初步探索miR-27b-3p在普萘洛爾治療嬰幼兒血管瘤過程中的作用

朱羿霏 那思家 崔 浩 謝林洋 張 舟 梁 想 方思雅 屠軍波

嬰幼兒血管瘤是嬰幼兒最常見的軟組織腫瘤[1]，發(fā)病率約為3%～10%。常見于出生時或出生后3 至6 個月，由血管生成失調(diào)所引發(fā)血管內(nèi)皮細(xì)胞過度增殖所致。普萘洛爾作為血管瘤治療臨床一線用藥對多數(shù)血管瘤具有顯著療效，但臨床上仍然有部分血管瘤對普萘洛爾治療不敏感[2]，嚴(yán)重影響患兒身心健康，甚至威脅生命。普萘洛爾通過誘導(dǎo)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞凋亡到達(dá)到促進(jìn)血管瘤消退的作用，而細(xì)胞凋亡是一系列連續(xù)和多基因參與調(diào)控的過程[3]。其中凋亡蛋白酶活化因子-1（apoptoticprotease activating factor-1，Apaf-1）是一種哺乳動物線粒體依賴性細(xì)胞凋亡通路中關(guān)鍵因子，其通過激活Caspase 通路，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[4]。Apaf-1 蛋白低表達(dá)，是凋亡小體形成和凋亡信號通路激活的限制因素，其發(fā)生機(jī)制包括基因甲基化、mRNA 超甲基化、Apaf-1 在脂筏中的定位、microRNAs(miRNAs)的抑制、磷酸化以及與特定抑制劑的相互作用等[5]。

miRNAs 是一種短非編碼的單鏈RNA，大約由22 核苷酸組成。miRNAs 通過與靶mRNA 3’-非翻譯區(qū)（3’-UTR）區(qū)域互補(bǔ)配對，調(diào)控轉(zhuǎn)錄后靶基因的活性，從而調(diào)節(jié)不同的生物過程[6]。miRNA 對內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、存活和遷移，以及血管生成具有重要的調(diào)控作用[7]。曾有研究發(fā)現(xiàn)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中miR-23a∕b 和miR-27a∕b 可有效抑制Apaf-1 的表達(dá)[8]，通過targetscan.org 基因數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)miR-27b-3p 與Apaf-1 mRNA3’-UTR 區(qū)域互補(bǔ)。

因此，本研究擬采用細(xì)胞和分子水平探討miR-27b-3p 是否通過靶向抑制Apaf-1 表達(dá)降低血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞凋亡水平，進(jìn)而影響普萘洛爾治療血管瘤的分子機(jī)制，以期利用RNA 干擾技術(shù)增敏普萘洛爾治療效果提供理論基礎(chǔ)。

材料和方法

1.HUVECs 的細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells, HUVECs）購于賽百康公司，在-196℃液氮中凍存，于實驗室行體外傳代培養(yǎng)。將5ml 胎牛血清（Gibco 公司，美國）加入45 ml 的α-MEM 培養(yǎng)基（Hyclone 公司，美國）中，混勻，制備成完全培養(yǎng)基，用于貼壁細(xì)胞HUVECs 培養(yǎng)。37℃、5% CO2和飽和濕度的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，每2 天換 液1 次，3 天 左 右 傳 代1 次。LV-hsa-miR-27b-3p-inhibition 以及其陰性對照（CON137）病毒由上海吉凱公司合成，依據(jù)產(chǎn)品說明書操作，使用HitransG A 感染增強(qiáng)液進(jìn)行轉(zhuǎn)染，得到miR-27b-3p 敲低組（IN 組）與陰性對照組（NC 組），qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染成功即證明miR-27b-3p-IN 組和miR-27b-3p-NC 組構(gòu)建成功；LV-hsa-miR-27b-3p mimics 及其陰性對照病毒由上海吉瑪公司合成，依據(jù)產(chǎn)品說明書，使用GP-transfect-Mate 轉(zhuǎn)染試劑對miR-27b-3p-inhibition（IN 組）進(jìn)行轉(zhuǎn)染，得到miR-IN 組（未轉(zhuǎn)染miR-27b-3p mimics 及陰性對照組）、miR-IN+miR-mimics NC 組（轉(zhuǎn)染miR-27b-3p mimics 陰性對照組）以及miR-IN+miRmimics 組（轉(zhuǎn)染miR-27b-3p mimics 組），qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染成功即證明轉(zhuǎn)染miR-IN 組、miR-IN+miR-mimics NC 組、miR-IN+miR-mimics組成功。

2.CCK-8 實驗檢測細(xì)胞活性

將鹽酸普萘洛爾避光溶于pH 為7.4 的PBS 中，調(diào)整母液濃度為1000 μM，調(diào)整pH 為6.0 備用。以5000 個∕孔的數(shù)量，將HUVECs 接種于96 孔板。待細(xì)胞生長至70%時，以濃度梯度為0、15、30、45、60、90 μM 的鹽酸普萘洛爾處理細(xì)胞。采用Cell Counting Kit-8（CCK-8）試劑盒（武漢博士德公司，中國）進(jìn)行細(xì)胞活性檢測。即普萘洛爾處理24 小時后，將CCK-8 溶液加入培養(yǎng)基中，在37°C，5%CO2環(huán)境中孵育1 小時。然后，將酶標(biāo)儀設(shè)置波長為450 nm，上機(jī)檢測。對照組的培養(yǎng)液說明：選用濃度為0 的鹽酸普萘洛爾處理細(xì)胞組為對照組。

