菊花枯萎病植株根際土壤細(xì)菌群落多樣性比較

趙婭紅，吳治興，劉敏榮，涂艷芳，薛建平，王悅，盧超，劉佳妮，余磊，姚茹瑜，陳志星，黃飛燕

（1昆明學(xué)院農(nóng)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院/云南省都市特色農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心，昆明 650214；2開遠(yuǎn)市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，云南紅河 661600；3昆明虹之華園藝有限公司，昆明 651700；4云南農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，昆明 650031）

0 引言

菊花屬于菊科菊屬的多年生宿存復(fù)根草本植物，有著極為廣泛的實(shí)用價(jià)值和藥用價(jià)值，產(chǎn)量居于四大切花的首位。但是隨著花卉產(chǎn)業(yè)的發(fā)展、菊花行業(yè)生產(chǎn)規(guī)模的擴(kuò)大，菊花各種病害產(chǎn)生的危害也越來越大，對(duì)菊花產(chǎn)業(yè)的發(fā)展產(chǎn)生影響，也給經(jīng)營者帶來較大的經(jīng)濟(jì)損失?？菸∈蔷栈ㄔ耘噙^程中的重要病害之一，是一種真菌性土傳病害。菊花植株感染該病時(shí)，生長遲緩，菊花葉片由綠發(fā)黃、表面褶皺，致使整株菊花枯死。菊花枯萎病是由病原菌侵入菊植株的根部，寄生于維管束內(nèi)，阻止菊花對(duì)水和養(yǎng)分的吸收，最終導(dǎo)致菊花植株發(fā)生系統(tǒng)性病害[1-2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，其發(fā)病率通常在50%以下，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致絕收，嚴(yán)重影響了菊花相關(guān)產(chǎn)品的產(chǎn)量[3-4]。

由于土壤微生物在自然或人工干預(yù)下的種群消長、生理代謝、群落結(jié)構(gòu)和演化過程都存在著一定的規(guī)律性，因而，開展土壤微生物的生物多樣性是探討其發(fā)生、擴(kuò)散、控制以及促進(jìn)其健康成長的關(guān)鍵。然而，老式可培育方式的結(jié)果檢測(cè)到的微生物僅占環(huán)境微生物的0.1%～1%[5-6]，不能真實(shí)反映微生物生活的環(huán)境狀況。隨著現(xiàn)代工、農(nóng)業(yè)科技的發(fā)展，現(xiàn)有低成本、更精準(zhǔn)的數(shù)據(jù)測(cè)序技術(shù)普遍用于土壤的微生物的實(shí)驗(yàn)研究，目前已經(jīng)作為分析土壤環(huán)境微生物的重要手段，高通量測(cè)序相比傳統(tǒng)的土壤微生物研究方法有很大優(yōu)勢(shì)[7]。如采用高通量測(cè)序技術(shù)分析研究栽種煙草土壤的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化[8]；利用高通量測(cè)序技術(shù)研究在植煙區(qū)土壤中不同施用量生物炭肥對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)影響[9]。很多學(xué)者在這一研究領(lǐng)域已經(jīng)做了很深入的研究實(shí)驗(yàn)。趙霞等[10]利用高通量測(cè)序研究蘭州百合根際微生物群落在堆肥作用下根際多樣性影響研究；王超等[11]利用高通量測(cè)序精確分析土壤微生物群落，分析了微生物肥料對(duì)綠色生態(tài)農(nóng)田根區(qū)土壤微生物群落的結(jié)構(gòu)及影響；賴寶春等[12-13]從辣椒枯萎病病健植株的根際土壤細(xì)菌群落差異性的對(duì)比研究中發(fā)現(xiàn)，根際土群落的變化趨勢(shì)及菌群物種豐度的降低是辣椒患枯萎病的重要特征。對(duì)患病與健康植株根際微生物差異的研究表明，黃瓜(Cucumis sativus)[14]、辣椒(Capsicum annuum)[15]等健株的根際微生物數(shù)量與患病植株存在明顯差異；三七[16]、黃芪(Astragalus propinquus)[17]根腐病病株、棉花(Gossypiumspp.)[18]枯萎病病株以及煙草青枯病[19]病株根際土壤的細(xì)菌和真菌多樣性指數(shù)均顯著低于健株根際土壤；患病玉米(Zea mays)根系真菌區(qū)系中病原菌占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，微生物群落組成向病理組合轉(zhuǎn)變[20]。

