海帶配子體低溫冷凍保存研究

錢瑞，陳書秀，羅世菊，武瑞娜，王利芹，賽珊

（山東東方海洋科技股份有限公司，國家海藻與海參工程技術(shù)研究中心，山東省海藻與海參技術(shù)創(chuàng)新中心，山東省海藻遺傳育種與栽培技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 煙臺 264003）

大型海藻種質(zhì)保存技術(shù)，按照保存溫度可以分2 大類：傳統(tǒng)的低溫弱光保存（一般為8～12 ℃）和以低溫（4 ℃）、冷凍（-40 ℃）、低溫真空冷凍干燥和超低溫（-196 ℃）為主的冷凍保存[1]。關(guān)于海帶種質(zhì)保存方式，0～10 ℃低溫弱光液體保存配子體，是公認(rèn)的長期保存海帶種質(zhì)的最佳方式，目前我國的海帶種質(zhì)絕大多數(shù)是以這種方式保存。但該保存方式存在明顯的不足，如保存期間，需定期更換培養(yǎng)液，工作量大、操作頻繁，增加了種質(zhì)污染及混雜的概率，同時限制了保存的規(guī)模和效率，保種過程中易出現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)異常、單性生殖等現(xiàn)象[2-3]。-196 ℃液氮冷凍保存，可使配子體的代謝完全停止，實(shí)現(xiàn)配子體的永久保存，但液氮冷凍保存3 種常用方法（程序降溫法、逐級冷凍法、包埋脫水法）均存在很大局限性，其中程序降溫法對儀器設(shè)備要求高，包埋脫水法對脫水速率等操作要求極高，且3 種方法均需在液氮中進(jìn)行，保存次數(shù)及保存量大受限制，后續(xù)保存成本極高[4-8]。

普通低溫冷凍保存，相對于超低溫冷凍保存更方便可行。羅世菊等[9]發(fā)明了一種海帶配子體低溫冷凍保存方法，將海帶配子體加入預(yù)冷的10%DMSO 保護(hù)液（0 ℃）中，直接放入-80 ℃低溫冰箱冷凍，可保存5～10 年。文獻(xiàn)[1]研究發(fā)現(xiàn)，-40 ℃低溫，即可抑制生物細(xì)胞的生化活動，排除遺傳性狀的變異，可用于多數(shù)海藻種質(zhì)保存?，F(xiàn)采用不同的溫度（-80 ℃、-40 ℃、-20 ℃），對不同品種的海帶配子體細(xì)胞段或細(xì)胞簇進(jìn)行低溫冷凍保存，比較不同溫度對海帶配子體生長發(fā)育的影響，以期為海帶低溫冷凍保存提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計

設(shè)置3 個不同的溫度組A（-80 ℃）、B（-40 ℃）、C（-20 ℃）和1 個對照組D（未凍存配子體細(xì)胞），對不同品種的海帶配子體細(xì)胞段或細(xì)胞簇進(jìn)行低溫冷凍保存，15 d 后取出，進(jìn)行復(fù)蘇培養(yǎng)和發(fā)育培養(yǎng)，統(tǒng)計配子體細(xì)胞存活率及發(fā)育率。

1.2 材料

采用實(shí)驗(yàn)室低溫弱光保存的雌雄配子體單克隆系，品種為901、東方6 號、東方7 號。保存條件為：溫度10 ℃，光強(qiáng)10 μmol/m2·s，光時24 h/d。用于低溫冷凍的配子體細(xì)胞為僅含2～5 個細(xì)胞的片段或多細(xì)胞簇。

1.2.1 僅含2～5 個細(xì)胞片段的獲取方法

選取色素正常、狀態(tài)良好、無污染的配子體材料，玻片壓磨后，經(jīng)孔徑為0.048 mm 篩絹過濾，獲得配子體細(xì)胞懸濁液，其中大多數(shù)為含有2～5 個細(xì)胞的小型片段。將一定量的懸濁液平鋪于培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿提前放置一定大小的玻片，玻片的大小以凍存管口徑為標(biāo)準(zhǔn)確定。培養(yǎng)皿放置在10 ℃、10 μmol/m2·s 條件下恢復(fù)培養(yǎng)1 周后，附著于小玻片上的細(xì)胞段，用于低溫冷凍。

