜禽動(dòng)物源性成分檢測(cè)方法?實(shí)時(shí)熒光PCR法》（GB/T?38164-2019）中的方法進(jìn)行檢測(cè)，依據(jù)實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增結(jié)果和Ct值分析駱駝源性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)穩(wěn)定性。

1.4?數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄在Office?2016中，并以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，同時(shí)進(jìn)行Duncan方差分析（P=0.05），以小寫字母表示因素之間的顯著性。響應(yīng)面數(shù)據(jù)和統(tǒng)計(jì)分析在Design-Expert?10軟件進(jìn)行。

2?結(jié)果與分析

2.1?研制工藝單因素優(yōu)化

由圖1（a）可知，蒸制時(shí)間為30?min時(shí)過篩量更高，成粉率為（84.41±3.74）%；以條狀肉蒸制30?min后進(jìn)行干燥工藝（凍干、40、50、60℃）的優(yōu)化，結(jié)果如圖1（b0所示，鼓風(fēng)干燥的溫度為50?℃時(shí)成粉率為（82.63±2.71）%，更有助于駱駝肉成粉。研究表明，過高的溫度和較長(zhǎng)的處理時(shí)間會(huì)降低肉粉中氨基酸的消化率[21]，將真實(shí)性鑒定合格的駱駝鮮肉分割為片狀（2?cm×2?cm×0.5?cm）、條狀（4?cm×0.5?cm×0.5?cm）、塊狀（1?cm×1?cm×1?cm）不同的物理形態(tài)，以30?min的蒸制條件和50?℃的烘制條件進(jìn)行處理，烘干完全后研磨過80目篩后，計(jì)算成粉率，由圖1（c）可知，將肉切成條狀（4?cm×0.5?cm×0.5?cm）成粉率為（80.89±3.64）%，結(jié)果顯著高于片狀（2?cm×2?cm×0.5?cm）和塊狀（1?cm×1?cm×1?cm）；綜上，單因素優(yōu)化結(jié)果中，最佳物理狀態(tài)為條狀（4?cm×0.5?cm×0.5?cm），最佳蒸制時(shí)間為30?min，最佳干燥工藝是鼓風(fēng)干燥50?℃。

2.2?駱駝肉粉工藝響應(yīng)面優(yōu)化

通過單因素試驗(yàn)確定的最佳實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，條件如下：物理狀態(tài)（A）（片狀（2?cm×2?cm×0.5?cm）、條狀（4?cm×0.5?cm×0.5?cm）、塊狀（1?cm×1?cm×1?cm））、蒸制時(shí)間（B）（20、30和40?min）、烘干溫度（C）（40、50和60℃），進(jìn)行三因素三水平設(shè)計(jì)，如表2所示，并根據(jù)設(shè)計(jì)組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，表3為不同響應(yīng)面條件下得到的過篩率，表4表明模型整體極顯著（P<0.01），失擬項(xiàng)不顯著，R2=0.061?7，模型整體擬合較好，其中一次項(xiàng)：物理形狀和干燥溫度影響顯著，蒸制時(shí)間影響極顯著；交互項(xiàng)之間影響不顯著。根據(jù)模型擬合結(jié)果，預(yù)測(cè)理想條件下的最佳條件為條狀（4?cm×0.5?cm×0.5?cm），蒸制時(shí)間32.019?1?min，烘干溫度為46.465?9?℃，根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)預(yù)測(cè)結(jié)果結(jié)合實(shí)際條件確定最佳標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制成粉工藝參數(shù)為：駱駝肉切成條狀（4?cm×0.5?cm×0.5?cm），蒸制30?min后以50?℃烘干，研磨過篩，經(jīng)體式顯微鏡觀察駱駝成粉的粉末均勻（見圖2）；但也觀察粉末之間由于靜電吸附存在結(jié)團(tuán)現(xiàn)象，針對(duì)此現(xiàn)象，后續(xù)有待進(jìn)一步研究如何消除粉末之間的靜電作用。

2.3?感官評(píng)價(jià)

從顆粒形態(tài)與大小、色澤、氣味和是否存在雜質(zhì)等5個(gè)方面對(duì)不同研制工藝形成駱駝肉粉進(jìn)行顯微觀察（見圖3）和感官評(píng)定，滿分以100分計(jì)。在室溫（25?℃）下由10人成立的固定評(píng)定小組，參照表1進(jìn)行感官評(píng)定。結(jié)果如表7所示，第5組響應(yīng)面條件的感官評(píng)價(jià)結(jié)果最佳的，與響應(yīng)面結(jié)果是一致的。

