地夫可特改善杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥小鼠運(yùn)動(dòng)能力及減輕肌肉炎癥損傷

楊曉 張歡 張朝暉 楊細(xì)飛

1南華大學(xué)衡陽(yáng)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院（湖南衡陽(yáng) 421001）；2深圳市疾病預(yù)防控制中心深圳市現(xiàn)代毒理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，深圳市衛(wèi)生毒理學(xué)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科（廣東深圳 518055）

杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥是一種常見(jiàn)的肌營(yíng)養(yǎng)不良癥，影響全球多達(dá)1/3 500～1/5 000的男性［1］。其特征表現(xiàn)為肌肉無(wú)力，運(yùn)動(dòng)能力下降，骨骼肌退行性變化。杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥多由于肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白缺失導(dǎo)致細(xì)胞骨架穩(wěn)定性破壞所致，患者多在2～3 歲發(fā)病，7 歲左右癥狀顯著，10 歲左右需要依靠輪椅活動(dòng)，最終多在20～30 歲階段死于心力衰竭或者膈肌呼吸無(wú)力［2-4］。杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥骨骼肌病理?yè)p傷導(dǎo)致肌肉出現(xiàn)明顯的炎癥纖維化病變，盡管肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白缺失是該病的主要原因，但是肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白缺失導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷、慢性炎癥壞死和骨骼肌退行性變化會(huì)加重疾病進(jìn)展［5-6］。

目前關(guān)于杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥的治療方法包括兩大類，即恢復(fù)肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白表達(dá)和補(bǔ)償肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白缺乏的療法，前者包括外顯子跳躍療法、載體介導(dǎo)的基因療法、載體介導(dǎo)的細(xì)胞療法等，后者包括抗炎、抗氧化、抗纖維化治療［7-9］。糖皮質(zhì)激素治療一直是杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥患者的標(biāo)準(zhǔn)治療方法，潑尼松和地夫可特是最值得推薦的類固醇治療方案［10］。地夫可特于2017 年獲得FDA 批準(zhǔn)，被廣泛用于杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥患者的臨床治療［11］。

然而目前關(guān)于地夫可特對(duì)杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥患者運(yùn)動(dòng)能力和骨骼肌病理改變的治療研究甚少。此研究旨在了解杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥小鼠運(yùn)動(dòng)能力變化和肌肉病理改變，探索地夫可特治療期間對(duì)杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥小鼠運(yùn)動(dòng)能力及骨骼肌病理?yè)p傷的干預(yù)情況，進(jìn)一步為肌肉退行性疾病的科學(xué)防治提供參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型選取肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白缺乏的C57BL/10ScSnJGpt-Dmdem3Cd4/Gpt（mdx，DMD）動(dòng)物模型小鼠和品系對(duì)照小鼠C57BL/10JGpt（WT）。小鼠購(gòu)自江蘇省集萃藥康生物科技有限公司，并飼養(yǎng)在溫度穩(wěn)定在（20 ± 2）℃和濕度（55 ± 5）%的12 h 明暗循環(huán)的飼養(yǎng)室中。

依據(jù)體質(zhì)量隨機(jī)將10 周齡雄性小鼠分為正常對(duì)照組（正常組）、模型組、地夫可特治療組［地夫可特組，1 mg/（kg·d）］，每組7只實(shí)驗(yàn)小鼠，實(shí)驗(yàn)8周后實(shí)施安樂(lè)死。實(shí)驗(yàn)期間，每周稱量1 次體質(zhì)量，每4 周進(jìn)行1 次行為學(xué)測(cè)試評(píng)估小鼠運(yùn)動(dòng)能力。

深圳市疾病預(yù)防控制中心動(dòng)物福利倫理委員會(huì)批準(zhǔn)了此項(xiàng)研究方案（No.2022011）。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作和程序均遵循深圳市疾病預(yù)防控制中心動(dòng)物管理?xiàng)l例執(zhí)行。我們盡一切努力，盡量減少動(dòng)物的痛苦及減少小鼠的數(shù)量。