1.2.2 多細(xì)胞簇的獲取方法

選取低溫弱光條件下保存的呈簇狀的配子體克隆團(tuán)，稱取鮮質(zhì)量0.010 g，放入凍存管直接凍存。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 冷凍保護(hù)液配制

采用煮沸冷卻的海水為基礎(chǔ)液，配制10%體積濃度的二甲基亞砜冷凍保護(hù)液，置于0～4 ℃冰箱存放，備用。

1.3.2 凍存方法

所有凍存管分別加入1 mL 冷凍保護(hù)液并編號，放入-20 ℃冰柜預(yù)凍24 h。后取出，再分別加入1.3.1 中的10%DMSO 保護(hù)液0.8 mL。用鑷子夾取1.2.1 和1.2.2 中獲得的不同細(xì)胞狀態(tài)的配子體材料，分別放入不同編號的凍存管中，擰緊蓋子。所有凍存管放入0～4 ℃低溫冷藏箱平衡30 min。平衡結(jié)束，將處理好的配子體材料分別放入-80，-40，-20 ℃低溫凍存。

1.3.3 解凍和保護(hù)劑的去除

將凍存15 d 的凍存管放入40 ℃的恒溫水浴鍋中，迅速震蕩直至最后一個冰晶消失，用鑷子將附有配子體細(xì)胞段的小玻片或多細(xì)胞簇取出，分別放入培養(yǎng)皿或錐形瓶中，加預(yù)冷低溫培養(yǎng)液，多次換水沖洗，去除冷凍保護(hù)劑。

1.3.4 存活率的測定

將經(jīng)過冷凍保護(hù)處理解凍后的配子體細(xì)胞，接種于新鮮培養(yǎng)基中，附有細(xì)胞段的玻片接種于培養(yǎng)皿中，細(xì)胞簇接種于100 mL 錐形瓶中。均放置在10 ℃、光強(qiáng)10 μmol/m·2s、光時24 h/d 條件下培養(yǎng)。

細(xì)胞段存活率的計算：冷凍保存之前每個玻片隨機(jī)觀察10 個100×視野，統(tǒng)計每個視野中的總細(xì)胞段數(shù)，求平均值作為凍存總細(xì)胞段數(shù)。解凍復(fù)蘇后，每周鏡檢觀察配子體生長狀態(tài)，第30 天，每個玻片上隨機(jī)觀察10 個100×視野，統(tǒng)計每個視野中的存活細(xì)胞段數(shù)，求平均值，即每個試驗(yàn)條件共測量30 個數(shù)據(jù)（n=30）。計算公式如下：

細(xì)胞段存活率（%）=存活細(xì)胞段數(shù)/凍存總細(xì)胞段數(shù)×100%。

細(xì)胞簇存活率的計算：解凍復(fù)蘇后7 d，每個錐形瓶中的配子體細(xì)胞簇，用移液槍吸取微量的海帶配子體于載玻片上，用牙簽將絲狀體盡量分開，在載玻片上滴1～2 滴海水，用鑷子蓋上蓋玻片后，用吸水紙吸干周圍多余的水分，即制作好配子體樣本。將樣本在顯微鏡下觀察，并用數(shù)碼相機(jī)記錄配子體的生長狀態(tài)。采用Image J 進(jìn)行數(shù)據(jù)測量，測量每個視野（100×）中細(xì)胞總面積與存活細(xì)胞總面積，每個配子體樣品測量10 個數(shù)據(jù)，即每個試驗(yàn)條件共測量30 個數(shù)據(jù)（n=30）。存活率計算公式：

細(xì)胞簇成活率（%）=存活細(xì)胞面積/細(xì)胞總面積×100%。

1.3.5 凍存的海帶配子體發(fā)育試驗(yàn)

