乙酰肝素酶通過ERK/MMP-9信號通路促進膽囊癌細胞侵襲和遷移

常衛(wèi)才 陳佳偉 劉子祥 陳正民 周少波

1蚌埠醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院（安徽蚌埠 233000）；2組織移植安徽省重點實驗室（安徽蚌埠 233000）

膽囊癌（gallbladder carcinoma，GBC）是影響膽囊的最常見的膽道系統(tǒng)惡性腫瘤類型，病死率約1.7%，每年診斷出22 萬例膽囊癌新發(fā)病例［1］。流行病學研究發(fā)現(xiàn)了許多與膽囊癌發(fā)病相關的危險因素［2］，如女性、年齡＞65 歲、長期膽結(jié)石伴慢性膽囊炎、先天性遺傳變異、肥胖等。其中膽結(jié)石和慢性膽囊炎是膽囊癌發(fā)生發(fā)展重要的驅(qū)動因素［3-4］。隱匿發(fā)病，進展迅速，治療選擇有限，預后不良是膽囊癌主要臨床特點［5］。目前手術切除加放化療是膽囊癌唯一有望治愈的方法，但只適用于早期階段的患者，大多數(shù)患者確診時已是肝肺淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌癥晚期，失去了治愈機會［3］。近年來有研究表明乙酰肝素酶（HPSE）在膽囊癌組織中高表達，與患者的生存期短和不良預后密切相關［6］，但HPSE 影響膽囊癌侵襲、遷移表型改變的分子機制仍不清楚。

HPSE 是一種在哺乳動物體內(nèi)普遍存在的內(nèi)源性-β-葡萄糖醛酸酶，它的酶促活性可以水解切割硫酸乙酰肝素蛋白多糖的硫酸乙酰肝素（HS）側(cè)鏈，而非酶促活性可以調(diào)節(jié)細胞信號傳導，這兩方面的活性使它參與調(diào)節(jié)癌癥進展的多個過程［7-8］，包括但不限于誘導自噬，改變腫瘤微環(huán)境，增強腫瘤細胞遷移和侵襲能力，促進腫瘤生長、分化及新生血管生成等。ERK/MMP-9 信號通路在腫瘤細胞增殖、遷移及侵襲過程中發(fā)揮重要作用［9］。HPSE 可以調(diào)節(jié)腫瘤組織中MMP-9 的表達［10］，但涉及HPSE 與MMP-9 對膽囊癌侵襲、遷移的影響及作用機制有待研究。為此，在本研究中，我們在膽囊癌細胞模型中采用慢病毒轉(zhuǎn)染方法建立HPSE 過表達和低表達的穩(wěn)定細胞株，旨在明確HPSE 通過ERK/MMP-9 途徑對膽囊癌細胞的遷移侵襲的影響，并分析其內(nèi)在分子機制，以期為膽囊癌的防治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料人膽囊癌細胞系（GBC-SD）購自武漢普諾賽。慢病毒轉(zhuǎn)染試劑盒購自上海吉凱基因醫(yī)學科技股份有限公司，細胞基礎培養(yǎng)基（RPMI-1640）購自（北京）賽默飛世爾生物化學制品有限公司，胎牛血清購自Clark Bioscience，胰蛋白酶消化液購自Beyotime，青霉素-鏈霉素雙抗購自Biosharp，Transwell 小室購自美國康寧公司，HPSE、MMP-9、GAPDH 多克隆抗體和辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔二抗購自abclonal，ERK、p-ERK 購于Proteintech；BCA 蛋白濃度定量試劑盒購自康為世紀；ERK 信號通路抑制劑SCH772984 購自MCE；Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑以及PCR 引物購自上海生工。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)、處理及分組將膽囊癌細胞系GBC-SD 置于含有10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗的細胞基礎培養(yǎng)基（RMPI-1640）中，在37 ℃和5%CO2濃度細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞融合度約80%，胰蛋白酶將貼壁細胞消化脫落，1 000 r/min離心5 min；棄上清后，用完全培養(yǎng)基重懸細胞，移液槍重新吹打成均勻細胞懸浮液進行傳代或種板。取生長狀態(tài)良好的膽囊癌細胞，胰酶消化離心完全培養(yǎng)基重懸細胞，密度調(diào)整為1 × 105/mL，將2 mL 細胞懸液接種到6 孔板，細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后按照慢病毒轉(zhuǎn)染操作說明書進行HPSE shRNA 轉(zhuǎn)染和過表達轉(zhuǎn)染，37 ℃和5%CO2濃度條件培養(yǎng)3 d，觀察細胞熒光評價轉(zhuǎn)染效果，qRT-PCR和Western blot 檢測轉(zhuǎn)染后GBC-SD 細胞中HPSE的mRNA 和蛋白表達水平。根據(jù)目的將實驗分為陰性對照組（GBC-SD）、HPSE 基因過表達組（GBCOE）及HPSE 基因敲低組（GBC-SI）。

