注射用紅花黃色素的質(zhì)量控制及安全性研究〔1〕

鐘 勇,劉菡菡,趙永發(fā),謝 俊

(江西嘉佑曙光骨科醫(yī)院,江西 南昌 330006)

紅花是我國一種常用的傳統(tǒng)中藥材,在多種典方及現(xiàn)代中藥處方中廣泛使用,具有活血行瘀、行氣止痛的功效[1]。中草藥紅花含有多種有效活性成分,其中紅花黃色素(SY)是紅花的主要活性成分,而SY的主要化學(xué)成分為羥基紅花黃A(HSYA)?，F(xiàn)代藥理研究表明[2-3],HSYA對擴張冠脈、保護心肌有顯著療效,是國際公認的治療心腦血管疾病的有效成分。紅花在我國多個地區(qū)均有種植,紅花注射制劑等紅花制品因中草藥原料容易獲取,成分明確,療效顯著,在臨床上應(yīng)用廣泛[4]。中藥注射劑是中藥現(xiàn)代化的重要產(chǎn)物,是我國中醫(yī)藥文化瑰寶。發(fā)展中藥注射劑,質(zhì)量控制是關(guān)鍵,中藥注射劑不良反應(yīng)發(fā)生與其質(zhì)量相關(guān),因此對SY注射劑的質(zhì)量和安全性評價是當(dāng)今的重要工作[5]。

1 儀器與試藥

e2695型Waters高效液相色譜儀(深圳市心怡創(chuàng)科技有限公司)、WondaSil C18高效液相色譜柱(北京京科瑞達科技有限公司,250 mm×4.6 mm×5 μm)、AB135-3電子天平(上海梅特勒托利多儀器有限公司)、注射用紅花黃色素[山西德元堂藥業(yè)有限公司,每瓶裝150mg(含紅花總黃酮80 mg)]、HSYA對照品、甲醇(為色譜純,美國TEDIA公司)、超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 羥基紅花黃色素A供試品溶液制備

精密量取注射用紅花黃色素1 mL,置于10 mL量瓶中,加入一定濃度甲醇溶解并稀釋至10 mL,搖勻,過濾,舍棄前10 滴初濾液,取續(xù)濾液,用0.45 μm微孔濾膜過濾。

2.2 HSYA對照品溶液制備

精密稱取HSYA對照品適量,加25%甲醇溶解并稀釋制成1.035 mg/mL HSYA對照品儲備液。

2.3 色譜條件

用WondaSil C18高效液相色譜柱(北京京科瑞達科技有限公司,250 mm×4.6 mm×5 μm),以甲醇-水-磷酸(27∶73∶0.05)為流動相,流速1.0 mL/min,檢驗波長403 nm,柱溫為室溫(20 ℃)。

2.4 精密度試驗

精密吸取同一供試品溶液,按色譜條件連續(xù)進樣6 次,記錄色譜圖,以HSYA色譜峰為參照峰,結(jié)果HSYA 6 個共有峰相對保留時間為0.08%,相對峰面積的相對標準偏差(RSD)(n=6)為0.56%,表明儀器精密度符合要求。

2.5 重復(fù)性試驗

取同一注射用紅花黃色素適量,平行制備6 份供試品溶液,進樣10 μL進行測定,結(jié)果相對保留時間為0.09%,RSD為1.2%,表明該方法重復(fù)性良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液,按色譜條件分別于0,2,4,8,12和24 h進樣10 μL進行測定,結(jié)果HSYA峰相對保留時間為0.08%,相對面積的RSD為0.97%,表明供試品溶液在常溫下24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 建立指紋圖譜

制備10 份注射用SY供試品。分別精密吸取10 μL進樣分析,采集色譜圖,將10 批供試品溶液的指紋圖譜以AIA文件格式依次導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2012版本”軟件,以S1樣品圖譜為參照圖譜,采用平均數(shù)法,經(jīng)全譜峰匹配,生成對照指紋圖譜(R)(見圖1、圖2)。由圖1可知,10 份供試品的指紋圖譜擁有較好的相似度。圖2中的6號峰為HSYA峰,HSYA峰峰形清晰明顯,與其他峰分離度高。

時間(min)

