玉米赤霉烯酮及其類似物殘留檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

王博文，王 博

（河南科技學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453003）

玉米赤霉烯酮是一種由鐮刀菌產(chǎn)生的生物毒素，目前已知的類似物至少有15種，其中常見的有5種，包括α-玉米赤霉烯醇（α-Zearalenol，α-ZOL）、β-玉米赤霉烯醇（β-Zearalenol，β-ZOL）、α-玉米赤霉醇（α-Zeranol，α-ZAL）、β-玉米赤霉醇（β-Zearalenol，β-ZAL）和玉米赤霉酮（Zearalanone，ZAN），這些毒素主要污染農(nóng)產(chǎn)品及其副產(chǎn)品，導(dǎo)致農(nóng)產(chǎn)品的可用性下降。食用了高劑量的玉米赤霉烯酮谷物和飼料會(huì)使懷孕母畜出現(xiàn)流產(chǎn)、死胎、胎兒吸收等現(xiàn)象，甚至可能導(dǎo)致癌癥[1]。因此，需要加大對(duì)玉米赤霉烯酮及其類似物檢測(cè)方法的研究進(jìn)度，以便能夠準(zhǔn)確檢測(cè)食品中是否存在這種毒素，并進(jìn)行精確測(cè)量，為飼料的安全提供保障，促進(jìn)畜牧業(yè)的發(fā)展。

1 理化檢測(cè)方法

玉米赤霉烯酮是一種天然白色結(jié)晶體，其分子式為C18H22O5，其中的烯酮基團(tuán)決定了其雌激素活性，根據(jù)其理化性質(zhì)，確定該類物質(zhì)的傳統(tǒng)理化檢測(cè)方法主要包括高效液相色譜層析法、氣相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、薄層層析法等[2]。

1.1 高效液相色譜層析法

高效液相色譜層析法是目前檢測(cè)食品中毒素殘留量常用的方法，玉米赤霉烯酮及其類似物具有熒光特性，因此高效液相色譜層析法能夠用于測(cè)定樣品中的玉米赤霉烯酮及其類似物的殘留量。高效液相色譜層析法通常包括提取樣品、凈化和濃縮樣品、熒光檢測(cè)以及外標(biāo)法定量等步驟，該檢測(cè)方法的樣品加標(biāo)回收率不低于88%，樣品變異系數(shù)不超過4.0%；玉米赤霉烯酮及其類似物檢測(cè)限在10～310 ng·kg-1[3]。盡管高效液相色譜層析法在檢測(cè)食品中毒素殘留量方面具有高靈敏度和高精度的優(yōu)點(diǎn)，但其使用受到了設(shè)備和技術(shù)的限制，導(dǎo)致了成本較高、周期長(zhǎng)和易產(chǎn)生交叉反應(yīng)和假陽(yáng)性等問題。由于對(duì)樣品中待測(cè)成分的純度要求較高，高效液相色譜層析法并不能滿足大批量樣品快速篩選的需要。

1.2 氣相色譜法

氣相色譜法是一種用于分離和分析混合物中化合物的分析技術(shù)。該技術(shù)將混合物中的化合物分離為單獨(dú)的成分，然后使用檢測(cè)器檢測(cè)這些成分。氣相色譜法檢測(cè)玉米赤霉烯酮的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高、精確度高、專屬性強(qiáng)，但需要較長(zhǎng)的分析時(shí)間，同時(shí)在操作過程中需要注意避免樣品揮發(fā)和污染等問題。

1.3 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法依據(jù)歐盟委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)2002/657/EC進(jìn)行驗(yàn)證，已經(jīng)用于動(dòng)物體內(nèi)激素類藥物殘留的檢測(cè)，而且可以同時(shí)對(duì)多種激素和毒素進(jìn)行檢測(cè)。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法可以測(cè)定牛肌肉組織中玉米赤霉烯酮?dú)埩?，該方法基于?液萃取和固相萃取技術(shù)具有高靈敏度。然而，該方法需要高端設(shè)備和專業(yè)人員操作，操作過程煩瑣且昂貴，對(duì)操作環(huán)境條件有嚴(yán)格要求，因此不適用于廣泛使用。

1.4 薄層層析法

薄層層析法是在玻璃板上均勻地涂抹適宜的固定相（即吸附劑、支持劑和固化劑），制備出優(yōu)質(zhì)的薄層板，再將待測(cè)試樣溶液點(diǎn)加在薄層板的一端，然后選用適合的溶劑將試樣均勻展開，從而使試樣成分分離，達(dá)到檢測(cè)目的。國(guó)內(nèi)外發(fā)布的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)要求均采用薄層色譜法。SCHAAFSMA等[4]采用薄層層析法對(duì)谷物中玉米赤霉烯酮的殘留量進(jìn)行了檢測(cè)，該方法的檢出限為200 ng·kg-1，回收率為84%，且排除了其他類似物的干擾，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠。然而，由于薄層層析法需要使用多種輔助試劑和儀器，操作復(fù)雜，時(shí)間較長(zhǎng)，特異性和靈敏度不高，誤差較大，已無法滿足現(xiàn)代飼料安全檢測(cè)的要求，因此只在特殊情況下作為仲裁檢驗(yàn)使用。