1.2.2 Western blot 檢測HPSE、MMP-9、ERK1/2、p-ERK1/2、E-cadherin 及N-cadherin 蛋白表達收集生長狀態(tài)良好的各組膽囊癌細胞，加入添加了蛋白酶抑制劑（PMSF）的細胞裂解液（RIPA）冰上裂解，超速離心，BCA 蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，蛋白質(zhì)樣品與蛋白上樣緩沖液混合（4∶1），100 ℃、10 min 使蛋白變性，10%SDS-PAGE 電泳，使用聚偏二氟乙烯（PVDF）膜進行轉(zhuǎn)膜操作，脫脂奶粉封閉2 h，PVDF膜置入HPSE（1∶1 000）、MMP-9（1∶1 000）、ERK1/2（1∶1 000）、p-ERK1/2（1∶1 000）、GAPDH（1∶1 000）抗體中4 ℃孵育過夜，之后TBST洗膜，置入相應的山羊抗兔二抗中室溫搖床孵育2 h。TBST 再次洗膜，滴加適量的ECL 發(fā)光液，將PVDF 膜放入凝膠成像儀中曝光獲取圖像。

1.2.3 qRT-PCR 檢測HPSE、MMP-9 mRNA 表達情況首先收集對數(shù)生長階段的細胞，加入Trizzol溶液，提取細胞總mRNA，然后按照cDNA 合成試劑盒說明書中的操作步驟，將mRNA 反轉(zhuǎn)為cDNA。以GAPDH 為內(nèi)參，測定HPSE mRNA 的表達水平。根據(jù)GenBank 數(shù)據(jù)庫中查詢到的基因序列，應用Primer5.0 軟件設計目的基因引物，由上海生工生物公司合成，引物序列見表1，利用2-△△Ct法進行了相對表達水平的測定。

表1 qRT-PCR 引物序列Tab.1 qRT-PCR primer sequence

1.2.4 Transwell 實驗檢測細胞侵襲能力取對數(shù)生長期的細胞，將其種植在24 孔的平板小室內(nèi)，在下室內(nèi)添加了含有10%的胎牛血清的完全培養(yǎng)基，在37 ℃、5%CO2濃度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。然后，4 ℃預冷的PBS 洗2 遍，晾干之后多聚甲醛固定細胞30 min，再次晾干后用0.1%的結(jié)晶紫染液進行染色10 min。顯微鏡下隨機5 個部位觀察并拍照，計數(shù)取平均值平均。

