響應(yīng)曲面法優(yōu)化黑皮雞樅液體配方研究

黃靜 李鵬 和耀威 劉忠玄 向準

摘要 ［目的］以貴州省生物研究所保藏的黑皮雞樅“HP1號”菌株為研究對象，研究不同營養(yǎng)物質(zhì)對黑皮雞樅菌絲生長的影響。［方法］采用單因素試驗和響應(yīng)曲面法試驗對黑皮雞樅的營養(yǎng)需求進行優(yōu)化。［結(jié)果］黑皮雞樅最佳碳源為玉米粉，最佳氮源為酵母膏，維生素B1最適含量為10.0 mg/L。［結(jié)論］適宜黑皮雞樅液體培養(yǎng)的最佳配方為玉米粉24.0 g/L，酵母膏5.0 g/L，磷酸二氫鉀2.0 g/L，硫酸鎂1.0 g/L，維生素B1 10.0 mg/L。

關(guān)鍵詞 黑皮雞樅；生物量；響應(yīng)曲面法

中圖分類號 S646? 文獻標識碼 A? 文章編號 0517-6611（2023）13-0049-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.13.012

Study on Optimization of Liquid Formula of Oudemansiella Radicata by Response Surface Method

HUANG Jing， LI Peng，HE Yao-wei et al

（Guizhou Institute of Biology，Guiyang，Guizhou? 550009）

Abstract ［Objective］The effect of different nutrients on the mycelial growth of O.radicata was studied with the strain ‘HP1 of O.radicata preserved in Guizhou Institute of Biology. ［Method］The single factor test and response surface methodology were used to optimize the nutritional requirements of O.radicata.［Result］The optimum carbon source of O.radicata was corn meal， the optimum nitrogen source was yeast extract， and the optimum content of vitamin B1 was 10.0 mg/L. ［Conclusion］The optimum formula suitable for the liquid culture of O.radicata was corn meal 24.0 g/L， yeast extract 5.0 g/L， potassium dihydrogen phosphate 2.0 g/L， magnesium sulfate 1.0 g/L， vitamin B1 10.0 mg/L.

Key words O. radicata;Biomass;Response surface method

基金項目 貴州省食用菌現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)（GZCYTX2023-03）。

作者簡介 黃靜（1993—），女，貴州遵義人，研究實習員，碩士，從事食用菌栽培與病蟲害防控研究。通信作者，副研究員，碩士，從事食用菌栽培示范推廣研究。

收稿日期 2022-11-29

黑皮雞樅（O.radicata sensu Horak；Fide Segedin & P ennycook）屬于白蘑科小奧德蘑屬，又名長根奧德蘑、長根金錢菌、長根菇、長壽菇等［1-2］，是新近商業(yè)化栽培的熱點食用菌之一。黑皮雞樅香味馥郁，肉質(zhì)鮮美，富含氨基酸、多糖、礦物質(zhì)元素及蛋白質(zhì)等多種營養(yǎng)成分［3］，具有較高的藥用價值，具有健脾益氣、降血壓、抑制腫瘤等功效［4-5］，是一種珍稀食藥用菌。黑皮雞樅屬中高溫型真菌，主要分布在亞熱帶與北溫帶地區(qū)［6］。黑皮雞樅在2006年實現(xiàn)人工栽培［7］，經(jīng)過不斷優(yōu)化菌種技術(shù)及栽培技術(shù)，已初步實現(xiàn)規(guī)模化栽培［8］。由于我國黑皮雞樅栽培歷史相對較短，菌種配方不穩(wěn)定，菌種活力弱，導致規(guī)?；a(chǎn)可重復性差、病蟲害嚴重、產(chǎn)量低等問題［9-10］。因此，筆者通過在前期對黑皮雞樅液體培養(yǎng)基單因素優(yōu)化的基礎(chǔ)上，進一步明確培養(yǎng)基中的碳源、氮源和維生素的含量；通過響應(yīng)曲面優(yōu)化設(shè)計試驗研究各成分之間的相互作用，從而獲得最佳的液體培養(yǎng)基配方，旨在為黑皮雞樅的規(guī)?；a(chǎn)提供優(yōu)質(zhì)菌種的同時，也為黑皮雞樅的品種選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌株黑皮雞樅“HP1號”由貴州省生物研究所提供。

