黨參莖基腐病病原鑒定及其防治藥劑的篩選

馮明橋 馮育才 勾偉 雷嬌嬌 韓繼懷 江龍 王尤 汪珊

摘要 ［目的］ 明確貴州省道真縣黨參莖基腐病的病原及其防治藥劑。［方法］ 利用組織分離法和柯赫氏法則進(jìn)行病原菌的分離和致病性驗(yàn)證，利用形態(tài)學(xué)與 rDNA－ITS 對(duì)致病菌進(jìn)行鑒定，之后通過(guò)大田防治試驗(yàn)測(cè)定5種殺菌劑對(duì)黨參莖基腐病的防治效果。［結(jié)果］ 引起道真黨參莖基腐病的病原菌為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）；殺菌劑大田防治試驗(yàn)結(jié)果表明，50%多菌靈可濕性粉劑對(duì)病害的防治效果最佳，病害防治效果為81.63%；25%甲霜靈可濕性粉劑的防治效果次之，防治效果為74.49%；40%乙膦鋁可濕性粉劑、65%代森鋅可濕性粉劑、70%甲基硫菌靈可濕性粉劑對(duì)黨參莖基腐病的防治效果較差為30.61%～51.02%。 ［結(jié)論］道真大沙河黨參莖基腐病的病原為尖孢鐮刀菌，50%多菌靈可濕性粉劑對(duì)黨參莖基腐病的防治效果較好。

關(guān)鍵詞 黨參；莖基腐??；鐮刀菌；病原菌鑒定；防治藥劑

中圖分類號(hào) S435.672? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A? 文章編號(hào) 0517-6611（2023）13-0132-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.13.031

Identification of the Pathogen of Codonopsis pilosula Stem Base Rot and Screening of Its Control Agents

FENG Ming-qiao，F(xiàn)ENG? Yu-cai，GOU? Wei? et al

（Guizhou Dashahe Provincial Nature Reserve Administration Bureau， Daozhen，Guizhou?? 563500）

Key words ［Objective］ To identify the pathogen of stem base rot of Codonopsis pilosula in Daozhen County， Guizhou Province and its control agents. ［Method］ The pathogenic bacteria were isolated and verified by tissue isolation method and Koch's rule. The pathogenic bacteria were identified by morphology and rDNA ITS， and then the control effect of five fungicides on stem base rot of Codonopsis pilosula was determined by field control test. ［Result］ Fusarium oxysporum was the pathogen causing the stem base rot of Codonopsis pilosula.The field control experiment of fungicide showed that 50% carbendazim wettable powder had the best effect on disease control， and the disease control effect was 81.63%;the control effect of 25% metalaxyl wettable powder was the second， and the disease control effect was 74.49%;40% ethyl phosphine aluminum wettable powder， 65% Daisen zinc wettable powder and 70% thiophanate methyl wettable powder had a poor effect on the stem base rot of Codonopsis pilosula， which was 30.61%-51.02%. ［Conclusion］ The pathogen of stem base rot of Codonopsis pilosula in Daozhen Dasha River was F. oxysporum， and 50% carbendazim wettable powder had good control effect on stem base rot of Codonopsis pilosula.

Key words Codonopsis pilosula;Stem base rot;Fusarium oxysporum;Pathogen identification;Control agents

基金項(xiàng)目 貴州省林業(yè)廳2017年林業(yè)優(yōu)秀青年人才培養(yǎng)專項(xiàng)“洛黨參病蟲害調(diào)查及主要病蟲害綠色防控技術(shù)研究”（黔林科合J〔2017〕15號(hào)）。

作者簡(jiǎn)介 馮明橋（1987—），男，貴州正安人，工程師，從事自然保護(hù)區(qū)管理及科學(xué)研究。通信作者，高級(jí)工程師，從事自然保護(hù)區(qū)科學(xué)研究。

收稿日期 2022-08-08

黨參（Codonopsis pilosula（Franch.）Nannf.）為桔?？泣h參屬多年生草本植物，其根性平、味甘，具有補(bǔ)中益氣、健脾益肺之功效［1］，還具有免疫調(diào)節(jié)、改善胃潰瘍、抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)糖脂代謝及抗腫瘤等藥理作用［2］。研究表明，黨參富含生物堿、聚炔類、木質(zhì)素類、黃酮類化合物和多糖等活性成分［3］。隨著市場(chǎng)需求加大，貴州黨參的種植面積不斷增加，病害問(wèn)題日益加重。劉春葉等［4］在貴州道真縣洛黨參主要病害發(fā)生動(dòng)態(tài)中發(fā)現(xiàn)了白粉病（Sphaerotheca codonopisi）、根腐病（Fusarium oxysporiums）和銹?。≒uccinia campanumoeae）。2021年，首次在道真的黨參上發(fā)現(xiàn)莖基腐病，為害面積