1.2.5 劃痕實驗檢測細胞遷移能力待各組細胞融合度約達80%時胰酶消化、離心，無血清基礎培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細胞密度為2.5×105個/mL，將細胞接種于6 孔板中，2 mL/孔，在37 ℃和5%CO2條件下培養(yǎng)至細胞融合。隨后，使用200 μL 移液槍槍頭尖端在單層表面上劃痕，在培養(yǎng)0、24 h 時分別在劃痕處隨機選取5 個視野進行拍照以獲取細胞遷移的圖像。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析運用GraphPad Prism 9.0 軟件，進行統(tǒng)計分析及繪制圖表，計量數(shù)據(jù)均使用均數(shù)±標準差來描述，使用t檢驗或方差分析來對各組之間的均數(shù)進行統(tǒng)計，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 HPSE 基因過表達和RNA 干擾抑制表達效果的驗證Western blot 和qRT-PCR 實驗結(jié)果顯示，經(jīng)轉(zhuǎn)基因過表達HPSE 后的膽囊癌細胞中HPSE 的蛋白和mRNA 相對表達量較陰性對照組升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；經(jīng)RNA干擾抑制HPSE基因表達后的膽囊癌細胞中的HPSE mRNA 和蛋白相對表達量較陰性對照組降低（圖1）。至此，HPSE 基因過表達組（GBC-OE）和HPSE 基因敲低組（GBC-SI）膽囊癌細胞株成功建立。并用于實施后續(xù)實驗。

圖1 慢病毒轉(zhuǎn)染后膽囊癌細胞中HPSE mRNA 和蛋白表達情況Fig.1 Expression of HPSE mRNA and protein in gallbladder carcinoma cells after transfection with lentivirus

2.2 HPSE 對膽囊癌細胞行為功能學的影響劃痕實驗結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，HPSE 過表達組的細胞遷移能力明顯增強，HPSE 敲低組結(jié)果則相反，見圖2。Transwell 實驗結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，HPSE 過表達組穿過基質(zhì)膠的細胞數(shù)量顯著增多，HPSE 敲低組情況相反，見圖2。

圖2 HPSE 表達水平改變對膽囊癌細胞遷移侵襲能力的影響Fig.2 Effect of HPSE expression on migration and invasion ability of gallbladder carcinoma cells

2.3 HPSE 對膽囊癌細胞中MMP-9 mRNA 和蛋白表達、p-ERK 和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關蛋白表達的影響與對照組相比，HPSE 過表達組膽囊癌細胞中MMP-9 mRNA 和蛋白表達、p-ERK 及N-cadherin的蛋白表達水平呈升高改變，而E-cadherin 的蛋白表達水平呈降低改變；HPSE 敲低組MMP-9 mRNA和蛋白表達、p-ERK 及N-cadherin 的蛋白表達水平均呈降低改變，而E-cadherin 的蛋白表達水平呈升高改變，ERK 蛋白表達水平不受影響，見圖3。

圖3 HPSE表達水平改變后對MMP-9 mRNA和蛋白表達、EMT相關蛋白表達影響Fig.3 The effect of HPSE expression level on the expression of MMP-9 mRNA and protein，and the expression of EMT-related protein

2.4 HPSE 對膽囊癌細胞行為功能學影響的機制研究與HPSE 基因過表達組相比，膽囊癌細胞中HPSE 基因過表達+ERK 抑制劑組MMP-9、p-ERK、ERK、N-cadherin 的蛋白表達水平均呈降低改變，而E-cadherin 蛋白表達水平呈升高改變，見圖4。

圖4 HPSE 過表達膽囊癌細胞經(jīng)ERK 抑制劑處理后對侵襲遷移相關蛋白表達的影響Fig.4 Effects of HPSE overexpression of gallbladder cancer cells on the expression of invasion migration-related proteins after treatment with ERK inhibitors

2.5 ERK 抑制劑對膽囊癌細胞行為功能學的影響與過表達組相比，膽囊癌細胞中HPSE 基因過表達+ERK 抑制劑組細胞穿過基質(zhì)膠的細胞數(shù)量明顯減少，見圖5；與過表達組相比，膽囊癌細胞中HPSE 基因過表達+ERK 抑制劑組的細胞遷移能力明顯減弱，見圖5。

