張朋,丁朋,丁利,耿影,付婷偉 ,寧曉雅
1.徐州天益食品科技研究院有限公司(徐州 210009);2.徐州工程學(xué)院食品(生物)工程學(xué)院(徐州 221111);3.江蘇省食品資源開發(fā)與質(zhì)量安全重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室,徐州工程學(xué)院(徐州 221111)
多酚類物質(zhì)是植物的重要代謝產(chǎn)物,廣泛存在于果蔬、谷物、豆類等植物組織中[1]。就植物自身而言,多酚類物質(zhì)對(duì)其生長和繁殖會(huì)起到不可替代的作用[2]?,F(xiàn)代研究表明,多酚類物質(zhì)具有顯著的自由基清除、防衰抗老、防輻射、抗癌、降糖、抑制脂質(zhì)過氧化、防治心腦血管疾病等多重生理功效[3-6]。此外,多酚類物質(zhì)作為天然的功能因子還可在食品加工過程中輔助形成特定食品的苦澀味、顏色、香氣,是食品感官及營養(yǎng)質(zhì)量的重要決定因素[7]。因此,植物源多酚類物質(zhì)具有巨大的開發(fā)潛力和應(yīng)用潛力。
牛蒡根是我國傳統(tǒng)的具有較高藥用價(jià)值和保健價(jià)值的藥食用蔬菜[8]。牛蒡根富含膳食纖維、蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素、菊糖、牛蒡苷、多酚等成分[9-10],具有提高機(jī)體免疫,防治糖尿病、性機(jī)能減退、便秘等功效,在治療風(fēng)濕、中風(fēng)等方面效果明顯[11-12]。牛蒡多酚是牛蒡的重要活性物質(zhì),現(xiàn)代研究顯示牛蒡多酚作為牛蒡生物保健功能物質(zhì)的地位[13]。因此開展牛蒡多酚類物質(zhì)的檢測(cè)、提取、分離純化、功能驗(yàn)證等方面的系列研究對(duì)于牛蒡產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有現(xiàn)實(shí)意義。采用響應(yīng)面法優(yōu)化牛蒡根多酚閃式提取工藝條件,并探討其體外抗氧化活性,為拓展牛蒡精深加工路徑、實(shí)現(xiàn)牛蒡功能因子產(chǎn)業(yè)化提供參考。
新鮮帶皮牛蒡干燥切片[天益食品(徐州)有限公司];苯酚(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);30%過氧化氫(H2O2,Aladdin公司);蘆丁、沒食子酸、福林酚(上海葉源生物科技有限公司);其余試劑均為分析純。
閃式提取器ZBEH-50T(河南智晶生物科技發(fā)展有限公司);L-550高速離心機(jī)(長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司);TU-1810紫外分光光度計(jì)(北京普析通用有限公司)。
1.3.1 牛蒡根預(yù)處理
使用粉碎機(jī)將牛蒡根干切片粉碎后過0.250 mm(60目)篩,牛蒡粉裝于自封袋中于干燥器中保存,備用。
1.3.2 多酚含量的測(cè)定
1.3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
準(zhǔn)確稱取0.010 0 g沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品于燒杯中,用蒸餾水溶解后轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中定容,得質(zhì)量濃度為0.10 mg/mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別量取0,0.25,0.50,0.75,1.00,1.25和1.50 mL 0.10 mg/mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液于25 mL棕色容量瓶,加入10 mL蒸餾水,再加入1 mL福林酚,搖勻后加入10 mL 7%的Na2CO3溶液,搖勻后定容至25 mL,即得質(zhì)量濃度分別為0,0.01,0.02,0.03,0.04,0.05和0.06 mg/mL的沒食子酸溶液,于常溫避光放置30 min,在波長765 nm處測(cè)定吸光度,以沒食子酸溶液濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