目前，在菊花根際土壤微生物研究方面還比較少，尤其是對(duì)菊花枯萎病根際土壤微生物方面的研究。筆者主要對(duì)菊花枯萎病根際土壤微生物進(jìn)行研究，采用高通量測(cè)序技術(shù)分析云南省昆明市菊花種植基地的發(fā)病根際土與健康根際土細(xì)菌群落多樣性，旨在了解2類土壤的微生物群落結(jié)構(gòu)的差異性，從微生物生態(tài)學(xué)的角度探討菊花枯萎病發(fā)病原由，并為防治菊花枯萎病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)時(shí)間、地點(diǎn)

本研究的田間試驗(yàn)于2018年8月在云南省昆明市嵩明縣昆明虹之華園藝公司菊花種植基地進(jìn)行，該地區(qū)氣候條件為當(dāng)?shù)卣l件；室內(nèi)實(shí)驗(yàn)在昆明學(xué)院農(nóng)學(xué)院云南省都市特色農(nóng)業(yè)技術(shù)工程中心進(jìn)行。

1.2 供試材料

實(shí)驗(yàn)用樣品菊花患枯萎病株及健株于2018年8月在云南省昆明市嵩明縣昆明虹之華園藝公司菊花種植基地采集，選菊花枯萎病發(fā)病典型病情嚴(yán)重的種植區(qū)域，土壤樣品分別命名為發(fā)病土(pathogen)和健康土(health)。在同一地塊中選取完全正常生長狀態(tài)的菊花植株和患有菊花枯萎病典型癥狀的植株各3 株，菊花整株拔起前除去表皮土壤，慢慢抖散菊花根系上粘附的疏松的土壤并收集，去除根際土樣里包含的與實(shí)驗(yàn)無關(guān)的雜質(zhì)、碎石和植株細(xì)根，最后余留部分土壤置于提前準(zhǔn)備好的自封袋中，分別采集2份土，一份置于工程中心樓道通風(fēng)處風(fēng)干存放，另外一份置于工程中心實(shí)驗(yàn)室的-80℃冰箱里保存?zhèn)溆?。?duì)采集的菊花健康株和患病菊花植株根、莖分別進(jìn)行病原菌的分離純化，明確所采集的患病植株致病菌為菊花枯萎病致病菌、健康菊花未帶致病菌后，選取對(duì)應(yīng)健康和患病植株根際土樣各3份作為供試土樣。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.3.1 土壤總DNA 的提取 參照FastDNA?SPIN Kit for Soil(MP，USA)：（1）根據(jù)根際土壤細(xì)菌基因組分析DNA提取試劑盒的操作流程提取土樣DNA；（2）DNA的濃度和純度利用“NanoDrop2000”進(jìn)行檢測(cè)；（3）利用含量1%的瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)檢測(cè)樣品DNA提取質(zhì)量。