1.2 藥物地夫可特：即Deflazacort（MCE，美國(guó)），糖皮質(zhì)激素的一種。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 懸掛測(cè)試采用懸掛網(wǎng)格測(cè)試評(píng)估小鼠四肢的握力，通過(guò)記錄小鼠倒置懸掛支撐的時(shí)間進(jìn)行評(píng)估小鼠的肌肉力量。首先將小鼠放置在21 cm × 21 cm 的金屬絲網(wǎng)格（線寬約0.1 cm，相距0.5 cm）的中心，等待小鼠抓住網(wǎng)格時(shí)輕輕翻轉(zhuǎn)網(wǎng)格并記錄小鼠懸掛在網(wǎng)格上的時(shí)間，可以翻轉(zhuǎn)網(wǎng)格后將其放置在桌子上方35 cm 處。每4 周測(cè)試1 次，并以90 s 作為測(cè)試結(jié)果的臨界值。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，計(jì)算每只小鼠的平均懸掛時(shí)間作為評(píng)估值。

1.3.2 爬桿測(cè)試爬桿試驗(yàn)用于評(píng)估小鼠四肢的運(yùn)動(dòng)和協(xié)調(diào)性。自制長(zhǎng)約50 cm 直徑約1 cm 的木桿，用紗布包裹增加摩擦力。將木桿垂直放在水平桌子上，將小鼠輕輕放在桿子頂部，頭部朝下。小鼠在沒(méi)有外力驅(qū)動(dòng)的情況下沿著攀爬桿自主向下爬行，記錄從桿頂爬到底部所需的時(shí)間，即為爬桿時(shí)間。正式測(cè)試前每天訓(xùn)練3次，持續(xù)3 d［12］。實(shí)驗(yàn)正式開(kāi)始后，每4 周測(cè)試1 次，測(cè)試結(jié)果以15 s 為臨界值，超過(guò)15 s 的記錄為15 s。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，計(jì)算每只小鼠的3次爬桿平均時(shí)間作為評(píng)估值。

1.3.3 抓力測(cè)試通過(guò)測(cè)量小鼠前肢最大的抓力大小來(lái)評(píng)估小鼠四肢的肌肉力量。將小鼠放在測(cè)試板中央，輕輕拉動(dòng)鼠尾巴以鼓勵(lì)小鼠前肢抓住握板，當(dāng)它強(qiáng)行抓住抓握板時(shí)，及時(shí)以恒定速度施加力，拉動(dòng)小鼠尾巴以使小鼠松開(kāi)爪子。此時(shí)握力值即為小鼠的最大握力值。小鼠經(jīng)過(guò)訓(xùn)練后，每月測(cè)試1 次，每次重復(fù)3 次，取3 個(gè)結(jié)果中的最大值作為評(píng)估值。

1.3.4 步態(tài)測(cè)試在骨骼肌損傷的小鼠中，小鼠步行平衡能力和和速度會(huì)受到影響，步態(tài)會(huì)出現(xiàn)異常改變。我們采用小鼠行走跟蹤分析系統(tǒng)，獲得小鼠的自然步態(tài)，并對(duì)步態(tài)進(jìn)行鑒定和分析。該系統(tǒng)使用具有高速千兆以太網(wǎng)端口（150 幀/s）的德國(guó)相機(jī)和索尼CCD 的感光原理來(lái)實(shí)時(shí)跟蹤小鼠。它可以智能識(shí)別小鼠的身體、頭部、尾巴、四肢等部位的大小，并自動(dòng)對(duì)軌跡進(jìn)行分類，實(shí)現(xiàn)面積、步數(shù)、行走周期、運(yùn)動(dòng)速度、擺動(dòng)持續(xù)時(shí)間等的精確測(cè)量。

