更年靈膠囊4種成分的含量測(cè)定及HPLC指紋圖譜的建立

陸 游,吳桂凡*,李 立,羅 軼,馬雙成

1.廣西壯族自治區(qū)食品藥品檢驗(yàn)所 國家藥品監(jiān)督管理局中藥材質(zhì)量監(jiān)測(cè)與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南寧 530021; 2.中國食品藥品檢定研究院,北京 100050

更年靈膠囊是臨床治療婦女更年期綜合征(menopausal syndrome,MPS)的常用藥,具有較好的治療效果,其為中西復(fù)方制劑,主要由2味中藥女貞子、淫羊藿加水煎煮,加入維生素B1、維生素B6、谷維素及輔料制成。該藥具有溫腎益陰、調(diào)補(bǔ)陰陽之功效,主要用于婦女MPS屬陰陽兩虛者的治療。

MPS是指婦女絕經(jīng)前后因機(jī)體的雌激素水平變化所致的一系列以自主神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂為主、伴有神經(jīng)心理癥狀的一組癥候群[1]。近年來研究發(fā)現(xiàn),補(bǔ)腎中藥可提高下丘腦-垂體-靶腺軸的功能,調(diào)節(jié)性激素水平,故以補(bǔ)腎調(diào)沖法作為治療MPS的基本法則[2-3]。更年靈膠囊中的女貞子、淫羊藿均屬于補(bǔ)腎中藥,不僅能調(diào)理腎功能,還能補(bǔ)腎陰、消除虛弱,在婦女MPS的治療中發(fā)揮著重要的作用,故女貞子和淫羊藿的質(zhì)量對(duì)更年靈膠囊的質(zhì)量控制起著決定性的作用,本品現(xiàn)執(zhí)行的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《中國人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑第十四冊(cè)[4],僅收載了性狀、理化鑒別,淫羊藿的薄層鑒別,淫羊藿苷、維生素B1、維生素B6的高效液相色譜法及谷維素的紫外-可見分光光度法,未對(duì)女貞子及淫羊藿中具有重要生物活性的朝藿定B、朝藿定C進(jìn)行含量控制。為更好地控制更年靈膠囊的質(zhì)量,參考2020年版《中華人民共和國藥典》(以下簡(jiǎn)稱《中國藥典》)及其他文獻(xiàn)[5-8],擬對(duì)現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行補(bǔ)充、修訂,探索含量測(cè)定項(xiàng)目的指標(biāo)性成分,研究建立更年靈膠囊指紋圖譜,并用ChemPattern化學(xué)計(jì)量學(xué)軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行聚類分析和主成分分析,以考察更年靈膠囊的整體質(zhì)量,為標(biāo)準(zhǔn)的制定提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀(配置安捷倫液相色譜系統(tǒng)化學(xué)工作站、DAD檢測(cè)器)購自美國安捷倫公司;ML204型電子分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司);KQ-800DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);ChemPattern化學(xué)計(jì)量學(xué)軟件[科邁恩(北京)科技有限公司]。

1.2 試藥

對(duì)照品:特女貞苷(批號(hào)11926-2014605,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為93.3%)、朝藿定C(批號(hào)111780-201503,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95.5%)、淫羊藿苷(批號(hào)110737-201516,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為94.2%)均購自中國食品藥品檢定研究院;朝藿定B(批號(hào)110623-73-9,Stanford Analytical Chemicals Inc.);乙腈為色譜純;水為高純水;其他試劑均為分析純。

20批更年靈膠囊均為國家評(píng)價(jià)性抽驗(yàn)的樣品,用編號(hào)S1～S20表示。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Capcellpak MGII-C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)。流動(dòng)相為乙腈(A)-水(B),梯度洗脫(0～10 min,5%A;10～60 min,5%～32%A;60～80 min,32%～40%A;80～90 min,40%～70%A;90～91 min,70%～5%A;91～100 min,5%A)。流速為1.0 mL·min-1;柱溫為30 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng)為224 nm;進(jìn)樣量為10 μL。理論板數(shù)以特女貞苷峰計(jì)算不得低于10 000。