1.3.2.2 多酚得率的計(jì)算(式1)
式中:C為多酚提取液質(zhì)量濃度,mg/mL;N為稀釋倍數(shù);V為提取液體積,mL;M為牛蒡質(zhì)量,mg。
1.3.3 牛蒡根中多酚的提取
1.3.3.1 提取溫度對(duì)牛蒡多酚得率的影響
取適量牛蒡粉,按料液比1︰40 g/mL加入體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇,在提取電壓100 V條件下,分別在50,60,70,80和90 ℃條件下用閃式提取器提取60 s,得到的提取液在4 000 r/min條件下離心15 min,使用1.3.2小節(jié)的方法計(jì)算多酚得率。
1.3.3.2 料液比對(duì)牛蒡多酚得率的影響
取適量牛蒡粉,分別按料液比1︰10,1︰20,1︰30,1︰40和1︰50 g/mL加入體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇,在提取電壓100 V、提取溫度70 ℃條件下,用閃式提取器提取60 s,得到的提取液在4 000 r/min條件下離心15 min,使用1.3.2小節(jié)的方法計(jì)算多酚得率。
1.3.3.3 提取時(shí)間對(duì)牛蒡多酚得率的影響
取適量牛蒡粉,按料液比1︰40 g/mL加入體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇,在提取電壓100 V、提取溫度70 ℃條件下,用閃式提取器分別提取50,60,70,80和90 s,得到的提取液在4 000 r/min 條件下離心15 min,使用1.3.2小節(jié)的方法計(jì)算多酚得率。
1.3.3.4 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析
在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上,采用Box-Behnken設(shè)計(jì)方案,以提取溫度(A)、料液比(B)、提取時(shí)間(C)為考察因素,以牛蒡多酚得率為響應(yīng)值,使用Design-Expert 8.06軟件優(yōu)化多酚提取工藝參數(shù)。因素水平見表1。
表1 試驗(yàn)因素及水平
采用1.3.2.1的方法繪制多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線,如圖1所示。
圖1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線
標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=9.607 1x+0.105 4,相關(guān)系數(shù)R2=0.999,在沒食子酸質(zhì)量濃度0~0.07 mg/mL范圍內(nèi),線性關(guān)系良好。
2.2.1 提取溫度對(duì)牛蒡多酚提取的影響
在不同的提取溫度下,牛蒡多酚的得率不同??疾觳煌崛囟葘?duì)牛蒡多酚提取的影響,結(jié)果如圖2所示。
圖2 提取溫度對(duì)牛蒡多酚得率的影響
結(jié)果表明,牛蒡多酚得率隨著提取溫度的升高而提高。提取溫度80 ℃時(shí),提取率達(dá)0.72%±0.04%,提取溫度升高至90 ℃時(shí),多酚提取率為0.75%±0.05%。2種溫度條件下,多酚得率間未表現(xiàn)顯著差異,因此確定牛蒡多酚的提取溫度選擇80 ℃。
2.2.2 料液比對(duì)牛蒡多酚提取的影響
采用1.3.3.2的方法探討料液比對(duì)牛蒡多酚提取的影響。具體的結(jié)果如圖3所示。
圖3 料液比對(duì)牛蒡多酚得率的影響
結(jié)果表明,不同料液比會(huì)對(duì)多酚得率產(chǎn)生較明顯影響。料液比1︰30 g/mL時(shí),多酚得率達(dá)到0.57%,隨著料液比繼續(xù)增大,多酚得率反而驟然下降,說明料液比1︰30 g/mL可有效溶出牛蒡根中的多酚物質(zhì),因此選擇1︰30 g/mL作為牛蒡多酚提取的最優(yōu)料液比。
2.2.3 提取時(shí)間對(duì)牛蒡多酚提取的影響
提取時(shí)間對(duì)牛蒡多酚提取的影響結(jié)果如圖4所示。
圖4 提取時(shí)間對(duì)牛蒡多酚得率的影響