呈逐年上升趨勢(shì)，據(jù)調(diào)查，一般田間發(fā)病率為5%～10%，嚴(yán)重的達(dá)30%以上，該病害已成為制約當(dāng)?shù)攸h參發(fā)展的主要因素之一，嚴(yán)重影響了黨參的產(chǎn)量與品質(zhì)，給種植戶帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失［5］。筆者從形態(tài)學(xué)以及分子生物學(xué)對(duì)黨參莖基腐病病原菌進(jìn)行分離與鑒定、致病性的檢測(cè)及防治藥劑的簡(jiǎn)單篩選，為進(jìn)一步了解道真的黨參莖基腐病病害防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試黨參來(lái)自貴州省道真縣陽(yáng)溪鎮(zhèn)陽(yáng)壩村黨參種植基地1年生苗。防治試驗(yàn)所用藥劑見(jiàn)表1。

1.2 試驗(yàn)地概況

田間試驗(yàn)在貴州省道真縣陽(yáng)溪鎮(zhèn)陽(yáng)壩村（107°38′2″～107°38′41″E、29°8′18″～29°8′56″N）進(jìn)行，平均海拔1 550.2 m，月平均氣溫0.6～22.6 ℃，空氣濕度11.2%～77.1%，pH 5.4～6.9。

1.3 病樣采集與病原菌分離和純化

2022年4月在貴州省道真大沙河自然保護(hù)區(qū)黨參生產(chǎn)基地采集發(fā)病植株，裝入塑封袋帶回實(shí)驗(yàn)室。采用常規(guī)組織分離法，剪取莖基部病健交界處1 mm×1mm 組織塊在 75%乙醇中浸泡 5 s，然后轉(zhuǎn)移至1.5%次氯酸鈉溶液中消毒1 min，無(wú)菌水漂洗3次晾干，置于 PDA 培養(yǎng)基平板內(nèi)于 25 ℃培養(yǎng) 5～7 d。從菌落邊緣切取菌絲塊置于PDA 培養(yǎng)基，在25 ℃培養(yǎng)7～10 d。將分離純化的菌株轉(zhuǎn)接至PDA斜面4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 致病性測(cè)定

利用無(wú)菌昆蟲針挑取PDA培養(yǎng)的疑似致病菌的菌絲，穿刺黨參幼苗莖部，后用無(wú)菌土掩埋莖基部。每個(gè)菌株接種處理30株黨參苗，以無(wú)菌昆蟲針穿刺黨參幼苗莖部作為對(duì)照。以上接種處理30 d后，觀察并記錄黨參發(fā)病情況，統(tǒng)計(jì)發(fā)病率和病情指數(shù)。病情指數(shù)根據(jù)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行測(cè)定：0級(jí)，莖基部沒(méi)有病斑；1級(jí)，莖基部有輕微病斑，病斑面積占 5%；3級(jí)，莖基部有病斑，病斑面積占10%；5級(jí)，莖基部有嚴(yán)重病斑，病斑面積占25%；7級(jí)，莖基部有嚴(yán)重病斑，病斑面積占50%以上［6］。病害發(fā)生率和病情指數(shù)的計(jì)算公式：

病害發(fā)生率=發(fā)病株數(shù)調(diào)查總株數(shù)×100%

病情指數(shù)=（各級(jí)發(fā)病數(shù)×相對(duì)應(yīng)病級(jí)）調(diào)查總株數(shù)×5×100

1.5 黨參莖基腐病病原菌的鑒定

參考Weir等［7］方法進(jìn)行病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定，主要對(duì)病原菌菌落特征、顏色、菌絲及孢子大小等進(jìn)行觀察。參考李婕等［8-9］的方法利用rDNA -ITS分子測(cè)序?qū)Σ≡M(jìn)行測(cè)序，具體方法：首先利用CTAB法提取病原菌總DNA，利用真菌通用引物ITS1（5′－TCCGTAGGTGAACCTGCGG－3′）和 ITS4（5′－TCCTCCGCTTATTGATATGC－3′）進(jìn)行序列擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系和反應(yīng)程序與漆永紅等［6］的方法一致。得到序列后通過(guò)NCBI的Blast 進(jìn)行序列的比對(duì)分析，同時(shí)利用 MEGA 7.0進(jìn)行包含致病菌 ITS 序列在內(nèi)的系統(tǒng)進(jìn)化樹，綜合形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)的方法進(jìn)行病原菌的鑒定。