馬鈴薯綜合培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200.0 g，葡萄糖20.0 g，蛋白胨3.0 g，KH2PO4 2.0 g，MgSO4·7H2O 1.0 g，維生素B1 10.0 mg，瓊脂粉20.0 g，水1 000 mL。

供試培養(yǎng)基：葡萄糖20.0 g，蛋白胨3.0 g，KH2PO4 2.0 g，MgSO4·7H2O 1.0 g，水1 000 mL。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養(yǎng)條件。

1 000 mL搖瓶裝液量400 mL，振蕩培養(yǎng)箱轉(zhuǎn)速165 r/min，培養(yǎng)溫度25 ℃，培養(yǎng)周期8 d。

1.2.2 生物量測定。

選擇過濾網(wǎng)抽濾去掉培養(yǎng)液，用蒸餾水清洗菌絲體表面并濾掉洗液，重復4～6次，洗凈的菌絲體用烘箱60 ℃烘干至恒重，稱重［11］。

1.2.3 單因素試驗。

①碳源對黑皮雞樅菌絲生長的影響。選用玉米粉、蔗糖、紅糖、果糖、小麥粉、可溶性淀粉、D-木糖7種物質(zhì)為碳源，按配比加入培養(yǎng)基，以葡萄糖為對照，制作液體培養(yǎng)基，在0.12 MPa、121 ℃下滅菌30 min。3次重復。②氮源對黑皮雞樅菌絲生長的影響。選用黃豆粉、麥麩、牛肉膏、谷氨酸、酵母膏、豆粕粉6種物質(zhì)為氮源，按配比加入培養(yǎng)基，以蛋白胨為對照，制作液體培養(yǎng)基，在0.12 MPa、121 ℃下滅菌30 min。3次重復，測定菌絲生物量。③生長因子維生素B1對黑皮雞樅菌絲生長的影響。以葡萄糖20.0 g、蛋白胨3.0 g、KH2PO4 2.0 g、MgSO4·7H2O 1.0 g、水1 000 mL作為該試驗的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別添加不同含量的維生素B1，測定其菌絲生物量。

1.2.4 響應(yīng)曲面法優(yōu)化。

利用響應(yīng)曲面法優(yōu)化［12-13］（表1），在上述單因素試驗基礎(chǔ)上，分別選取碳源（A）、氮源（B）和維生素B1（C）3個因子為試驗對象，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以玉米粉作為碳源、酵母膏作為氮源、維生素B1作為生長因子，菌絲體干重為響應(yīng)值，采用響應(yīng)曲面法確定黑皮雞樅液體培養(yǎng)的最佳營養(yǎng)條件。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)均利用 SPSS Statistics 18和design-expert 8.0.6進行統(tǒng)計分析（P<0.05），并利用軟件進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 不同碳源對黑皮雞樅菌絲量的影響。

由表2可知，7種碳源中，黑皮雞樅菌絲對玉米粉的利用最好，菌絲干重達8.67 g/L，菌絲萌發(fā)最快，菌球直徑為3～5 mm，密度大且菌液澄清；其次是小麥粉和蔗糖，菌絲萌發(fā)較快，菌球直徑為4～8 mm、密度中等，以小麥粉為碳源時，菌液有點渾濁；對葡萄糖、蔗糖等其他碳源的利用相對較差。菌絲萌發(fā)時間稍長，菌球大、密度低。說明黑皮雞樅菌絲生長的最適碳源為玉米粉。

2.1.2 不同氮源對黑皮雞樅菌絲生物量的影響。

由表3可知，在所選氮源中，黑皮雞樅菌絲對酵母膏的利用率最高，菌絲干重達8.75 g/L，菌絲萌發(fā)最快，菌球直徑為4～6 mm，大小均勻，密度高；其次麥麩、豆粕粉、蛋白胨，菌球大小比較均勻、密度中等；對谷氨酸的利用最差，菌絲萌發(fā)需要時間最長，生成的菌球偏大、不均勻且密度低。綜上所述，黑皮雞樅菌絲生長的最適氮源為酵母膏。