將凍存復(fù)蘇后培養(yǎng)6 個月的同品種雌、雄配子體，分別磨碎后經(jīng)孔徑為0.048 mm 篩絹過濾，形成一定濃度的細(xì)胞懸濁液，相同密度的雌雄配子體按照體積比2∶1 混合均勻。取適量的雌雄混合懸濁液平鋪于培養(yǎng)皿中，放置在光照強(qiáng)度20 μmol/m2·s 、光周期10L∶14D、溫度10 ℃條件下培養(yǎng)。每3～4 d更換1 次培養(yǎng)液并鏡檢，觀察其生長發(fā)育情況，試驗(yàn)周期30 d。

配子體發(fā)育率的計算：每個培養(yǎng)皿隨機(jī)觀察10 個100×視野，分別統(tǒng)計卵囊形成、排卵、幼孢子體和總細(xì)胞數(shù)，按卵囊形成數(shù)、排卵數(shù)和孢子體數(shù)之和占總細(xì)胞數(shù)的百分比計算發(fā)育率。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用SPSS19.0 軟件對存活率及發(fā)育率進(jìn)行單因子方差分析、多重比較，P＜0.05，表示差異顯著。用Excel 轉(zhuǎn)件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同凍存溫度對海帶配子體細(xì)胞段存活率及細(xì)胞恢復(fù)生長的影響

不同凍存溫度、品種、性別對海帶配子體細(xì)胞段存活率的影響結(jié)果方差分析見表1。由表1 可見，不同凍存溫度、海帶品種及雌雄差異對海帶配子體細(xì)胞段存活率有顯著的影響（P＜0.05），但其中兩者或3 者的交互作用對海帶配子體細(xì)胞段存活率無顯著影響（P＞0.05）。

表1 不同凍存溫度、品種、性別對海帶配子體細(xì)胞段存活率的影響結(jié)果方差分析

不同凍存溫度、品種和雌雄差異對配子體細(xì)胞段存活率的影響見圖1（a）（b）。由圖1 可見，3 個品種的海帶雌配子體細(xì)胞段經(jīng)3 種低溫凍存后的存活率無顯著差異，存活率均低于10%。901 海帶雄配子體細(xì)胞段在-80 ℃、-40 ℃凍存后的存活率（24.73%、17.87%）顯著高于東方6 號和東方7 號雄配子體細(xì)胞段的存活率。3 個海帶品種雌雄配子體細(xì)胞段在經(jīng)-20℃凍存后的存活率（0.03%～2.60%），均低于A 組和B 組（1.30%～24.73%），但其中僅901不同溫度凍存組間細(xì)胞段的存活率差異顯著，東6和東7 海帶不同溫度凍存組間細(xì)胞段存活率差異不顯著。經(jīng)相同低溫冷凍的3 個海帶品種雄配子體細(xì)胞段存活率（0.33%～24.73%）均高于雌配子體（0.03%～6.77%）。

圖1 不同凍存溫度、品種和雌雄差異對配子體細(xì)胞段存活率的影響

對冷凍復(fù)蘇培養(yǎng)后的存活細(xì)胞段鏡檢發(fā)現(xiàn)，復(fù)蘇初期配子體細(xì)胞段會出現(xiàn)大量死亡，經(jīng)30 d 培養(yǎng)后，存活細(xì)胞段顏色加深，開始出現(xiàn)分支，培養(yǎng)75 d后，每個存活細(xì)胞段均長成了具有大量分支的細(xì)胞簇狀體，且經(jīng)不同冷凍處理的海帶配子體生長狀態(tài)無顯著差異。見圖2（a）（b）（c）。

圖2 不同溫度凍存的901♂配子體細(xì)胞段

2.2 不同凍存溫度對海帶配子體細(xì)胞簇存活率及細(xì)胞恢復(fù)生長的影響

不同凍存溫度、品種、性別對海帶配子體細(xì)胞簇存活率的影響結(jié)果方差分析見表2。由表2 可見，不同凍存溫度及雌雄差異對海帶配子體細(xì)胞段存活率有顯著的影響（P＜0.05），但品種、兩者或三者的交互作用對海帶配子體細(xì)胞段存活率無顯著影響（P＞0.05）。