1.6 田間防治試驗(yàn)

設(shè)計(jì)5個(gè)處理，即表1中的5種藥劑，清水處理作為對(duì)照。每個(gè)處理的小區(qū)面積為2 m×10 m，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。于2022年5月試驗(yàn)地有莖基腐病發(fā)生時(shí)開(kāi)始藥劑噴施，從第1次噴施開(kāi)始，每隔10 d噴藥1次，連續(xù)噴藥3次。每種藥劑的用量為1 500 g/hm2。在最后一次噴藥10 d后統(tǒng)計(jì)黨參莖基腐病的病害發(fā)生率和病情指數(shù)進(jìn)而計(jì)算防治效果。防治效果計(jì)算公式：

防治效果=對(duì)照病情指數(shù)-處理對(duì)照指數(shù)對(duì)照病情指數(shù)×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 黨參莖基腐病致病菌分離及致病性檢測(cè)

道真黨參莖基腐病田間發(fā)病癥狀見(jiàn)圖1A。黨參莖基腐病發(fā)生初期，在莖的基部產(chǎn)生白色的小菌落，腐爛狀，向上延伸至葉片周圍，葉片感病以后變薄變透明的同時(shí)逐漸腐爛，其間葉子漸變成黃綠色。后期莖基和葉片成水漬狀癱軟匍匐在地上，直至整個(gè)植株稀爛于地上。采用組織分離法由黨參莖基部分離獲得真菌20余菌株，通過(guò)形態(tài)學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其中15種屬于鐮刀菌屬（Fusarium spp.）真菌。選取15個(gè)鐮刀菌屬真菌中的5個(gè)菌株（DS-1、DS-2、DS-3、DS-4、DS-5）進(jìn)行黨參大田的回接試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)5個(gè)菌株均可引起黨參莖基腐?。▓D1B）。5個(gè)菌株引起黨參莖基腐病的病害發(fā)生率為85%～92%，病情指數(shù)為76～88。其中，菌株DS-4的發(fā)病率和病情指數(shù)最高分別為92%和88。

2.2 黨參莖基腐病病原菌的形態(tài)學(xué)特征

對(duì)回接試驗(yàn)引起發(fā)病的5個(gè)菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)其在PDA培養(yǎng)基上的顏色、質(zhì)地相同，菌絲和孢子一致。在PDA培養(yǎng)基上菌落白色、粉色至紫色。大型分生孢子鐮孢形，中間粗，兩端尖細(xì)，具3～5個(gè)橫隔膜，多為3個(gè)隔，大小為（23.5～32.9）μm×（2.4～3.5）μm，足胞明顯。小型分生孢子橢圓形、長(zhǎng)橢圓形，單胞，無(wú)色，假頭狀，大小為（3.5～14.1）μm×（1.8～2.9）μm。根據(jù)形態(tài)特征，查閱真菌鑒定手冊(cè)，5個(gè)引起黨參莖基腐病菌株的形態(tài)學(xué)特征與尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）一致（圖2）。

2.3 病原菌分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

隨機(jī)選取5個(gè)致病菌株的1個(gè)進(jìn)行DNA的提取和rDNA-ITS序列的擴(kuò)增。結(jié)果獲得長(zhǎng)度為541 bp 的序列。 NCBI 的 Blast 比對(duì)結(jié)果顯示，該序列與 GenBank 登錄號(hào)為MW760815的F.oxysporum的序列覆蓋度為 100%，序列相似性為 100% 。由圖3可知，致病菌株的ITS序列與尖孢鐮刀菌聚為一類，親緣關(guān)系較近。由此結(jié)合形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)鑒定黨參莖基腐病的病原菌為尖孢鐮刀菌。菌株DS-4的GenBank號(hào)為OP164704。

2.4 不同殺菌劑對(duì)黨參莖基腐病的田間防治效果

由表2可知，清水處理下黨參莖基腐病的發(fā)生率達(dá)95%，且病情指數(shù)較高達(dá)98。5種藥劑處理下，黨參莖基腐病的病害發(fā)生率和病情指數(shù)均有所下降。其中，多菌靈600倍液處理下的病害發(fā)生率最低為28%，病情指數(shù)為18，防治效果達(dá)81.63%；其次是甲霜靈500倍液處理下的病害發(fā)生率為35%，病情指數(shù)為25，防治效果達(dá)74.49%。而另外3種藥劑處理，黨參莖基腐病的病害發(fā)生率均高于56%，防治效果36.73%～51.02%。