2.1.3 不同維生素B1含量對黑皮雞樅菌絲生物量的影響。

由圖1可知，維生素B1對黑皮雞樅菌絲的生長沒有決定性的營養(yǎng)作用，但適當添加維生素B1，可在一定程度上促進菌絲的生長，當維生素B1在培養(yǎng)基中含量增加到10.0 mg/L時，菌絲干重達到最高為9.3 g/L；菌絲萌發(fā)較快，菌球中等，大小較均勻，菌液清澈，密度中等；當維生素B1在培養(yǎng)基中的含量增加到15.0 mg/L時，菌絲干重開始緩慢下降為8.63 g/L。因此，確定維生素B1的含量為10.0 mg/L。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果

由表4可知，以A、B和C為響應(yīng)變量，以Y值為響應(yīng)值對表4數(shù)據(jù)進行處理，得到表5方差分析表，利用Design-Expert 8.0.6軟件進行二次多項式擬合，得到預測模型：

R1=+11.31+0.88A+0.33B-0.25C+0.92AB-0.39AC+0.15BC-1.11A2-1.10B2+0.64C2

表5結(jié)果表明，A-A、B-B、AB、A2、C2和B2項差異極顯著，C-C和AC項差異顯著，BC項差異不顯著。模型P值<0.000 1，可信度水平大于99.99%，說明該模型有意義，所擬合的回歸方程合適。復相關(guān)系數(shù)R2=0.986 1，表明相關(guān)性好，該模型失擬值P值0.395 8>0.05，失擬值不顯著，說明試驗可信。另外從F值可以看出，3個因素對菌絲生物轉(zhuǎn)化率的影響順序為A>B>C，即玉米粉>酵母膏>維生素B1。

利用回歸方程分析黑皮雞樅菌絲的干重和各因素變化的響應(yīng)曲面圖。由響應(yīng)曲面圖可知，玉米粉、酵母膏和維生素B1各因素對菌絲干重的影響。每個響應(yīng)面表示2個獨立因素之間的交互作用，另一個因素保持在0水平編碼。

玉米粉質(zhì)量濃度與酵母膏質(zhì)量濃度兩因素的交互作用極顯著，在酵母膏質(zhì)量濃度較高時，隨著玉米粉質(zhì)量濃度升高，黑皮雞樅菌絲干重迅速上升至平緩，隨后下降；在酵母膏質(zhì)量濃度較低時，隨著玉米粉質(zhì)量濃度升高，黑皮雞樅的菌絲干重緩慢上升至平穩(wěn)，隨后下降；在玉米粉質(zhì)量濃度較高時，隨著酵母膏質(zhì)量濃度上升，黑皮雞樅菌絲干重緩慢上升至平穩(wěn)，隨后下降；在玉米粉質(zhì)量濃度較低時，黑皮雞樅菌絲干重緩慢上升至平穩(wěn)，隨后略有下降（圖2）。

玉米粉質(zhì)量濃度與維生素B1含量兩因素的交互作用極顯著，在維生素B1含量較低時，隨著玉米粉質(zhì)量濃度升高，黑皮雞樅菌絲干重緩慢上升至平緩，隨后略有下降；在維生素B1含量較高時，隨著玉米粉質(zhì)量濃度升高，黑皮雞樅菌絲干重緩慢上升至平緩，隨后迅速下降；在玉米粉質(zhì)量濃度較低時，隨著維生素B1含量升高，黑皮雞樅菌絲干重均緩慢上升；在玉米粉質(zhì)量濃度較高時，隨著維生素B1含量升高，黑皮雞樅菌絲干重呈緩慢下降趨勢（圖3）。