1.3.2 16S rRNA PCR 擴(kuò)增 使用引物338F(5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG- 3') 和 806R(5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')對(duì)16S rDNA 基因的V3～V4 區(qū)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增[21]，擴(kuò)增程序如下：95℃預(yù)變性3 min，27個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。擴(kuò)增體系為20 μL：4 μL 5× FastPfu 緩沖液；2 μL 2.5 mmol/L dNTPs；0.8 μL Forward Primer (5 μmol/L)；0.8 μL Reverse Primer(5 μmol/L)；0.4 μL FastPfu聚合酶；0.2 μL BSA；10 ng DNA模板；加ddH2O至20 μL。最后用2%瓊脂糖凝膠回收PCR 產(chǎn)物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen，USA)試劑盒進(jìn)一步純化回收，送至測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3.3 下機(jī)數(shù)據(jù)的質(zhì)控與分析原始測(cè)序序列使用Trimmomatic 軟件質(zhì)控，用Flash 軟件進(jìn)行序列拼接；通過Usearch(Version 7.0)軟件過濾得到的序列，并去除嵌合體序列得到有效序列；用Uparse(Version 7.1)軟件在97%的相似性水平上劃分可操作分類序列單元；代表序列用SILVA 數(shù)據(jù)庫和RDP classifier 軟件進(jìn)行物種注釋，利用Mothur(version v.1.30.1)軟件作稀釋度曲線，計(jì)算文庫覆蓋率(Coverage)、Shannon、Simpson、Ace 及Chao1 指數(shù)，對(duì)每個(gè)物種的豐富度指數(shù)及其多樣性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)；利用Qiime(Version 1.7.0)軟件建立的Bray-Curtis 距離算法進(jìn)行主坐標(biāo)分析(PCoA)；利用R 語言中的Vegan 軟件作圖進(jìn)行RDA 冗余分析。

1.3.4 序列生物信息學(xué)分析及數(shù)據(jù)處理針對(duì)以上測(cè)序初數(shù)據(jù)(raw data)[22]進(jìn)行進(jìn)一步操作，通過Usearch 軟件拼接、過濾獲得有用的數(shù)據(jù)?；谟杏脭?shù)據(jù)進(jìn)行OTUs(operational taxonomic units)聚類和物種分類分析得到OTUs 聚類結(jié)果，對(duì)各OTU 代表序列做出物種標(biāo)注，得出相對(duì)應(yīng)的各物種的信息和豐度分布情況；另外再對(duì)OTUs進(jìn)行豐度、Alpha多樣性、Venn圖分析。

采用常用辦公軟件Excel 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析；采用數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)SPSS進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，利用新復(fù)極差法Duncan’s進(jìn)行數(shù)據(jù)比較和綜合分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 病株根際土與健康根際土細(xì)菌群落多樣性及豐富度分析

由表1可知，菊花病株根際土細(xì)菌Shannon指數(shù)為5.48847，健株根際土為5.57778，健株根際土細(xì)菌群落多樣性高于病株根際土。病株根際土細(xì)菌Ace指數(shù)為1666.168075，健株根際土細(xì)菌群落的豐富度高于病株根際土。sobs 表示樣本中觀察到的物種數(shù)目，健康樣品的sobs較發(fā)病樣品高162。

表1 根際土壤細(xì)菌群落多樣性

2.2 Shannon指數(shù)稀釋曲線

由圖1可知，2個(gè)樣本的稀釋曲線最終基本趨于穩(wěn)定，因此測(cè)序量基本包含了樣品菌落的所有物種，說明樣本取樣合理。由表1可知，在OUT相似水平為97%的條件下，計(jì)算出的樣品文庫覆蓋率在98%以上，說明該數(shù)據(jù)真實(shí)反映出樣品土壤細(xì)菌群落。

圖1 Alpha多樣性指數(shù)稀釋曲線

2.3 細(xì)菌群落相關(guān)性分析

圖2為菊花病株和健株根際土菌群Venn圖，發(fā)病植株根際土和健康植株根際土細(xì)菌群落的OUT 數(shù)量分別為1723、1831 個(gè)，兩者共有的OUT 為1661 個(gè)；病株根際土特有的為62個(gè)，健株根際土特有的為170個(gè)，菊花健康植株根際土特有的OUT 數(shù)量是菊花枯萎病病株根際土的2.74倍，兩者之間的差異說明菊花枯萎病造成根際土壤細(xì)菌OUT數(shù)量減少。

圖2 菊花病株和健株根際土菌群Venn圖

2.4 健株和病株根際土細(xì)菌群落組成分析

2.4.1 門水平群落組成從圖3 來看，菊花病株根際土和健株根際土細(xì)菌群落共有8 個(gè)門類，主要為變形菌門、放線菌門、綠彎菌門、厚壁菌門、芽單胞菌門、酸桿菌門、擬桿菌門、Patescibacteria，在病株根際土中相對(duì)豐富度依次為40.76%、23.63%、9.29%、12.18%、4.64%、1.46%、2.05%、4.9%，在健株根際土中相對(duì)豐富度依次為38.79%、23.04%、11.06%、12.68%、3.17%、2.54%、1.85%、4.83%；病株根際土的變形菌門、放線菌門、芽單胞菌門、擬桿菌門相對(duì)豐富度比健株根際土的分別多5.08%、2.56%、46.37%、10.81%。