3 結(jié)論與討論

貴州道真地區(qū)春季濕熱多雨，黨參4—5月處于幼苗時(shí)期，易受病害的侵染，而對(duì)病害的有效防治必須要準(zhǔn)確掌握引起病害的病原菌［10］，故該研究對(duì)貴州道真黨參的莖基腐病致病菌進(jìn)行分離純化、致病性檢測(cè)，并通過(guò)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行分析，確定引起黨參莖基腐病的主要致病菌為尖孢鐮刀菌。尖孢鐮刀菌是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中土傳病害的重要病原菌之一，具有很強(qiáng)的寄生和腐生能力，目前已報(bào)道的黨參病害中，尖孢鐮刀菌是根腐病病原菌的優(yōu)勢(shì)菌種［11-13］。該試驗(yàn)中，選取5種常用化學(xué)藥劑對(duì)黨參莖基腐病進(jìn)行簡(jiǎn)單的防治，結(jié)果表明，多菌靈對(duì)黨參莖基腐病的防治效果較好，為黨參莖基腐病的田間防治提供理論依據(jù)。但需要注意的是，該研究的防治試驗(yàn)是在發(fā)病初期開(kāi)始連續(xù)噴施，進(jìn)而取得了更好的防治效果。不同地區(qū)應(yīng)根據(jù)病害發(fā)生規(guī)律，在早期予以施藥。此外，需要注意在病害防治過(guò)程中，長(zhǎng)期且單一地使用同一種化學(xué)藥劑進(jìn)行病害防治，病原菌可能會(huì)對(duì)其產(chǎn)生抗性，防治效果會(huì)逐漸減弱，故在實(shí)際生產(chǎn)中，應(yīng)多種藥劑交替使用，且發(fā)現(xiàn)病株以后，應(yīng)及時(shí)對(duì)病害侵染地進(jìn)行消殺工作，防止其進(jìn)一步擴(kuò)大。

參考文獻(xiàn)

［1］ 李忠虎，藺海明，陳垣，等.不同干燥方式對(duì)黨參多糖含量的影響［J］.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，42（3）：64-67.

［2］ 劉美霞，戚進(jìn)，余伯陽(yáng).黨參藥理作用研究進(jìn)展［J］.海峽藥學(xué)，2018，30（11）：36-39.

［3］ 謝琦，程雪梅，胡芳弟，等.黨參化學(xué)成分、藥理作用及質(zhì)量控制研究進(jìn)展［J］.上海中醫(yī)藥雜志，2020，54（8）：94-104.

［4］ 劉春葉，張盈，廖國(guó)會(huì)，等.貴州道真縣洛黨參主要病害發(fā)生動(dòng)態(tài)及防控對(duì)策［J］.中國(guó)植保導(dǎo)刊，2018，38（9）：53-57.

［5］ 龔成文，米永偉，漆永紅，等.甘肅中藥材連作障礙問(wèn)題探析［J］.甘肅科技，2020，36（4）：153-155.

［6］ 漆永紅，李敏權(quán)，曹素芳，等.黨參莖基腐病鐮孢菌鑒定及其對(duì)殺菌劑的敏感性研究［J］.農(nóng)學(xué)學(xué)報(bào)，2021，11（2）：74-78.

［7］ WEIR B S，JOHNSTON P R，DAMM U.The Colletotrichum gloeosporioides species complex［J］.Studies in mycology，2012，73（1）：115-180.

［8］ 李婕，李永川，楊虹，等.甘蔗黑腐病病原菌的鑒定［J］.云南大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2014，36（1）：139-143.

［9］ 劉小玉，余鳳玉，付登強(qiáng)，等.油茶炭疽病病原菌的分離與鑒定［J］.中國(guó)果菜，2018，38（11）：40-42.

［10］ 王珊珊，乜蘭春，李潘，等.植物病原真菌毒素的分類、致病機(jī)制及應(yīng)用前景［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019，47（3）：94-97.

［11］ 趙純森，李德望，衛(wèi)揚(yáng)斗，等.黨參根腐病病株上分離的幾種病原真菌的致病性及其生物學(xué)特性：黨參根腐病研究續(xù)報(bào)Ⅰ［J］.湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，1989，28（6）：23-25.

［12］ 余中蓮，雷美艷，蒲盛才，等.重慶黨參真菌病害種類調(diào)查及病原鑒定［J］.中藥材，2015，38（6）：1119-1122.

［13］ 孫新榮，張西梅，高薇薇，等.甘肅黨參根腐病發(fā)生危害與防治［J］.陜西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019，65（12）：90-91.