苦碟子總黃酮影響心肌梗死大鼠心功能的作用機(jī)制

高麗華,孫玉艷,楊 然

1.滄州市人民醫(yī)院心血管內(nèi)科,滄州 061000;2.開灤總醫(yī)院心內(nèi)科,唐山 063000;3.開灤總醫(yī)院藥劑科,唐山 063000

心肌梗死(myocardial infarction, MI)由冠狀動(dòng)脈供血與心肌需求失衡導(dǎo)致,急性期死亡風(fēng)險(xiǎn)高,慢性期以心室重構(gòu)和心力衰竭為特征[1]。研究表明,氧化應(yīng)激是導(dǎo)致MI病理?yè)p傷的機(jī)制之一[2],磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)作為細(xì)胞內(nèi)能量傳感器蛋白激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的下游靶標(biāo),可激活抗氧化防御系統(tǒng)[3],叉頭框蛋白O1(fork head box protein O1,FOXO1)是一種重要的代謝轉(zhuǎn)錄因子,參與細(xì)胞的保護(hù),使其免受過量活性氧(reactive oxygen species, ROS)的損傷,在氧化應(yīng)激期間上調(diào)抗氧化水平[4]?？嗟涌傸S酮(total flavonoids ofSowthistleleafixerisseedling,TFS)為抱莖苦荬菜的有效成分,對(duì)心肌缺血性損傷具有抑制作用[5]。本研究擬通過構(gòu)建MI大鼠模型,并以脂溶性抗氧化劑輔酶Q10[6]作為陽性對(duì)照,探討TFS對(duì)MI大鼠心功能的保護(hù)作用及可能的機(jī)制,以期為MI的藥物治療提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

iMagic-M7型全自動(dòng)生化分析儀(深圳市美思康電子有限公司);Vevo?3100型超高分辨率小動(dòng)物超聲影像系統(tǒng)(加拿大Visual Sonics公司);Multiscan GO多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)賽默飛世爾公司);化學(xué)發(fā)光FluorChem?HD2凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Alpha公司)。

1.2 試藥

TFS(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥90%,吉林省通化華夏藥業(yè)股份有限公司);輔酶Q10膠囊(規(guī)格為10 mg,上海上藥信誼藥廠有限公司);白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6,南京建成生物科技研究所);谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)、丙二醛(malon-dialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)試劑盒均購(gòu)自南京森貝伽生物科技有限公司;兔抗AMPK、兔抗FOXO1和兔抗磷酸化FOXO1(p-FOXO1)抗體均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司;兔抗磷酸化AMPK(p-AMPK)抗體(上海碧云天生物科技有限公司)。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)6周齡雄性Wistar大鼠85只,體質(zhì)量(200±20) g,由長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供,許可證號(hào)SCXK(湘)2019-0013。

2 方法

2.1 分組及給藥

將大鼠置于恒溫(22±2) ℃、恒濕(55%±5%)條件下普通飼養(yǎng),12 h光-暗循環(huán)適應(yīng)1周后,隨機(jī)選擇15只大鼠作為假手術(shù)組,剩余70只用于構(gòu)建MI大鼠模型:腹腔注射質(zhì)量濃度為10 g·L-1的戊巴比妥鈉(30 mg·kg-1)誘導(dǎo)麻醉并機(jī)械通氣,用加熱墊維持大鼠的正常體溫,于第3、4肋骨間打開左側(cè)胸腔,在肺動(dòng)脈出口及左心房之間用6-0單尼龍線結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈,心肌組織由紅變白、脈搏減弱且心電圖ST段抬高表明冠狀動(dòng)脈閉塞[7]。假手術(shù)組穿線后不結(jié)扎,其他操作與造模步驟一致。成功造模62只大鼠,隨機(jī)剔除2只,將剩余大鼠隨機(jī)分為模型組、TFS低劑量組、TFS高劑量組和輔酶Q10組,每組15只,術(shù)后48 h后給藥。TFS低、高劑量組和輔酶Q10組[8]灌服給藥劑量分別為5、10、30 mg·kg-1·d-1,假手術(shù)組與模型組大鼠均灌服等量生理鹽水,連續(xù)給藥28 d。