圖3 菊花病株和健株根際土細(xì)菌門水平群落組成分析

2.4.2 綱水平群落組成由圖4 可知，菊花病株根際土和健康根際土細(xì)菌菌群在綱水平上主要有6 類，分別為α- 變形菌綱(Alphaproteobacteria)、放線菌綱(Actinobacteria)、芽孢桿菌綱(Bacilli)、γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)、綠彎菌綱、Saccharimonadia、芽單孢菌綱(Gemmatimonadetes)，在健康根際土中的相對(duì)豐富度依次為29.3%、23.04%、11.45%、8.71%、5.05%、4.55%、3.16%，在病株根際土的相對(duì)豐富度依次為26.57%、23.62%、11.28%、13.48%、4.61%、4.64%、4.64%，健康植株根際土的α-變形菌綱、芽孢桿菌綱、綠彎菌綱的相對(duì)豐富度比枯萎病發(fā)病株分別多10.27%、1.51%、9.54%；健株根際土的放線菌綱、γ-變形菌綱、Saccharimonadia、芽單孢菌綱相對(duì)豐富度比病株的分別少0.93%、35.39%、1.94%、31.90%，且病健根際土中最優(yōu)勢(shì)綱為α-變形菌綱。

圖4 菊花病株和健株根際土細(xì)菌綱水平群落組成分析

2.4.3 屬水平群落組成由圖5 可知，菊花病株根際土和健株根際土細(xì)菌菌群在屬水平的主要菌群有芽孢桿菌屬(Bacillus)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、微單胞菌屬(Micromonospora)、norank_o_Saccharimonadales、Bradyrhizobium、norank_f_JG30- KF- CM45、norank_f_Gemmatimonadaceae、norank_f_Roseiflexaceae、芽單胞菌屬(Gemmatimonas)，在病株根際土中的相對(duì)豐富度依次為8.56%、6.58%、3.02%、4.66%、3.88%、3.23%、1.77%、2.74%、2.29%、1.76%，在健株根際土中的相對(duì)豐富度依次為8.93%、6.61%、4.97%、3.23%、3.87%、4.05%、3.03%、1.61%、1.21%、1.45%，病株根際土的芽孢桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、節(jié)桿菌屬相對(duì)豐富度比健株的分別少4.14%、0.45%、39.24%。

圖5 菊花病株和健株根際土細(xì)菌屬水平群落組成分析

2.5 基于OUT水平的細(xì)菌群落PCoA分析

圖6 為菊花病株和健株根際土細(xì)菌群落PCoA 分析圖。PC1和PC2分別解釋63.04%、20.35%細(xì)菌群落差異性。病株根際土中的3 個(gè)樣品和健株根際土的3個(gè)樣品在組內(nèi)表現(xiàn)出比較聚集，說明組內(nèi)的菊花病株和健株根際土樣品有較高相似的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，而病株根際土組和健株根際土組的各點(diǎn)距離較遠(yuǎn)沒有聚集，證明各組間群落構(gòu)成相似性較低，微生物群落存在較大差異。

圖6 菊花病株和健株根際土細(xì)菌群落PCoA分析圖

3 結(jié)論

本研究通過高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)菊花枯萎病根際土壤細(xì)菌群落多樣性進(jìn)行檢測(cè)和分析，結(jié)果表明，菊花的根際土壤中細(xì)菌群落組成的變化、細(xì)菌物種多樣性的下降以及菊花的根際土壤豐富度的下降是菊花枯萎病的主要因素，菊花土壤微生態(tài)系統(tǒng)的失衡或許是導(dǎo)致致病菌大量滋生后致使病情發(fā)展迅速的主要原因。結(jié)果顯示，感染菊花枯萎病后，根際土中在門、屬分類水平上的優(yōu)勢(shì)類群分別為變形菌門(Proteobacteria)、芽孢桿菌屬(Bacillus)，且芽孢桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)的相對(duì)豐富度均低于健株。因此，穩(wěn)定根際微生物群落結(jié)構(gòu)是預(yù)防或減輕菊花枯萎病的有效防控途徑之一。此外，進(jìn)行健康菊花植株根際優(yōu)勢(shì)微生物的篩選，并展開對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群與致病菌之間的相互作用研究，將為微生物防治菊花枯萎病提供新的思路。