2.2 溶液的制備

2.2.1混合對(duì)照品溶液 取對(duì)照品特女貞苷、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷適量,精密稱定,加甲醇制成每1 mL含特女貞苷80 μg、朝藿定B 40 μg、朝藿定C 80 μg、淫羊藿苷80 μg的混合溶液,即得。

2.2.2供試品溶液 取樣品(編號(hào)S1)0.5 g,精密稱定,置于具塞錐形瓶中,精密加入甲醇25 mL,稱定質(zhì)量,超聲處理(功率為320 W,頻率為40 kHz)30 min,放冷,再稱定質(zhì)量,用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,用微孔濾膜(0.45 μm)濾過,即得。

2.2.3陰性樣品溶液 按照2020年版《中國藥典》一部中更年靈膠囊的處方工藝,分別制備缺女貞子和淫羊藿的陰性樣品,按照2.2.2項(xiàng)下方法制備,即得。

2.3 含量測(cè)定

2.3.1專屬性考察 精密吸取混合對(duì)照品、供試品、陰性樣品溶液適量,按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,結(jié)果顯示,在陰性對(duì)照色譜中,與特女貞苷、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷對(duì)照品色譜峰對(duì)應(yīng)的位置上未檢出色譜峰,見圖1。表明陰性對(duì)照無干擾。

注:1.特女貞苷;2.朝藿定B;3.朝藿定C;4.淫羊藿苷;A.混合對(duì)照品溶液;B.供試品溶液;C.缺女貞子和淫羊藿的陰性對(duì)照溶液。

2.3.2線性關(guān)系考察 精密稱取特女貞苷對(duì)照品10.31 mg、朝藿定C對(duì)照品10.41 mg和淫羊藿苷對(duì)照品10.31 mg,置于25 mL量瓶中,另精密稱取朝藿定B對(duì)照品9.16 mg,置于10 mL量瓶中,用甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,精密吸取5.00 mL加入上述25 mL量瓶中,再用甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取該儲(chǔ)備液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL,分別置于10 mL量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,搖勻,即得系列質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液。分別精密吸取不同質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液各10 μL,注入液相色譜儀,記錄色譜圖及峰面積。以對(duì)照品質(zhì)量濃度(μg·mL-1)為橫坐標(biāo)(x)、峰面積(y)為縱坐標(biāo),進(jìn)行線性回歸,結(jié)果見表1。由表1可知,各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系

2.3.3精密度實(shí)驗(yàn) 取樣品(編號(hào)S1),按照2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液,在2.1項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄其色譜圖及峰面積。測(cè)得特女貞苷、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷峰面積的RSD值分別為0.74%、1.34%、1.74%、1.96%,結(jié)果表明,該方法的精密度良好。

2.3.4穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取樣品(編號(hào)S1),按照2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液,于0、7、13、24、48 h 在2.1項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,測(cè)得特女貞苷、淫羊藿苷、朝藿定B、朝藿定C峰面積的RSD值分別為1.68%、1.15%、2.47%、1.37%。結(jié)果表明,供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取樣品(編號(hào)S1)6份,每份約0.5 g,按照2.2.2項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液,在2.1項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,記錄色譜圖。測(cè)得每粒膠囊特女貞苷、淫羊藿苷、朝藿定B、朝藿定C含量的RSD值分別為1.91%、2.06%、1.63%、2.42%,結(jié)果表明,該方法的重復(fù)性良好。