2.2 大鼠心臟血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)檢測(cè)

末次給藥結(jié)束后,腹腔注射30 mg·kg-1戊巴比妥鈉麻醉,大鼠仰臥,鈍性分離頸前肌以暴露右頸動(dòng)脈,將壓力傳感器連接到BL-420F型生物功能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng),將浸有肝素的硬膜外導(dǎo)管經(jīng)動(dòng)脈壁切口插入并緩慢推向心臟,當(dāng)舒張壓突然下降到0 mmHg左右時(shí),表明導(dǎo)管進(jìn)入左心室;固定導(dǎo)管并記錄左心室收縮壓(left ventricular systolic pressure, LVSP)、左心室舒張末期壓(left ventricular end-diastolic pressure,LVEDP)、左心室壓最大增率(maximum rate of increase of left ventricular internal pressure,+dp/dtmax)和左心室壓最大減率(maximum decrease rate of left ventricular internal pressure,-dp/dtmax)[9]。

2.3 樣品采集與處理

將大鼠麻醉后稱質(zhì)量,心臟取血,以3 500 r·min-1、4 ℃離心10 min,收集血清,保存于-80 ℃用于檢測(cè)血清乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)、肌鈣蛋白T(troponin T,TnT)水平和肌酸激酶MB(creatine kinase MB,CK-MB)活性;采集血樣后,脫頸處死大鼠,取出完整心臟用于TTC染色(n=7);分離左心室(包括室間隔),稱質(zhì)量;收集大鼠左心室結(jié)扎處下方的心肌組織并用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline, PBS)洗去多余血液,分別保存于質(zhì)量濃度為40 g·L-1的多聚甲醛和-80 ℃低溫冰箱中,用于蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining, HE染色法)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbnent assay, ELISA)和免疫吸附試驗(yàn)(Western blotting)檢測(cè)。

2.4 計(jì)算LVM/BM值

以左心室質(zhì)量(left ventricular mass,LVM)/體質(zhì)量(body mass,BM)值評(píng)估心肌重塑情況。

2.5 TTC染色檢測(cè)心肌梗死面積

新鮮心臟于-20 ℃放置10 min后制備成厚4 mm的組織切片,立即全部置于用37 ℃ PBS配制的TTC染液中,溫浴15 min后取出(梗死區(qū)域?yàn)榘咨?,洗滌3次后拍照,用Image-Pro Plus 6.0軟件計(jì)算心肌梗死面積。心肌梗死面積百分比=(梗死面積/總面積)×100%。

2.6 HE染色觀察心肌組織結(jié)構(gòu)

將心肌組織置于多聚甲醛中固定過夜,常規(guī)石蠟包埋并制備成厚4 μm的組織切片,二甲苯脫蠟,梯度乙醇水化,蘇木素染核3 min,鹽酸乙醇分化10 s,氨水返藍(lán),流水沖洗后滴加伊紅染色30 s,后經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片后,置于光學(xué)顯微鏡下觀察。

2.7 ELISA檢測(cè)炎癥及氧化應(yīng)激指標(biāo)

取心肌組織100 mg置于0.5 mL生理鹽水中充分勻漿,以12 000 r·min-1離心10 min,取上清。設(shè)置對(duì)照品孔、樣本孔和空白孔,分別將樣品及對(duì)照品液加入相應(yīng)的檢測(cè)孔內(nèi),抗體包被,洗板,加入酶結(jié)合物工作液,洗板,加入顯色工作液,加入終止液終止反應(yīng),于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度(A)值,以對(duì)照品質(zhì)量濃度作為橫坐標(biāo)、對(duì)應(yīng)的A值作為縱坐標(biāo),繪制對(duì)照品線性回歸曲線,計(jì)算IL-6、TNF-α和MDA的含量及SOD和GSH-Px的活性。