圖5 ERK 抑制劑的處理顯著逆轉(zhuǎn)了了HPSE 過表達對膽囊癌細胞侵襲遷移能力的促進作用Fig.5 Treatment with ERK inhibitor significantly reversed the promoting effect of HPSE overexpression on invasion and migration of gallbladder carcinoma cells

3 討論

膽囊癌是最常見的膽道系統(tǒng)惡性腫瘤，診斷不及時和治療選擇有限是膽囊癌治愈的主要障礙［11］。近年，雖然研究技術的快速進步為膽囊癌的治療打開了新的窗口，出現(xiàn)了諸多新穎的診療策略，如特異性靶向治療［12］、免疫治療［13］、核酸分子診斷［14］和納米粒子藥物遞送［15］等，但流行病學研究顯示膽囊癌仍是最具侵襲性、中位生存期最短的膽道系統(tǒng)腫瘤［3］。因此，迫切需要了解膽囊癌進展的新的調(diào)控機制，以期改進治療策略，提高患者生存期并改善預后。本研究在膽囊癌的治療方面提供了可能有價值的分子靶點和理論支撐。

國內(nèi)外大量研究表明，HPSE 表達水平與多種腫瘤類型的進展和預后密切相關［16-18］。RODRIGUES 等［19］的研究顯示HPSE 在口腔鱗狀細胞癌組織和細胞系中表達上調(diào)，證明了HPSE 表達下調(diào)顯著降低N-cadherin 和Vimentin 表達，進而誘導EMT并促進細胞凋亡，抑制細胞增殖、遷移和侵襲。CHEN 等［20］發(fā)現(xiàn)HPSE 在肝細胞癌組織中高表達并與患者的多腫瘤病灶、微血管侵襲和不良預后相關。HPSE 抑制劑OGT2115 處理膽囊癌細胞，結(jié)果呈劑量依賴性抑制細胞生長與活性［21］。然而，HPSE 促進膽囊癌侵襲、遷移的完整機制仍有待闡明。

上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移發(fā)生的關鍵環(huán)節(jié)［22-23］，E-cadherin 的低表達以及N-cadherin 的高表達是EMT 發(fā)生過程中的重要分子標志。WANG 等［24］發(fā)現(xiàn)HPSE 活化Wnt/β-catenin通路，誘導EMT 從而促進胰腺癌的侵襲遷移。MASOLA 等［23］的研究證實HPSE 調(diào)節(jié)EMT 促進前列腺癌細胞侵襲遷移。ZAHAVI 等［25］采用體外細胞實驗確認了EMT 相關基因高表達是過表達HPSE 促進乳腺癌進展的重要機制。我們由此推測EMT 的誘導是HPSE 促進膽囊癌細胞侵襲、遷移的重要步驟。另有研究表明，ERK 磷酸化與HPSE 的表達相關。在乳腺癌中，ZHANG 等［26］的研究發(fā)現(xiàn)干擾乙酰肝素酶表達降低ERK 磷酸化水平，抑制癌細胞的生長和轉(zhuǎn)移。在肝癌中，YU等［27］的研究證明HPSE 誘導硫酸乙酰肝素蛋白多糖（Syndecan-1）側(cè)鏈的水解，促進與側(cè)鏈結(jié)合的血管內(nèi)皮生長因子C（VEGF-C）的釋放，進而激活細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）信號通路促進淋巴管內(nèi)皮細胞生長，改變腫瘤微環(huán)境利于肝癌細胞淋巴轉(zhuǎn)移。ERK 的磷酸化已被證明參與調(diào)控腫瘤進展的多種生物學行為，如細胞增殖［28］、轉(zhuǎn)移［29］、耐藥［30］及免疫應答［31］等。在宮頸癌HeLa 細胞中，楊利利等［32］使用右美托咪定處理細胞后發(fā)現(xiàn)下調(diào)ERK 磷酸化水平誘導細胞凋亡并增強癌細胞對順鉑的敏感性。在肝細胞癌中，ZHAI 等［33］的研究揭示ERK 信號通路磷酸化激活后促進癌細胞增殖轉(zhuǎn)移。MMP-9是ERK信號通路的下游分子［18，34］，是細胞外基質(zhì)重塑的重要酶類，在膽囊癌細胞中高表達，且與腫瘤的侵襲、遷移密切相關［35］。顯然，ERK/MMP-9 信號通路異?；罨閷[瘤細胞增殖存活、侵襲遷移［9，18，36］。