結(jié)果顯示,提取時(shí)間70 s內(nèi)多酚得率隨著提取時(shí)間的延長而顯著升高,提取時(shí)間70~90 s內(nèi),多酚得率趨于平緩,數(shù)值上未有顯著變化。因此確定70 s為牛蒡多酚閃式提取的最佳提取時(shí)間。
2.3.1 回歸模型的建立及顯著性檢驗(yàn)
以牛蒡多酚得率為響應(yīng)值,采用Box-Behnken設(shè)計(jì)方案優(yōu)化牛蒡根中多酚的提取工藝。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2,方差分析結(jié)果見表3。利用Design Expert 8.06軟件對(duì)表2中數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,得到響應(yīng)值對(duì)自變量的回歸方程:Y=0.75+0.082A-0.028B-0.047C+0.034AB-0.036AC+0.031BC-0.054A2-0.049B2-0.072C2。
表2 Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)及其結(jié)果
表3 方差分析表
由方差分析結(jié)果可知,該回歸模型極顯著(P<0.01),失擬項(xiàng)(P=0.152 3)不顯著,表明試驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值顯著相關(guān)(R2=0.986 3,Radj2=0.960 1),模型與試驗(yàn)擬合良好,該模型可以反映牛蒡多酚得率的預(yù)測(cè)及分析。由表3還可以發(fā)現(xiàn)自變量對(duì)響應(yīng)值即多酚得率的影響程度,其影響大小排序依次為提取溫度(A)>提取時(shí)間(C)>料液比(B),其中因素A對(duì)多酚得率影響極顯著(P<0.01),因素B、C和AC的交互作用對(duì)多酚得率的影響顯著(P<0.05)。
2.3.2 牛蒡多酚提取響應(yīng)面分析與優(yōu)化
兩兩因素間的交互作用對(duì)牛蒡多酚得率的影響如圖5所示。圖中曲面越陡,變量對(duì)多酚得率影響就會(huì)越大。影響因素提取溫度和提取時(shí)間的交互作用顯著影響牛蒡多酚得率(P<0.05),而提取溫度與料液比、提取時(shí)間與料液比間的交互作用對(duì)得率的影響不顯著(P>0.05)。使用軟件分析,牛蒡多酚的最優(yōu)提取參數(shù)為提取溫度83.70 ℃、料液比1∶30.15 g/mL、提取時(shí)間67.78 min,此條件下牛蒡多酚得率為0.777 8%。經(jīng)全面綜合考慮,修正提取參數(shù):提取溫度84 ℃、料液比1∶30 g/mL、提取時(shí)間68 min。經(jīng)驗(yàn)證,此條件下多酚得率為0.779 3%。預(yù)測(cè)值與實(shí)際值間的相對(duì)偏差為-0.001 5,說明可以使用該模型預(yù)測(cè)牛蒡多酚的提取情況。
圖5 兩兩因素交互作用對(duì)牛蒡多酚提取影響的響應(yīng)面圖
在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,以多酚得率為指標(biāo),采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化牛蒡多酚閃式提取工藝。使用該方法建立的牛蒡多酚提取得率的預(yù)測(cè)模型為Y=0.75+0.082A-0.028B-0.047C+0.034AB-0.036AC+0.031BC-0.054A2-0.049B2-0.072C2。最優(yōu)提取條件為提取溫度84 ℃、料液比1∶30 g/mL、提取時(shí)間68 min。在該條件下牛蒡多酚得率達(dá)0.779 3%。試驗(yàn)對(duì)牛蒡多酚閃式提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,獲得的預(yù)測(cè)模型可有效預(yù)測(cè)牛蒡多酚的提取情況。閃式提取工藝的使用不僅可以避免傳統(tǒng)提取方法可能帶來的有效成分被破壞的弊端,還可有效提高活性成分的提取效率、縮短提取時(shí)間、減少提取溶劑使用量等,是活性成分提取的有效方法。牛蒡多酚閃式提取工藝的優(yōu)化有助于開拓牛蒡產(chǎn)業(yè)發(fā)展路徑,挖掘牛蒡資源的開發(fā)應(yīng)用潛力,同時(shí)為天然功能因子的產(chǎn)業(yè)化提供思路與參考。