2 免疫學(xué)檢測(cè)方法

免疫學(xué)檢測(cè)方法主要包括酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法、膠體金免疫層析法、免疫熒光技術(shù)、酶聯(lián)免疫分析法等。

2.1 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法

酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法適用于批量檢測(cè)和普查，是一種準(zhǔn)確度和靈敏度并重，快捷簡(jiǎn)便且檢測(cè)成本低的檢測(cè)方法，對(duì)檢測(cè)人員的要求較低，被廣泛用于檢測(cè)各種物質(zhì)。酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)法包括直接ELISA、間接ELISA、阻斷ELISA、競(jìng)爭(zhēng)抑制ELISA等。近年來，研究人員們開發(fā)了多種檢測(cè)糧食中玉米赤霉烯酮?dú)埩舻脑噭┖?。萬(wàn)宇平等[5]研發(fā)的ELISA試劑盒檢測(cè)限為93.5 μg·kg-1，線性范圍為50～405 μg·L-1，具有較好的穩(wěn)定性和可靠性。王東等[6]研發(fā)的試劑盒的最低檢出濃度為0.5 ng·mL-1，樣品加標(biāo)回收率不低于70.0%，并且可以用于檢測(cè)玉米、小麥和高粱中的玉米赤霉烯酮?dú)埩袅?。這些試劑盒具有靈敏度高、穩(wěn)定性好、加標(biāo)回收率高等優(yōu)點(diǎn)，可為飼料安全檢測(cè)提供有力支持。

2.2 膠體金免疫層析法

膠體金免疫層析法是一種利用抗原和抗體結(jié)合反應(yīng)的原理來檢測(cè)目標(biāo)物質(zhì)的方法。它的工作原理是先將標(biāo)記好的金標(biāo)抗體固定在金標(biāo)墊上，然后將待測(cè)樣品加入，通過毛細(xì)效應(yīng)使樣品中的抗原與抗體產(chǎn)生特異性結(jié)合，最后通過膠體金標(biāo)記顯色來進(jìn)行檢測(cè)。王瑩等[7]采用膠體金免疫層析技術(shù)研發(fā)出一種免疫膠體金試紙條，可以快速測(cè)定糧食和糧食產(chǎn)品中的玉米赤霉烯酮?dú)埩袅?，該試紙條的檢測(cè)限為4.7 μg·kg-1，定量限為13.9 μg·kg-1，線性范圍在14.5～500.0 μg·kg-1，相關(guān)系數(shù)為0.996 4。劉媛等[8]研發(fā)出一種用于快速檢測(cè)動(dòng)物尿液或水樣本中玉米赤霉烯酮?dú)埩袅康拿庖吣z體金試劑板，其檢測(cè)閾值為2.5 μg·mL-1，整個(gè)檢測(cè)過程只需10 min。這些試紙條和試劑板都是用于玉米赤霉烯酮?dú)埩艨焖贆z測(cè)的有效工具，相對(duì)于其他檢測(cè)方法，膠體金免疫層析法具有特異性和靈敏性高、操作簡(jiǎn)便、成本低、結(jié)果能夠長(zhǎng)期保存等優(yōu)點(diǎn)，其唯一的缺點(diǎn)是不能直接定量目標(biāo)物質(zhì)。因此，膠體金免疫層析法適用于現(xiàn)場(chǎng)操作和樣本普查等應(yīng)用場(chǎng)景。

2.3 免疫熒光技術(shù)

免疫熒光技術(shù)的主要原理是通過抗原抗體的特異性結(jié)合，使熒光素標(biāo)記的抗原與細(xì)胞中的抗體特異性結(jié)合，以達(dá)到檢測(cè)目的。該方法廣泛應(yīng)用于微生物檢測(cè)，還可以使用單克隆抗體來鑒定淋巴細(xì)胞的亞類。此檢測(cè)方法快速且靈敏度極高，交叉反應(yīng)率較低，回收率平均值高于90%。

2.3.1 直接熒光法

該方法是利用抗原抗體特異性結(jié)合原理，結(jié)合切片染色法，然后通過熒光顯微鏡觀察樣品，有熒光出現(xiàn)則代表該樣品內(nèi)存在抗原。這種方法可以用于免疫細(xì)胞的檢測(cè)。但是，該方法的缺點(diǎn)是不夠靈便、快捷，步驟復(fù)雜煩瑣。