2.3.6加樣回收實(shí)驗(yàn) 取已知含量的樣品(編號(hào)S1),精密稱取約0.25 g,置于具塞錐形瓶中,精密加入對(duì)照品儲(chǔ)備液25 mL(精密稱取特女貞苷對(duì)照品10.46 mg、朝藿定C對(duì)照品10.52 mg,置于200 mL量瓶中,另精密稱定淫羊藿苷對(duì)照品11.36 mg,置于10 mL量瓶中,用甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,精密吸取5.00 mL,加入上述200 mL量瓶中,再精密吸取2.3.2項(xiàng)下的朝藿定B對(duì)照品溶液2.00 mL,加入上述200 mL量瓶中,用甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,作為對(duì)照品儲(chǔ)備液),按照2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液。在2.1項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,計(jì)算回收率。計(jì)算得特女貞苷、淫羊藿苷、朝藿定B、朝藿定C的平均加樣回收率分別為102.77%、98.88%、98.14%、97.10%,RSD值分別為1.24%、1.53%、1.72%、1.86%,見表2。

表2 4種成分的回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (n=6)

2.3.7樣品含量測(cè)定 按照2.2.2項(xiàng)下方法制備20批供試品溶液,在2.1項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定,結(jié)果見表3。

表3 各成分含量測(cè)定結(jié)果 (n=20)

2.4 指紋圖譜建立

2.4.1圖譜生成 取20批更年靈膠囊樣品,分別按照2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液,精密吸取10 μL,按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,記錄色譜圖,將各樣品的色譜圖導(dǎo)入國家藥典委員會(huì)“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012A版)”中,設(shè)定11個(gè)響應(yīng)較高的色譜峰,選擇MARK峰匹配方式,生成更年靈膠囊的對(duì)照指紋圖譜,見圖4。根據(jù)20批更年靈膠囊的指紋圖譜檢測(cè)結(jié)果,共標(biāo)定11個(gè)特征峰。經(jīng)與對(duì)照品比對(duì),可知4號(hào)峰為特女貞苷、7號(hào)峰為朝藿定B、8號(hào)峰為朝藿定C、9號(hào)峰為淫羊藿苷。見圖2。

注:4.特女貞苷;7.朝藿定B;8.朝藿定C;9.淫羊藿苷;其他數(shù)字為未指認(rèn)成分峰。

2.4.2主成分分析 用ChemPattern 軟件將樣品測(cè)定數(shù)據(jù)自動(dòng)標(biāo)度化后(針對(duì)觀測(cè))進(jìn)行主成分分析,見圖3。第1主成分(PC1)的貢獻(xiàn)率為70.73%,第2主成分(PC2)的貢獻(xiàn)率為19.22%,第3主成分(PC3)的貢獻(xiàn)率為5.59%,累積達(dá)到95.54%,表明其能較全面地反映樣品間的差異。企業(yè)Q1的樣品基本能聚為一類;可能由于特女貞苷、朝藿定B、朝藿定C及淫羊藿苷的含量差異,企業(yè)Q2的S8、S10、S13、S154批樣品不能聚為一類,企業(yè)Q3的S17、S19批樣品不能聚為一類。

圖3 20批樣品的主成分分析

2.4.3聚類分析 用ChemPattern 軟件將樣品測(cè)定數(shù)據(jù)自動(dòng)標(biāo)度化后(針對(duì)觀測(cè))進(jìn)行聚類分析,見圖4。由圖4可見,企業(yè)Q1的樣品能聚為一類,而其他樣品批間差異較大,不能聚為一類。