表2 不同凍存溫度、品種、性別對海帶配子體細(xì)胞簇存活率的影響結(jié)果方差分析

不同凍存溫度對3 個品種的海帶雌雄配子體細(xì)胞簇存活率的影響見圖3（a）（b），由圖3 可見，3 個品種的海帶雌雄配子體細(xì)胞簇經(jīng)-20 ℃凍存后的存活率（0.44%～1.37%）顯著低于A 組和B 組的存活率（32.00%～43.38%）。經(jīng)相同低溫凍存的雌雄配子體存活率相比較，雄配子體細(xì)胞簇存活率高于雌配子體，但差異不顯著（P＞0.05）。

圖3 不同凍存溫度、品種和雌雄差異對配子體細(xì)胞簇存活率的影響

對冷凍復(fù)蘇培養(yǎng)后的存活細(xì)胞簇鏡檢觀察發(fā)現(xiàn)，復(fù)蘇初期配子體細(xì)胞簇會出現(xiàn)部分死亡，經(jīng)7 d培養(yǎng)后，細(xì)胞簇的部分絲狀體分支舒展，細(xì)胞顏色明顯加深，細(xì)胞內(nèi)色素分布均勻，見圖4（a）（b）（c）。經(jīng)過90 d 的培養(yǎng)和觀察，確定處于該狀態(tài)的細(xì)胞即可判定為存活細(xì)胞，且經(jīng)不同低溫冷凍后存活的海帶配子體細(xì)胞簇的總細(xì)胞量差異顯著，但存活細(xì)胞的生長狀態(tài)無顯著差異，見圖4（d）（e）（f）。

圖4 不同溫度凍存的901♀配子體細(xì)胞簇復(fù)蘇培養(yǎng)后的細(xì)胞狀態(tài)

2.3 不同凍存溫度對海帶配子體細(xì)胞發(fā)育能力的影響

從2.1 和2.2 分析結(jié)果可以看出，-20 ℃低溫冷凍保存的海帶配子體復(fù)蘇后的成活率極低，因此本試驗(yàn)選用-80 ℃和-40 ℃低溫冷凍保存的材料進(jìn)行發(fā)育試驗(yàn)。經(jīng)不同溫度冷凍后的配子體均可正常發(fā)育，且各組間的發(fā)育率無顯著差異（P＞0.05）。在發(fā)育過程中，隨著發(fā)育時間增加，各組間的發(fā)育率顯著增加，發(fā)育進(jìn)程及最終發(fā)育率無顯著差異。第28 天的發(fā)育率均在70%左右，小苗率占40%～50%。與未經(jīng)冷凍保存配子體相比較，其發(fā)育進(jìn)程和發(fā)育率均無顯著差異，見表3。

表3 不同凍存溫度對海帶配子體發(fā)育的影響 %

3 討論

許多大型海藻如紅藻中的紫菜屬、江籬屬，褐藻中的海帶屬、馬尾屬、裙帶菜屬等，不僅是工業(yè)原料和食品，同時也是海洋生態(tài)環(huán)境修護(hù)的工具藻種，具有重要的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)價值。因此需要重視海藻資源的保護(hù)，其中一項(xiàng)有效的措施就是海藻種質(zhì)保存，這些種質(zhì)不僅可以為科學(xué)研究提供材料，也是退化海藻場修復(fù)和養(yǎng)殖業(yè)持續(xù)健康發(fā)展的基石[10]。根據(jù)海藻種質(zhì)的生理狀態(tài)，可將種質(zhì)保存方法分為培養(yǎng)保存和低溫保存2 類。