2.8 檢測(cè)心肌AMPK/FOXO1軸蛋白的表達(dá)水平

取心肌組織,置于研缽內(nèi)碾碎,移至預(yù)冷裂解液中裂解,以12 000 r·min-1離心10 min,取上清。測(cè)定蛋白濃度后加熱,使蛋白變性,SDS-PAGE凝膠電泳(濃縮膠60 V,25 min;分離膠120 V,65 min),轉(zhuǎn)膜(200 mA,120 min),質(zhì)量濃度0.05 mg·mL-1脫脂牛乳封閉PVDF膜,一抗(1∶1 000)4 ℃孵育15 h;1×TBST洗膜30 min,二抗(1∶8 000)室溫孵育2 h,1×TBST洗膜30 min,ECL試劑與PVDF膜反應(yīng)2 min,曝光后用Image J軟件分析條帶的灰度值,以β-actin為內(nèi)參。目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平=目的蛋白條帶的灰度值/β-actin條帶的灰度值。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 LVM/BM值

5組大鼠LVM/BM值比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與假手術(shù)組比較,模型組的LVM/BM值升高(P<0.05);與模型組比較,3個(gè)給藥組的LVM/BM值降低(P<0.05);與TFS低劑量組比較,TFS高劑量組和輔酶Q10組的LVM/BM值降低(P<0.05),輔酶Q10組的LVM/BM值最低(P<0.05)。結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠LVM/BM值的比較

3.2 大鼠心臟血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)變化

5組大鼠LVSP、LVEDP、+dp/dtmax和-dp/dtmax比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與假手術(shù)組比較,模型組大鼠的LVSP、+dp/dtmax和-dp/dtmax均降低,LVEDP升高(P<0.05);與模型組比較,3個(gè)給藥組大鼠的LVSP、+dp/dtmax和-dp/dtmax均升高,LVEDP降低(P<0.05);與TFS低劑量組比較,其他2組大鼠的LVSP、+dp/dtmax和-dp/dtmax均升高,LVEDP降低(P<0.05),輔酶Q10組的變化更明顯(P<0.05)。結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠心臟血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)變化的比較

3.3 大鼠心肌組織梗死面積

TTC染色結(jié)果顯示,假手術(shù)組大鼠心肌組織呈均勻的玫瑰紅色,模型組大鼠的心肌可見明顯大范圍的白色梗死灶,3個(gè)給藥組心肌白色梗死區(qū)域均有縮小,4組大鼠心肌梗死面積比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較,3個(gè)給藥組大鼠心肌的梗死面積縮小(P<0.05);與TFS低劑量組比較,TFS高劑量組和輔酶Q10組大鼠心肌梗死的面積縮小(P<0.05),輔酶Q10組最小(P<0.05)。結(jié)果見圖1、表3。

圖1 各組大鼠心臟組織梗死范圍觀察

表3 各組大鼠心肌梗死情況的比較

3.4 大鼠心肌組織形態(tài)變化

HE染色結(jié)果顯示,假手術(shù)組大鼠心臟的組織結(jié)構(gòu)完整,心肌細(xì)胞排列規(guī)則、整齊;與假手術(shù)組比較,模型組大鼠的心肌細(xì)胞連接松散,排列紊亂,間質(zhì)炎性滲出明顯增多;與模型組比較,TFS低、高劑量組和輔酶Q10組大鼠心肌細(xì)胞的形態(tài)逐漸規(guī)則,結(jié)構(gòu)逐漸完整,細(xì)胞排列逐漸有層次,炎性浸潤(rùn)逐漸減輕。結(jié)果見圖2。

圖2 各組大鼠心臟組織HE染色結(jié)果 (×400)

3.5 大鼠血清心肌損傷指標(biāo)

生化分析結(jié)果顯示,5組大鼠LDH、TnT水平和CK-MB活性比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與假手術(shù)組比較,模型組大鼠LDH、TnT的水平和CK-MB的活性升高(P<0.05);與模型組比較,3個(gè)給藥組LDH、TnT的水平和CK-MB的活性降低(P<0.05);與TFS低劑量組比較,TFS高劑量組和輔酶Q10組LDH、TnT的水平和CK-MB的活性降低(P<0.05),輔酶Q10組最低(P<0.05)。結(jié)果見表4。