在使用該儀器之前，調(diào)整步行平臺(tái)到適當(dāng)?shù)膶挾?，使寬度與小鼠的大小相匹配，并設(shè)置標(biāo)尺和安裝相機(jī)，正確調(diào)整增益值和白平衡值，以獲得最佳錄制和拍攝效果。整個(gè)測(cè)試都應(yīng)該在安靜、黑暗的環(huán)境中進(jìn)行的。在正式測(cè)試之前，訓(xùn)練小鼠行走，并允許沿著50 cm 長(zhǎng)的玻璃路徑反復(fù)行走以熟悉環(huán)境。在正式測(cè)試期間，老鼠被放置在過(guò)道的入口處，老鼠會(huì)沿著玻璃通道行走。高速千兆以太網(wǎng)端口攝像頭收集步行數(shù)據(jù)，步行分析器系統(tǒng)軟件用于篩查。如果小鼠由于恐懼或嗅聞而在行走時(shí)暫停或轉(zhuǎn)身，則必須重復(fù)測(cè)量。如果自動(dòng)跡線分析不正確，可以手動(dòng)分析校準(zhǔn)跡線。

1.3.5 生化指標(biāo)檢測(cè)小鼠實(shí)施安樂(lè)死后，立即眼球取血收集新鮮血液。將血液樣品在4 ℃下以1 500×g離心10 min，凍存放在-80 ℃冰箱。在上機(jī)測(cè)試前，從冰箱取出血樣放在冰上等待其解凍。隨后使用HITACHI7080 自動(dòng)臨床分析儀（日本東京）測(cè)量血清肌酸激酶、血漿乳酸脫氫酶和血糖水平。

1.3.6 蘇木素伊紅染色（1）烘箱55 ℃烘片；（2）二甲苯脫蠟30 min；（3）隨后乙醇梯度脫蠟，5 min/次，后經(jīng)自來(lái)水洗。（4）蘇木精染色5～10 min；（5）鹽酸乙醇分化數(shù)秒；（6）自來(lái)水洗，返藍(lán)；（7）伊紅染色3 min 左右；（8）自來(lái)水洗后乙醇梯度脫水，5 min/次；（9）二甲苯透明30 min；（10）中性樹(shù)脂封片。蘇木精-伊紅染色試劑購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。在光學(xué)顯微鏡下觀察所有染色切片，并使用Image J 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3.7 天狼猩紅染色（1）烘箱55 ℃烘片，二甲苯脫蠟30 min；（2）乙醇梯度脫蠟，5 min/次；（3）天狼猩紅染色8～10 min 后流水沖洗；（4）蘇木素染色1 min 流水沖洗；（5）乙醇梯度脫水，5 min/次；（6）二甲苯中透明30 min；（7）中性樹(shù)脂封片。天狼猩紅染色試劑盒購(gòu)買于飛凈科研試劑有限公司，在光學(xué)顯微鏡下觀察所有染色切片，并使用Image J 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用GraphPad Prism 8.0.2 軟件，所有數(shù)據(jù)均表示均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，分析方法采用單因素方差分析或者雙因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠每周體質(zhì)量稱量結(jié)果小鼠稱重結(jié)果發(fā)現(xiàn)杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥小鼠體質(zhì)量明顯高于正常小鼠（P＜0.01），地夫可特組與模型組體質(zhì)量相比，小鼠在13 周齡和15 周齡出現(xiàn)差異（P＜0.05），其他時(shí)間段稱重與模型組小鼠體質(zhì)量相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 小鼠體質(zhì)量結(jié)果（n=7）Fig.1 Mouse weight Results