2.8 外觀和pH及不溶性微粒含量檢測

取注射用紅花黃色素4 支,均加入2.5 mL注射用水輕微振蕩2 min,靜置2 min,分別用0.9%氯化鈉注射液、5%葡萄糖注射液、10%葡萄糖注射液調(diào)配為成品輸液。分別在0,8,12,24,48 h檢查外觀、pH值、不溶性微粒及HSYA含量(見表1)。HSYA的平均含量為每瓶67.61 mg。

表1 外觀和pH及不溶性微粒含量檢測

2.9 無菌檢查和細菌內(nèi)毒素檢查

取注射用紅花黃色素4 支,均加2.5 mL注射用水輕微振蕩2 min,靜置2 min,分別用0.9%氯化

鈉注射液、5%葡萄糖注射液、10%葡萄糖注射液調(diào)配為成品輸液作為測定用液。每種測定液分別制3 份進行平行試驗。對配伍后0,24和48 h的各測定用液按方法適用性確定的方法進行無菌和細菌內(nèi)毒素檢查。無菌檢查[6]:取供試品溶液以無菌操作方法抽取內(nèi)容物過濾,再加入100 cfu試驗菌過濾,用硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基培養(yǎng)菌落。細菌內(nèi)毒素檢查[7]:取鱉試劑,開啟后每支加細菌內(nèi)毒素檢查用水0.1 mL,然后加樣測定內(nèi)毒素含量。無菌檢查結(jié)果顯示配伍0,24和48 h后各測定用液均無細菌生長。細菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果均顯示“-”,即每1 mg紅花黃色素中內(nèi)毒素<0.12 EU。

3 討 論

根據(jù)藥理學(xué)相關(guān)研究顯示,SY對心、肝、腎等重要臟器均有保護作用。此外,其功效包括但不限于改善心腦血管疾病和心律失常、調(diào)節(jié)血脂、治療癌癥和糖尿病并發(fā)癥等[8]。SY注射劑可直接輸入人體,用藥方便快捷,藥用價值較高[9]。而中藥注射劑想要得到更好的發(fā)展推廣,質(zhì)量控制是關(guān)鍵的前提工作。中藥注射液的質(zhì)量標準包括定量檢查和定性檢查。根據(jù)現(xiàn)代藥品的質(zhì)量標準,注射劑的質(zhì)量檢查主要有主藥有效成分含量檢查、性狀、pH檢查、可見異物檢查、熱原和無菌檢查[10-11]。通過分析方法考查,本實驗借鑒《中國藥典》2015版中紅花項下HSYA的含量測定方法,最終確定SY注射劑的質(zhì)量和安全性指標包括HSYA的指紋圖譜、HSYA的含量、外觀、pH值、不溶性微粒檢查以及無菌檢查和細菌內(nèi)毒素檢查[12-13]。

HSYA為SY的主要有效成分,林翠華和刁興彬[14]以及吳孟霏等[15]的實驗皆以HSYA為檢測SY的指標,本實驗以HSYA為檢測指標,提取方式參考《中國藥典》。在實驗前,經(jīng)過查閱相關(guān)文獻確定大致選定掃描波長為200～600 nm,經(jīng)HPLC色譜法進行條件摸索發(fā)現(xiàn),低波長條件下供試品中檢出的吸收峰較多,干擾多,專屬性差,波長403 nm為最佳。故本實驗以甲醇-水-磷酸(27∶73∶0.05)為流動相,柱溫為室溫(20 ℃)下設(shè)置流速1.0 mL/min,檢驗波長403 nm。結(jié)果顯示,其共有峰相對保留時間均<0.1%,相對峰面積RSD均<3%,表示該方法的精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性良好,符合相關(guān)要求。用上述方法建立的指紋圖譜各色譜峰能有效分離,將指紋圖譜的AIA數(shù)據(jù)導(dǎo)入生成對照指紋圖譜。用該方法測定注射用SY中HSYA含量,結(jié)果HSYA的平均含量(n=6)為每瓶67.61 mg,注射用SY 0,8,12,24和48 h的外觀、pH值、不溶性微粒檢查均符合要求,無菌檢查結(jié)果顯示配伍0,24和48 h后各測定用液均無細菌生長。細菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果均顯示每1 mg紅花黃色素中內(nèi)毒素<0.12 EU。

綜上所述,采用《中國藥典》2015版一部SY的相關(guān)檢測方法檢測SY注射液,建立的HPLC色譜法操作簡便、重復(fù)性好、精密度高、穩(wěn)定性佳,對質(zhì)量控制準確可靠,可用于對注射用SY的質(zhì)量控制和安全性評價方法。