4 討論

大量研究表明根際土壤微生物多樣性與植物健康密切相關(guān)，較低的土壤微生物多樣性易導(dǎo)致植物土傳病害的發(fā)生[23-24]，而高微生物多樣性和活性有利于促進(jìn)植物生長[25-26]、增強(qiáng)植物自身的防御機(jī)制，從而抑制土傳病害的發(fā)生[27]。

賴春寶等[12]通過對(duì)不同類型的辣椒植株與不同病株根系間的菌種進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，在門水平上健株與病株的根系間微生物組成成分相似，健株與病株間的根際微生物相對(duì)豐度有顯著的差別。筆者采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)菊花健株根際土和發(fā)病植株根際土細(xì)菌多樣性進(jìn)行比較研究，發(fā)現(xiàn)健康植株根際土的Ace 和Shannon 指數(shù)均大于發(fā)病植株根際土，健康根際土壤特有的OUT 數(shù)量高于發(fā)病植株根際土。變形菌門是細(xì)菌中最大的一個(gè)門類，囊括了多種有益于植物生理代謝的菌種，如固氮菌、γ-變形菌、脫硫菌、根瘤菌等[8]。再從屬的水平看，健康植株根際土和發(fā)病植株根際土細(xì)菌群落的優(yōu)勢(shì)菌屬是芽孢桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、節(jié)桿菌屬，在健康菊花根際土樣中的豐度顯著高于菊花枯萎病根際土樣。有研究表明，鞘氨醇單胞菌能清除根際中的有害成分，能在根間產(chǎn)生糖基養(yǎng)分，提高植株免疫力，有利于植物吸收和抵抗多種植物病原菌[28]。還有學(xué)者研究表明，產(chǎn)生N-酰基-高絲氨酸內(nèi)酯(AHLs)細(xì)菌信號(hào)分子的鞘氨醇單孢菌屬，針對(duì)煙草抗病反應(yīng)有緩解效果[29-30]。

張盼盼等[31]在對(duì)南方紅豆杉的根際土壤研究中發(fā)現(xiàn)，放線菌有30.9%的菌株有抑制植物病原真菌活性的作用。筆者研究菊花健株根際土和發(fā)病植株根際群落多樣性，表明放線菌門是存在于土壤中的一類關(guān)鍵生物，可調(diào)節(jié)植物與病原菌之間的生物平衡，從而達(dá)到促進(jìn)植物生長及防治病蟲害的作用；放線菌門作為根際土壤的一類重要微生物，可調(diào)節(jié)植物與病原菌之間的生物平衡，從而達(dá)到促進(jìn)植物生長及其防治病蟲害的作用；同時(shí)筆者還發(fā)現(xiàn)微單胞菌屬(Micromonospora)、norank_f_Roseiflexaceae、芽單胞菌屬(Gemmatimonas)在發(fā)病植株根際土的豐富度高于在健康植株根際土，可能是菊花枯萎病的病原菌，這些屬的細(xì)菌可能對(duì)菊花枯萎病的發(fā)生具有重要意義，需重點(diǎn)關(guān)注。該結(jié)果說明，菊花發(fā)病植株和菊花健康植株的根際土微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性程度有明顯差異，或許是由于菊花枯萎病造成根際土壤的微生物數(shù)量的變化，而芽孢桿菌屬(Bacillus)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、微單胞菌屬(Micromonospora)、norank_o_Saccharimonadales、Bradyrhizobium等可能在菊花枯萎病的發(fā)生中有著重要的影響，需進(jìn)一步研討。