2.2 地夫可特提高小鼠運(yùn)動(dòng)能力在小鼠10 周齡、14 周齡、18 周齡時(shí)各進(jìn)行一次行為學(xué)測(cè)試，評(píng)估小鼠運(yùn)動(dòng)能力變化。懸掛測(cè)試評(píng)估小鼠肌肉力量和耐力（圖2A），發(fā)現(xiàn)與正常組小鼠相比，模型組小鼠懸掛支撐時(shí)間縮短（P＜0.01）。地夫可特組小鼠與模型組小鼠相比，懸掛支撐時(shí)間在14 周齡時(shí)出現(xiàn)延長(zhǎng)趨勢(shì)，在18 周齡時(shí)出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。爬桿耗時(shí)分析如圖2B 所示，10 周齡時(shí)正常組小鼠與模型組小鼠間存在差異（P＜0.05），隨著疾病進(jìn)展，兩組小鼠爬桿耗時(shí)差異逐漸明顯（14 周齡時(shí)P＜0.01，18 周齡時(shí)P＜0.001）。與模型組相比，地夫可特組小鼠爬桿耗時(shí)在18 周齡時(shí)出現(xiàn)顯著差異。采取前肢抓力測(cè)試評(píng)估小鼠肌肉力量如圖2C，可見(jiàn)10 周齡時(shí)正常組和模型組小鼠抓力測(cè)試即出現(xiàn)明顯差異（P＜0.0001），14 周齡和18 周齡測(cè)試發(fā)現(xiàn)其差異降低（P＜0.01）。相較于模型組小鼠，地夫可特組小鼠抓力值在14 周齡和18 周齡時(shí)均出現(xiàn)差異（P＜0.05）。

圖2 地夫可特提高小鼠運(yùn)動(dòng)能力（n=7）Fig.2 Deflazacort improved locomotor activity in mice

2.3 地夫可特減輕小鼠步態(tài)損傷小鼠18 周齡時(shí)，采取小鼠步態(tài)分析儀測(cè)試小鼠的四肢步態(tài)變化，分析小鼠四肢步幅距離和步行速度兩項(xiàng)指標(biāo)。發(fā)現(xiàn)模型組小鼠前肢（P＜0.001）和后肢（P＜0.01）步幅距離縮短，地夫可特增加了小鼠前肢步幅距離（P＜0.01），然而對(duì)改善后肢步幅距離無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖3A、B）。此外，發(fā)現(xiàn)模型組小鼠步行速度遠(yuǎn)低于正常組小鼠（P＜0.0001），地夫可特組小鼠前肢（P＜0.01）和后肢（P＜0.05）步行速度提高（圖3C、D）。

圖3 地夫可特減輕小鼠步態(tài)損傷（n=6）Fig.3 Deflazacort reduced gait impairment in mice

圖4 小鼠血清生化指標(biāo)檢測(cè)（n=6）Fig.4 Serum biochemical markers for mice

2.4 地夫可特治療對(duì)小鼠生化指標(biāo)的影響杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥的標(biāo)志是骨骼肌損傷，肌酸激酶和乳酸脫氫酶作為衡量骨骼肌損傷的重要指標(biāo)［13］，在杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥中會(huì)發(fā)生明顯變化。發(fā)現(xiàn)模型組小鼠血清中肌酸激酶和乳酸脫氫酶水平異常高于正常小鼠，尤其是肌酸激酶水平顯著升高（P＜0.000 1）。與模型組比較，地夫可特干預(yù)的小鼠血清肌酸激酶水平受到抑制（P＜0.05），以及乳酸脫氫酶水平具有降低趨勢(shì)。由于地夫可特作為糖皮質(zhì)激素的一種，可能會(huì)對(duì)血糖產(chǎn)生影響。我們檢測(cè)了小鼠血清中血糖含量，可見(jiàn)模型組小鼠與正常組小鼠相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而地夫可特組小鼠血糖水平升高（P＜0.01），提示我們地夫可特治療會(huì)對(duì)患者的血糖產(chǎn)生一定影響。