圖3??駱駝肉粉響應(yīng)面結(jié)果顯微圖

表5??感官評(píng)定結(jié)果

序號(hào)

顆粒形態(tài)

顆粒大小

色澤

氣味

雜質(zhì)

綜合評(píng)分

1

26

24

16

10

9

85

2

28

26

18

10

10

92

3

30

28

18

10

9

95

4

20

22

18

10

10

80

5

28

28

18

10

10

94

6

22

24

18

10

10

84

7

28

26

18

10

10

92

8

18

22

16

10

10

76

9

28

26

16

10

8

88

10

28

24

20

10

9

91

11

24

28

16

10

10

88

12

28

26

18

10

10

92

13

28

26

18

10

10

92

14

25

28

18

10

10

91

15

16

22

16

10

10

74

16

24

30

18

10

9

91

17

28

26

18

10

10

92

2.4?駱駝源性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性檢驗(yàn)

參照標(biāo)準(zhǔn)GB/T?38164-2019中的方法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)，并根據(jù)擴(kuò)增曲線和Ct值判定結(jié)果。在陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照均正常的情況下，Ct值≥40，可判斷該基因擴(kuò)增結(jié)果為陰性；Ct值＜35，可判斷該基因擴(kuò)增結(jié)果為陽(yáng)性，如表6所示，結(jié)果表明，經(jīng)F檢驗(yàn)，計(jì)算F統(tǒng)計(jì)量為0.128?7，小于F（8，18）=2.510?1，且P值不顯著，說(shuō)明研制的駱駝源性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是均勻的。

2.5?駱駝源性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)儲(chǔ)存穩(wěn)定性檢驗(yàn)

在適宜的保藏條件下，標(biāo)準(zhǔn)樣品物質(zhì)的穩(wěn)定性應(yīng)不會(huì)隨著貯存時(shí)間、運(yùn)輸時(shí)間的延長(zhǎng)發(fā)生顯著變化。參照《標(biāo)準(zhǔn)樣品工作導(dǎo)則（3）標(biāo)準(zhǔn)樣品定值的一般原則和統(tǒng)計(jì)方法》（GB/T15000.3-2008）規(guī)定，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)樣品物質(zhì)進(jìn)行兩年的穩(wěn)定性跟蹤測(cè)定，將標(biāo)準(zhǔn)樣品物質(zhì)貯存在0～4?℃低溫條件下保存，分別在第一年的每2個(gè)月、第二年的每3個(gè)月隨機(jī)抽取23瓶樣品，采用《常見畜禽動(dòng)物源性成分檢測(cè)方法?實(shí)時(shí)熒光PCR法》（GB/T?38164-2019）中的方法進(jìn)行檢測(cè)，依據(jù)實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增結(jié)果和Ct值分析駱駝源性標(biāo)準(zhǔn)樣品物質(zhì)儲(chǔ)存穩(wěn)定性。如表7所示，結(jié)果表明，經(jīng)F檢驗(yàn)，計(jì)算F統(tǒng)計(jì)量為1.156?1，小于F（9，20）=2.392?8，且P值不顯著，表明研制的駱駝源性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)儲(chǔ)存在0～4?℃低溫條件下是穩(wěn)定的。

3?結(jié)論

該研究為實(shí)現(xiàn)將駱駝肉研制成均勻分散的駱駝粉，對(duì)駱駝源性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制的工藝進(jìn)行研究，通過優(yōu)化制粉的物理狀態(tài)、蒸制時(shí)間及烘干溫度，并以成粉的粒徑為考核指標(biāo)，探討均勻分散的駱駝源性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)成粉工藝，同時(shí)也驗(yàn)證了研制的駱駝源性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均一性和穩(wěn)定性，表明該研究所研制的駱駝源性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可用于相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)物參考，該研究結(jié)果為高脂肪類樣品成粉的研究提供借鑒，為動(dòng)物源性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)提供了研制工藝和技術(shù)參數(shù)，填補(bǔ)了動(dòng)物源性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制領(lǐng)域的空白。

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