3 結(jié)論與討論

黑皮雞樅是一種含有豐富營養(yǎng)價值的食用菌，是近年來比較熱門、栽培前景廣的商業(yè)化栽培食用菌。在西南地區(qū)有小規(guī)模栽培，存在產(chǎn)量少、質(zhì)量不穩(wěn)定、人工成本高等問題，遠不能滿足當?shù)厥袌龅男枨?。其中菌種是制約黑皮雞樅產(chǎn)業(yè)發(fā)展的因素之一。

該研究以菌株HP1為試驗材料，對其營養(yǎng)需求進行研究，將所得數(shù)據(jù)通過Design-Expert 8.0.6軟件分析得出，影響黑皮雞樅菌絲生長最佳碳源為玉米粉23.82 g/L，最佳氮源為酵母膏5.22 g/L，最佳維生素B1 10.46 mg/L，為方便試驗將優(yōu)化后的配方調(diào)整，得出最優(yōu)配方為玉米粉24.0 g/L，酵母膏5.0 g/L，維生素B1 10.0 mg/L。此營養(yǎng)條件下，黑皮雞樅菌絲體的干重（理論）為11.40 g/L。在此培養(yǎng)條件下進行3次平行重復試驗驗證，均值為11.39 g/L。與最優(yōu)值相近，進而說明模型的可靠性良好，擬合度良好。相比現(xiàn)有報道，該研究所得黑皮雞樅菌絲生物轉(zhuǎn)化率較高，菌絲球小、密度大且大小均勻，同時生產(chǎn)工藝簡單且成本低、重復性強，非常適用于黑皮雞樅的栽培前期準備，提升菌種穩(wěn)定性和增強抗逆性等，也為黑皮雞樅高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻

［1］ 李玉，李泰輝，楊祝良，等.中國大型菌物資源圖鑒［M］.鄭州：中原農(nóng)民出版社，2015.

［2］ 歐勝平，程顯好，高興喜，等.卵孢小奧德蘑固體培養(yǎng)特性及營養(yǎng)成分分析［J］.中國食用菌，2017，36（5）：52-59.

［3］ 羅影，關(guān)永強，賈培松，等.黑皮雞樅的分子鑒定與營養(yǎng)需求研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學，2021，49（16）：44-50.

［4］ CAO Y R，ZHANG X Y，DENG J Y，et al.Lead and cadmium-induced oxidative stress impacting mycelial growth of Oudemansiella radicata in liquid medium alleviated by microbial siderophores［J］.World J Microbiol Biotechnol，2012，28（8）：1727-1737.

［5］ LIU Q，ZHU M J，GENG X R，et al.characterization of polysaccharides with antioxidant and hepatoprotective activities from the edible mushroom Oudemansiella radicata［J］.Molecules，2017，22（2）：1-16.

［6］ 李玉.菌物資源學［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2013.

［7］ 孫思國，劉宏偉.黑皮雞樅菌生產(chǎn)方法：CN200710115866.7［P］.2008-07-16.

［8］ 連靜.“菌中之侯”——黑皮雞樅菌在山東金鄉(xiāng)縣人工規(guī)?；苣暝耘喑晒Γ跩］.食用菌，2013，35（4）：71.

［9］ 陳誠，李小林，劉定權(quán)，等.黑皮雞樅病蟲害防治技術(shù)［J］.四川農(nóng)業(yè)科技，2019（10）：33-34.

［10］ 葉雷，劉定權(quán)，趙建龍，等.黑皮雞樅菌工廠化生產(chǎn)關(guān)鍵技術(shù)［J］.南方農(nóng)業(yè)，2019，13（31）：8-12.

［11］ 張一帆，陳多揚，周振輝，等.草菇液體菌種培養(yǎng)過程的變化和培養(yǎng)終點的研究［J］.種子，2012，31（12）：9-13，20.

［12］ 趙航軻，陳杭，馬薇，等.響應(yīng)面法優(yōu)化羊肚菌液體發(fā)酵營養(yǎng)條件［J］.食用菌，2021，43（2）：11-15.

［13］ 張杰，侯潞丹，賀志斌.響應(yīng)面試驗優(yōu)化杏鮑菇液體發(fā)酵菌種培養(yǎng)條件［J］.食品科學，2017，38（6）：147-152.