2.5 地夫可特減輕小鼠骨骼肌病理?yè)p傷小鼠腓腸肌和膈肌石蠟包埋后，進(jìn)行病理組織學(xué)檢查，觀察肌肉病變狀況。蘇木素伊紅染色結(jié)果顯示如圖5A，發(fā)現(xiàn)與正常組小鼠相比，模型組小鼠腓腸肌出現(xiàn)大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（P＜0.001），同時(shí)伴隨肌肉萎縮表現(xiàn)。與模型組小鼠相比，地夫可特組腓腸肌炎性細(xì)胞浸潤(rùn)的面積占比下降（P＜0.01）。小鼠膈肌天狼猩紅染色（圖5B-C），發(fā)現(xiàn)模型組小鼠肌肉切片中出現(xiàn)大量Ⅰ型膠原纖維沉積（P＜0.01）和炎性細(xì)胞聚集（P＜0.001）。地夫可特組膈肌炎性細(xì)胞浸潤(rùn)面積減少（P＜0.01），并且具有降低Ⅰ型膠原纖維沉積面積的趨勢(shì)。

3 討論

杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥作為一種伴X 隱性遺傳的肌肉退行性疾病，肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白突變導(dǎo)致肌肉的再生能力失調(diào)，導(dǎo)致肌肉修復(fù)障礙，繼而出現(xiàn)纖維化損傷，阻礙了肌肉的再生［14-16］。杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥被視作多系統(tǒng)疾病［17-18］，患者多年幼發(fā)病，青少年時(shí)期因骨骼肌運(yùn)動(dòng)能力嚴(yán)重?fù)p傷失去行走能力，最終于青年時(shí)期呼吸肌無(wú)力或者心肌衰竭致死［19］。研究發(fā)現(xiàn)隨著疾病進(jìn)展，杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥小鼠呈現(xiàn)體質(zhì)量增加、活躍度降低、懸掛支撐時(shí)間縮短、爬桿緩慢、抓力逐漸減小等變化。地夫可特治療對(duì)小鼠骨骼肌重量無(wú)明顯影響，治療4 周時(shí)提升小鼠抓力，治療8 周后明顯增加了懸掛支撐時(shí)間和前肢抓力，并減少了爬桿耗費(fèi)時(shí)間。以上結(jié)果說(shuō)明隨著地夫可特干預(yù)時(shí)間延長(zhǎng)，其對(duì)杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥小鼠肌肉力量和運(yùn)動(dòng)耐力的改善作用逐漸加強(qiáng)。步態(tài)分析發(fā)現(xiàn)地夫可特增加杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥小鼠前后肢步行速度和前肢步行距離，尤其是在改善前肢步態(tài)方面效果尤其明顯。

肌酸激酶作為衡量骨骼肌損傷的重要指標(biāo)，在杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥中會(huì)發(fā)生明顯變化［20-21］。生化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)地夫可特治療降低了小鼠肌酸激酶水平，同時(shí)具有減輕乳酸脫氫酶的趨勢(shì)，然而它對(duì)小鼠血糖產(chǎn)生一定影響，提醒我們高血糖患者使用該藥時(shí)應(yīng)監(jiān)控血糖變化。此外，杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥肌肉伴隨炎癥病變［22］，病理組織學(xué)分析提示杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥小鼠骨骼肌大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和膠原纖維積聚，暗示此疾病可能是通過(guò)激活炎癥反應(yīng)促進(jìn)纖維化過(guò)程加重骨骼肌損傷。地夫可特治療具有重要的抗炎作用，并且具有減輕肌肉纖維化的潛力。

以上分析表明地夫可特治療增強(qiáng)杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥小鼠肌肉力量和耐力，改善步態(tài)緩滯失衡表現(xiàn)，同時(shí)具有減輕肌肉炎癥損傷，削弱肌肉纖維化損傷的趨勢(shì)。提示地夫可特可能是通過(guò)減輕炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和膠原纖維聚集，從而緩解骨骼肌病變，提高運(yùn)動(dòng)耐力和力量。后續(xù)還需從分子機(jī)制層面探討地夫可特對(duì)杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥小鼠骨骼肌炎癥和纖維化損傷的治療機(jī)制，尋找藥物作用的分子靶標(biāo)，進(jìn)一步為肌肉退行性疾病的治療提供一定的科學(xué)依據(jù)。