表4 各組大鼠血清LDH、TnT水平和CK-MB活性的比較

3.6 心肌組織炎癥及氧化應(yīng)激指標(biāo)因子水平

ELISA結(jié)果顯示,5組大鼠心肌組織IL-6、TNF-α、MDA含量及SOD和GSH-Px活性比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與假手術(shù)組比較,模型組大鼠心肌組織IL-6、TNF-α、MDA的含量增加,SOD和GSH-Px的活性降低(P<0.05);與模型組比較,3個(gè)給藥組IL-6、TNF-α、MDA的含量降低,SOD和GSH-Px的活性升高(P<0.05);與TFS低劑量組比較,TFS高劑量組和輔酶Q10組心肌組織IL-6、TNF-α、MDA的含量降低,SOD和GSH-Px的活性升高(P<0.05),且輔酶Q10組的變化最明顯(P<0.05)。結(jié)果見表5。

表5 各組大鼠心肌組織IL-6、TNF-α、MDA含量及SOD和GSH-Px活性的比較

3.7 大鼠心肌組織中AMPK、FOXO1蛋白及磷酸化蛋白的相對(duì)表達(dá)水平

Western blotting結(jié)果顯示,5組大鼠心肌組織中AMPK蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),p-AMPK、p-FOXO1和FOXO1蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與假手術(shù)組比較,模型組p-FOXO1蛋白的相對(duì)表達(dá)水平升高,p-AMPK和FOXO1蛋白的相對(duì)表達(dá)水平降低(P<0.05);與模型組比較,3個(gè)給藥組p-FOXO1蛋白的相對(duì)表達(dá)水平降低,p-AMPK和FOXO1蛋白的相對(duì)表達(dá)水平升高(P<0.05);與TFS低劑量組比較,TFS高劑量組和輔酶Q10組大鼠心肌組織中p-FOXO1蛋白的相對(duì)表達(dá)水平降低,p-AMPK和FOXO1蛋白的相對(duì)表達(dá)水平升高(P<0.05),輔酶Q10組的變化最明顯(P<0.05)。結(jié)果見表6、圖3。

表6 各組大鼠心肌組織AMPK、p-AMPK、FOXO1、p-FOXO1蛋白表達(dá)水平的比較

4 討論

本研究通過結(jié)扎大鼠心臟左冠狀動(dòng)脈降支構(gòu)建MI大鼠模型。當(dāng)大鼠出現(xiàn)脈搏減弱、心電圖ST段抬高、心肌組織有明顯大范圍梗死且組織結(jié)構(gòu)發(fā)生病理改變時(shí),表明建模成功。模型大鼠出現(xiàn)LVM/BM值顯著升高,表明心室壁增厚,提示MI大鼠可能發(fā)生了左心室重構(gòu)[10]。經(jīng)低、高劑量TFS干預(yù)后,模型大鼠心肌組織的結(jié)構(gòu)異常有所改善,心肌梗死面積顯著縮小,LVM/BM值顯著降低,表明TFS可能通過改善MI大鼠的心肌病理?yè)p傷減輕心室重構(gòu)。

心臟缺血期間增加的ROS可導(dǎo)致細(xì)胞膜破損、脂質(zhì)過氧化物產(chǎn)生及抗氧化防御系統(tǒng)破壞,當(dāng)心肌膜失去完整性時(shí),LDH和CK-MB從受損組織擴(kuò)散到血液中,為心肌組織損傷的診斷標(biāo)志物[11],TnT是心肌特有的收縮蛋白,是心肌功能障礙的重要生物標(biāo)志物,尤其是在MI中[12]。本研究結(jié)果顯示,模型組大鼠血清LDH、TnT的水平及CK-MB的活性顯著升高,表明MI大鼠心肌細(xì)胞損傷并發(fā)功能障礙。心臟血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)可以直接反映整個(gè)心動(dòng)周期左心室的壓力變化,常用于評(píng)價(jià)左心室的收縮和舒張功能[13]。LVEDP是反映左心室前負(fù)荷的指標(biāo),其與心室收縮前的回血量和心臟射血功能有關(guān)。+dp/dt受心臟后負(fù)荷和心肌收縮力的影響,是評(píng)價(jià)心肌收縮力的重要指標(biāo)。-dp/dt主要受心肌舒張前負(fù)荷的影響。當(dāng)心肌收縮和舒張功能受到抑制時(shí),±dp/dt、LVSP降低,LVEDP上升[14]。本研究結(jié)果顯示,模型組大鼠LVSP、±dp/dt顯著降低,LVEDP顯著升高,表明MI大鼠心肌收縮及舒張功能受損;而經(jīng)低、高劑量FPS治療后,模型大鼠的血清LDH、TnT水平及CK-MB活性顯著降低,LVSP、±dp/dt顯著升高,LVEDP顯著降低,表明FPS可能通過改善MI大鼠心肌組織損傷減輕心室重構(gòu)進(jìn)而促進(jìn)心肌收縮及舒張功能的恢復(fù)。