培養(yǎng)保存的原理是種質(zhì)在特定條件下會不斷地營養(yǎng)生長而不發(fā)育，達(dá)到長期保存的目的，如果要使用，不需要復(fù)雜的復(fù)活過程[11]。培養(yǎng)保存方式主要包括低溫弱光和固定化。方宗熙[12]最早發(fā)明了利用低溫弱光保存海帶和裙帶菜無性繁殖系的方法，該方法保存的配子體大部分具有正常的活力，恢復(fù)正常溫度光照后，可正常發(fā)育產(chǎn)生孢子體。王歡等[13]將條斑紫菜（P. yezoensis）絲狀體包埋后置于4 ℃暗光下保存，其成活率可達(dá)71%，且能保持正常生長能力。鄒定輝等[14]研究發(fā)現(xiàn)，羊棲菜處于干出狀態(tài)（避免失水）的生殖托，在5 ℃可保存30 d，其細(xì)胞相對活力及配子體釋放能力較好。王志勇等[15]研究表明，壇紫菜葉狀體細(xì)胞，可以在半固態(tài)至固態(tài)瓊脂培養(yǎng)基上良好地存活、分裂和再生。陳昌生等[16]發(fā)現(xiàn)壇紫菜在10 ℃固體平板上可長期保存。本實(shí)驗(yàn)室于20 世紀(jì)70 年代建立了海帶配子體的采集和培養(yǎng)技術(shù)[17-20]，隨之建立了以低溫弱光液體保存[21-25]為主的海帶種質(zhì)庫，海帶種質(zhì)庫建立之初保存的種質(zhì)材料，最長時間可達(dá)20 年之久，每年均選擇部分配子體進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)和育苗，生長速率及發(fā)育能力與新采集的種質(zhì)間無顯著差異。為了克服低溫弱光液體保存方法所存在的工作量大等缺陷，2005 年山東東方海洋科技股份有限公司和煙臺大學(xué)合作開發(fā)了海帶配子體固相保存技術(shù)[26]，并經(jīng)后期多次優(yōu)化，建立了一種種質(zhì)無菌采集與固相培養(yǎng)相結(jié)合的保存方法[27]，此方法從源頭就抑制細(xì)菌污染，簡化了常規(guī)固相保存前期的無菌處理流程，保存過程中使克隆進(jìn)入休眠狀態(tài)，延長保存時間。

低溫保存，即冷藏和超低溫，在此溫度下，種質(zhì)基本停止了新陳代謝活動，在重新培養(yǎng)時，需要進(jìn)行復(fù)雜的復(fù)活過程。陳昌生等[16]使用膠囊化法，在-20 ℃低溫保存壇紫菜的絲狀體，其成活率＞80%。郭金耀等[28]用包埋法使條斑紫菜脫水后，-20 ℃保存的種質(zhì)成活率可達(dá)70%。陳素文等[29]將海蘿（G.furcata）風(fēng)干至其鮮質(zhì)量的1/4，于-80 ℃保存，其孢子附著率達(dá)70%。羅世菊等[9]將海帶配子體加入預(yù)冷的10% DMSO 保護(hù)液（0 ℃）中，直接放入-80 ℃低溫冰箱冷凍保存，雌配子體存活率＞50%左右，雄配子體存活率＞60%左右，可保存5～10 年。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，將配子體細(xì)胞簇加入至預(yù)冷后的10% DMSO（0 ℃）中，直接放于-80 ℃或-40 ℃冷凍保存，經(jīng)復(fù)蘇培養(yǎng)后測得的配子體成活率達(dá)40%左右，而經(jīng)同樣方法冷凍保存后的細(xì)胞段存活率僅在10%左右，因此處于細(xì)胞簇狀態(tài)的配子體細(xì)胞更適合用于-80 ℃或-40 ℃冷凍保存。若將經(jīng)冷凍保護(hù)液處理過的種質(zhì)材料，于-20 ℃冷凍保存，有部分品種未見存活配子體細(xì)胞，存活的海帶品種配子體成活率均＜3%。

4 結(jié)論

設(shè)置3 個不同的溫度組A（-80 ℃）、B（-40 ℃）、C（-20 ℃）和1 個對照組D（未凍存配子體細(xì)胞），對不同品種的海帶配子體細(xì)胞段或細(xì)胞簇進(jìn)行低溫冷凍保存，15 d 后取出，在適宜條件下發(fā)育培養(yǎng)了6 個月。結(jié)果表明，經(jīng)不同溫度冷凍后的配子體，均可正常發(fā)育，與未經(jīng)冷凍保存配子體相比較，其發(fā)育進(jìn)程和發(fā)育率均無顯著差異。由此可見，經(jīng)10%DMSO 處理的配子體細(xì)胞簇，可以直接放于-80 ℃或-40 ℃進(jìn)行冷凍保存，但此方法的適用海帶品種范圍及保存年限還需進(jìn)一步驗(yàn)證。