在此，為了探究HPSE 對膽囊癌細胞侵襲、遷移的影響及分子機制，我們采用轉(zhuǎn)基因技術過表達HPSE 基因和RNA 干擾技術敲低HPSE 基因表達，再通過嘌呤霉素抗性篩選實驗獲得HPSE 過表達和低表達的膽囊癌穩(wěn)定細胞系。接下來進行了Western blot 實驗和qRT-PCR 實驗驗證轉(zhuǎn)染后膽囊癌細胞中HPSE 表達，結(jié)果顯示與GBC-SD 組細胞相比，轉(zhuǎn)染后GBC-OE 組HPSE 蛋白和mRNA 相對表達量顯著上調(diào)，GBC-SI 組情況相反。說明HPSE過表達和敲低表達的膽囊癌細胞系GBC-OE 和GBC-SI 成功構建。劃痕愈合實驗和Transwell 實驗結(jié)果提示，HPSE 過表達促進膽囊癌細胞遷移、侵襲等惡性行為，而干擾HPSE 表達情況恰好相反。隨后我們采用Western blot 實驗和qRT-PCR 實驗檢測HPSE表達水平改變后可能相關的分子改變，結(jié)果與GBC-SD 組細胞相比，GBC-OE 組細胞中p-ERK、N-cadherin 蛋白及MMP-9 mRNA 和蛋白表達水平顯著增加，而E-cadherin蛋白表達顯著減少；GBC-SI組細胞出現(xiàn)了相反的情況。提示乙酰肝素酶上調(diào)ERK 磷酸化水平，增加MMP-9 表達并促進EMT 的發(fā)生。我們使用ERK 信號通路抑制劑SCH772984處理GBC-OE 組細胞進一步探究這些分子改變可能的機制，劃痕愈合實驗和Transwell 實驗結(jié)果提示，HPSE 過表達對膽囊癌細胞侵襲遷移能力的促進作用在添加ERK 抑制劑后明顯被逆轉(zhuǎn)，同時Western blot 實驗檢測到在添加ERK 信號通路抑制劑后GBC-OE組細胞MMP-9、p-ERK和N-cadherin蛋白表達水平降低，E-cadherin 蛋白表達水平升高。因此認為HPSE 介導ERK 磷酸化上調(diào)導致MMP-9的表達增強和誘導EMT 的發(fā)生，進而增強膽囊癌細胞侵襲、遷移能力。

綜上所述，改變膽囊癌細胞中HPSE 表達水平可以調(diào)控EMT 的發(fā)生并改變細胞的遷移侵襲能力，其機制可能是HPSE 通過調(diào)控ERK/MMP-9 信號通路實現(xiàn)的。本研究通過雙向調(diào)節(jié)HPSE 表達不僅初步證實了HPSE 是膽囊癌細胞侵襲遷移的促進因素，還探究了其可能的分子機制，對膽囊癌發(fā)病機制進行了補充和豐富并為抗腫瘤藥物的研發(fā)提供了理論依據(jù)。但該研究尚有不足之處，目前只在細胞水平上進行了初步的研究，后續(xù)本課題組還將繼續(xù)通過敲低和過表達等方法，對其作用機制進行深入探討，并在整體動物水平加以驗證。