圖4 20批樣品的聚類分析

3 討論

本研究用DAD檢測(cè)器檢測(cè),提取各波長(zhǎng)下的色譜圖,在224 nm波長(zhǎng)處所得色譜峰的信息量最多,各色譜峰的面積、高度適中,分離度好,所以確定檢測(cè)波長(zhǎng)為224 nm;參照《中國藥典》中女貞子和淫羊藿項(xiàng)下的方法,分別用甲醇-水和乙腈-水系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫,經(jīng)研究,確定流動(dòng)相梯度為2.1項(xiàng)色譜條件下的梯度,在此梯度下,得到的色譜峰數(shù)量多、分離效果好、峰形對(duì)稱;考察了甲醇-水、甲醇-4 mL·L-1磷酸溶液、乙腈-水、乙腈-4 mL·L-1磷酸溶液等由不同系統(tǒng)組成的流動(dòng)相,結(jié)果顯示,乙腈-水系統(tǒng)梯度洗脫程序能將各成分有效分離。在色譜柱的選擇上,考察了Waters XBridge C18、Kromasil C18、Thermo C18、 Hubble C18、Capcellpak MGII-C18,結(jié)果顯示,使用5種色譜柱均能獲得很好的分離效果,各峰之間的分離度良好。5種不同品牌色譜柱特女貞苷的理論板數(shù)均超過30 000,故確定特女貞苷峰的理論板數(shù)不得低于10 000。

4 小結(jié)

中藥化學(xué)成分復(fù)雜,并具有多靶點(diǎn)的特點(diǎn),因此對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量控制不能僅基于單一的指標(biāo),尤其對(duì)于中藥復(fù)方制劑更是如此。在辨證審因決定治法后,遵循君臣佐使和七情配伍等原則,針對(duì)病情設(shè)定的由2味或2味以上藥味組成的方劑,因所含化學(xué)成分復(fù)雜、各種藥物化學(xué)成分相互作用,對(duì)于其質(zhì)量評(píng)價(jià)需要提出更深層次的要求[9-10]。更年靈膠囊的現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅收載了性狀、理化鑒別和淫羊藿的薄層鑒別,女貞子、淫羊藿為處方中的主要藥材,標(biāo)準(zhǔn)中并未對(duì)其進(jìn)行含量控制。檢驗(yàn)項(xiàng)目的缺失,導(dǎo)致有的生產(chǎn)企業(yè)可能偷工減料導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量狀況較差,無法保證藥品的療效。2020年版《中國藥典》中用特女貞苷、淫羊藿苷分別作為女貞子、淫羊藿質(zhì)量定量評(píng)價(jià)的指標(biāo)[11],淫羊藿中的朝藿定B、朝藿定C都具有重要的生物活性,且藥理活性顯著[12-14],目前研究發(fā)現(xiàn),朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷是淫羊藿的標(biāo)志性化合物[15],因此,本研究經(jīng)綜合考察,建立同時(shí)測(cè)定女貞子中特女貞苷和淫羊藿中淫羊藿苷、朝藿定B、朝藿定C含量的方法,以客觀地反映女貞子和淫羊藿的質(zhì)量情況。近年來,指紋圖譜結(jié)合模式識(shí)別方法已廣泛應(yīng)用于中藥材的質(zhì)量控制、來源分析及差異標(biāo)志物篩選等,能有效彌補(bǔ)現(xiàn)有質(zhì)量控制方法的不足[16-20]。本研究建立的更年靈膠囊HPLC指紋圖譜分析方法精密度高、專屬性強(qiáng)、穩(wěn)定性和分離度好。通過比較,確定了11個(gè)共有峰,指認(rèn)了4個(gè)峰。結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法進(jìn)行聚類分析、主成分分析,由分析結(jié)果可知,3家企業(yè)中有1家企業(yè)不同批次樣品的相似度接近,表明該企業(yè)的原料和生產(chǎn)工藝相對(duì)穩(wěn)定;不同企業(yè)間的產(chǎn)品質(zhì)量存在差異,另2家企業(yè)樣品間的主要成分含量也存在差異。

因此,為了對(duì)更年靈膠囊質(zhì)量進(jìn)行整體、綜合性地控制,全面控制樣品的均一性和有效性,建議增加特女貞苷、淫羊藿苷、朝藿定B和朝藿定C 4種成分的含量測(cè)定及指紋圖譜檢查,以更科學(xué)、系統(tǒng)地控制更年靈膠囊的質(zhì)量。