氧化應(yīng)激是MI的主要決定因素,其首先影響梗死的心肌,其次影響未梗死的心肌,研究表明,抗氧化劑治療可抑制心肌的氧化應(yīng)激,減輕心室重構(gòu)和炎癥反應(yīng),IL-6、TNF-α為促炎因子,在MI中兩者的水平均升高[15]。胞膜脂質(zhì)的氧化損傷由自由基引起,自由基可以產(chǎn)生MDA,對(duì)抗氧化損傷的防御反應(yīng)主要由抗氧化酶(如GSH-Px、SOD)介導(dǎo)[16]。本研究結(jié)果顯示,模型組大鼠心肌組織中IL-6、TNF-α及MDA的含量均升高,GSH-Px、SOD的活性降低,表明MI大鼠心肌組織病理?yè)p傷、心功能障礙及心室重構(gòu)可能與氧化應(yīng)激水平增強(qiáng)并促進(jìn)炎癥因子的表達(dá)有關(guān);經(jīng)低、高劑量的FPS治療后,可逆轉(zhuǎn)此情況,表明FPS可能通過抗氧化應(yīng)激發(fā)揮一系列心功能保護(hù)作用。

AMPK是細(xì)胞能量穩(wěn)態(tài)的主要調(diào)節(jié)劑,在營(yíng)養(yǎng)缺乏或氧化應(yīng)激等條件下被激活[17],由其介導(dǎo)的FOXO1磷酸化對(duì)于維持FOXO1的穩(wěn)定性和核定位至關(guān)重要[18]。磷酸化狀態(tài)下,FOXO1不能進(jìn)入細(xì)胞核,并以泛素依賴性方式在細(xì)胞質(zhì)中降解,去磷酸化的FOXO1定位于細(xì)胞核并顯示出轉(zhuǎn)錄活性[19],研究發(fā)現(xiàn),AMPK激活可抑制FOXO1的磷酸化,從而促進(jìn)FOXO1蛋白發(fā)生核移位,提高FOXO1蛋白的活性,進(jìn)而降低細(xì)胞氧化應(yīng)激水平[20]。本研究結(jié)果顯示,在模型組大鼠的心肌組織中p-FOXO1蛋白的相對(duì)表達(dá)水平顯著升高,p-AMPK和FOXO1蛋白的相對(duì)表達(dá)水平顯著降低,表明MI大鼠的AMPK/FOXO1軸被抑制;而在FPS低、高劑量組大鼠的心肌組織中p-FOXO1蛋白的相對(duì)表達(dá)水平顯著降低,p-AMPK和FOXO1蛋白的相對(duì)表達(dá)水平顯著升高,表明FPS可能通過激活A(yù)MPK促進(jìn)細(xì)胞質(zhì)中p-FOXO1的去磷酸化并發(fā)生核移位,進(jìn)而激活FOXO1蛋白的轉(zhuǎn)錄活性,從而發(fā)揮抗氧化損傷的作用。

綜上所述,FPS可改善MI大鼠心肌組織的病理?yè)p傷,降低炎癥因子的水平,減輕心室重構(gòu),改善心肌收縮及舒張功能障礙,其作用機(jī)制可能與激活A(yù)MPK/FOXO1軸、提高M(jìn)I大鼠抗氧化應(yīng)激水平有關(guān)。