2.3.2 間接熒光法

間接熒光法與直接熒光法相比，操作簡(jiǎn)單且具有更高的靈敏性。在間接熒光法中，第一抗體是不帶熒光標(biāo)記的，而第二抗體是帶熒光標(biāo)記的免疫球蛋白。第一抗體與待檢測(cè)細(xì)胞上的抗原結(jié)合，再加入帶熒光標(biāo)記的抗免疫球蛋白抗體使之與第一抗體發(fā)生反應(yīng)，最終觀察熒光信號(hào)來確定抗原的存在，該方法對(duì)淋巴細(xì)胞亞類的檢測(cè)十分有效。

2.4 酶聯(lián)免疫分析法

該法吸附法和ELISA檢測(cè)方法的原理非常相似。它們都利用固相表面標(biāo)記抗原、抗原與抗體反應(yīng)等原理，根據(jù)顯色劑的深淺來判斷檢測(cè)結(jié)果。該技術(shù)通常使用酶標(biāo)記二抗辣根過氧化物，這因?yàn)槠渚哂锌梢暂^長(zhǎng)時(shí)間保存，不易受到干擾的特性。

3 其他方法

3.1 噬菌體展示技術(shù)

噬菌體展示技術(shù)是一種通過將合成的包被抗原與噬菌體抗體庫(kù)相結(jié)合，再經(jīng)過連續(xù)的負(fù)篩選、ELISA鑒定（酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法）、克隆和SDSPAGE（電泳鑒定）分析等步驟，從而篩選出特異性玉米赤霉烯酮單鏈抗體的方法。這一技術(shù)的成功應(yīng)用為后續(xù)制備特異性抗體提供了重要基礎(chǔ)，為玉米赤霉烯酮的檢測(cè)和研究提供了新思路和方法。其中，噬菌體展示技術(shù)的核心是將待篩選的抗原表面展示在噬菌體的表面，從而能夠準(zhǔn)確篩選出與抗原特異性結(jié)合的噬菌體。

3.2 時(shí)間分辨熒光免疫法

COOPER等[9]采用時(shí)間分辨熒光免疫法分析樣品中的玉米赤霉烯酮?dú)埩袅?，與玉米赤霉烯酮試劑盒相比，時(shí)間分辨熒光免疫法可區(qū)分被鐮刀腐霉菌污染的牛尿樣品中的玉米赤霉烯酮的濫用，其檢測(cè)閾值為0.16 μg·kg-1，此法準(zhǔn)確性很高，可準(zhǔn)確定量玉米赤霉烯酮的質(zhì)量濃度在2～5 ng·mL-1，甚至在很多的鐮刀腐霉菌屬毒素共存時(shí)，也不受干擾，能夠避免假陽(yáng)性。

3.3 受體結(jié)合分析法

體內(nèi)的受體蛋白可與樣本中殘留的同化激素產(chǎn)生特異性結(jié)合。STAN等[10]運(yùn)用牛子宮細(xì)胞液中的雌激素受體與組織中殘留的同化激素之間可產(chǎn)生特異性結(jié)合這一特性，對(duì)動(dòng)物組織中包括玉米赤霉烯酮在內(nèi)的7種不同雌激素類藥物進(jìn)行定性和定量測(cè)定，之后用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法進(jìn)一步確證，得出檢測(cè)限為1～5 μg·L-1，這種檢測(cè)方法靈敏性高、特異性強(qiáng)并且結(jié)果可靠。

4 結(jié)語(yǔ)

玉米赤霉烯酮及其類似物是一種對(duì)動(dòng)物健康有潛在危害的毒素，嚴(yán)重威脅著畜牧業(yè)發(fā)展，發(fā)展玉米赤霉烯酮及其類似物多殘留快檢技術(shù)成為當(dāng)下食品安全檢測(cè)領(lǐng)域的一項(xiàng)重要工作。當(dāng)前，世界各國(guó)已經(jīng)發(fā)展出了多種理化和免疫學(xué)檢測(cè)方法，其中包括高效液相色譜層析法、薄層層析法、氣相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、免疫親和柱-高效液相色譜法以及液譜和質(zhì)譜聯(lián)用法等。這些方法具有檢測(cè)靈敏度高、準(zhǔn)確度高、可靠性高等優(yōu)點(diǎn)，可以有效地用于玉米赤霉烯酮的檢測(cè)和定量分析。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步和發(fā)展，玉米赤霉烯酮檢測(cè)技術(shù)也會(huì)得到更多的突破和進(jìn)展，從而更好地保障飼料安全和家畜家禽健康。