3.流式細(xì)胞實驗檢測細(xì)胞凋亡

按照Annexin V-APC∕7-AAD 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（AT105，聯(lián)科，中國）說明書進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測。收集2×105細(xì)胞棄上清液，PBS 洗滌一次，離心棄上清，再加入500 μl 稀釋的Annexin V Binding Buffer 工作液重懸，再分別加入5 μl Annexin VAPC 和7-AAD，輕柔混勻，室溫避光孵育15 min。最后，采用流式細(xì)胞儀器進(jìn)行細(xì)胞凋亡水平檢測、分析。

4.TUNEL 染色法檢測細(xì)胞凋亡

按照TUNEL 試劑盒（武漢博士德公司，中國）說明書檢測細(xì)胞凋亡水平。以2000 個∕孔的細(xì)胞密度將HUVECs 接種于共聚焦小皿，每孔200 ul 培養(yǎng)基，置于37℃，5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。然后，根據(jù)分組分別加入鹽酸普萘洛爾（實驗組）或PBS（對照組）處理24 小時，用二甲苯清洗細(xì)胞爬片兩次，每次5 min。4%多聚甲醛固定10 min，PBS洗2 次。隨后，用0.5% Triton 處理10 min，PBS 洗2次。以1:200 比例用0.01M TBS 稀釋Proteinase K滴加在共聚焦小皿中，37℃條件下消化10 min，TBS 洗3 次；再將18 μl 緩沖液與1 μl 的TdT 和1 μl 的DIG-d-UTP 混勻，以20 μl∕片的量滴加在共聚焦小皿中，37℃孵育2 h，TBS洗3次；以50 μl∕片的量加入封閉液于共聚焦小皿中，室溫封閉30 min，甩干；用SABC 稀釋液以1:100 比例稀釋生物素化抗地高辛抗體，每片50 μl，37℃孵育30 min，TBS 洗3次；在用SABC 稀釋液以1:100 比例稀釋SABC，每片50 μl，37℃孵育30 min，TBS 洗3 次；最后，DAPI 染液復(fù)染，雙蒸水清洗2 次，抗熒光淬滅劑封片，激光共聚焦顯微鏡觀察、記錄并分析。

5.實時定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)因子基因表達(dá)水平

根據(jù)TRIzol 試劑盒（湖南艾克瑞公司，中國）操作說明書從HUVECs 中分離、收集、純化并提取RNA，利用逆轉(zhuǎn)錄酶和引物合成cDNA，隨后進(jìn)行PCR 實驗。miRNA 反轉(zhuǎn)錄條件為37℃60 min，85℃5 min，4℃-，而其他基因反轉(zhuǎn)錄條件為：第一階段：42°C2 min，4℃-；第二階段：37°C15min，85°C5 s，4℃-。PCR 反應(yīng)條件：95℃30 s，接著39個循環(huán)95℃5 s、60℃20 s，最后95℃10 s。具體引物序列如表1。

表1 RT-PCR引物序列

6.蛋白質(zhì)印跡法檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)因子蛋白表達(dá)水平

按照RIPA 裂解液試劑盒（西安中暉赫彩公司，中國）提取蛋白，BCA 蛋白分析試劑盒（武漢博士德公司，中國）進(jìn)行蛋白定量，PAGE 凝膠（彩膠）快速配成試劑盒（西安子木生物公司，中國）制備凝膠。水浴變性后行SDS 電泳分離蛋白，PVDF 膜轉(zhuǎn)印，5%脫脂奶粉的TBST 封閉2 h，加入anti-Apaf-1、anti-PARP、 anti-Caspase-9、 anti-Caspase-3、 anti-GAPDH 4℃孵育一抗過夜，次日羊抗兔IgG-HRP 室溫孵育2 h，加入200 μl 發(fā)光液，上機(jī)（Bio-Rad ChemiDoc XRS系統(tǒng)），Image Lab軟件定量分析。

7.雙熒光素酶報告實驗檢測miR-27b-3p 與Apaf-1的靶向關(guān)系

將Apaf-1 及其相應(yīng)突變體亞克隆到PSICheck2（上海漢恒生物公司，中國）中構(gòu)建熒光素酶報告載體，分別命名為h-APAF1-3UTR-wt 和h-APAF1-3UTR-mu。 將h-APAF1-3UTR-wt 或h-APAF1-3UTR-mu 目的質(zhì)粒，以及hsa-miR-27b-3p∕Negative.Control（NC）共轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 小時后，根據(jù)雙熒光素酶檢測試劑盒（漢恒生物，中國）說明書操作，利用全波長多功能酶標(biāo)儀SPectraMax M5e（美谷分子儀器，中國）檢測熒光強(qiáng)度。

8.統(tǒng)計學(xué)處理

所有實驗重復(fù)3 次，研究結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示。采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用方差分析進(jìn)行組間差異比較，并使用獨立t檢驗對各組均數(shù)進(jìn)行兩兩比較，P值小于0.05 為有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.普萘洛爾在體外有效抑制HUVECs 細(xì)胞活性、促進(jìn)細(xì)胞凋亡

分別采用0 μM、15 μM、30 μM、45 μM、60 μM、90 μM 濃度梯度普萘洛爾處理HUVECs 24 h，CCK-8實驗結(jié)果揭示普萘洛爾治療組中HUVECs活性明顯被抑制（圖1A）。通過計算獲得普萘洛爾半抑制濃度（IC50）為31.85 μM，故30 μM 濃度的普萘洛爾用于接下來實驗。隨后采用30 μM 濃度的普萘 洛 爾 分 別 以1、2、3、4、5 天 時 間 梯 度 處 理HUVECs，CCK-8 實驗結(jié)果表明細(xì)胞活性隨時間增加逐漸被抑制（圖1B）。為了進(jìn)一步檢測普萘洛爾對HUVECs 細(xì)胞凋亡的影響，我們進(jìn)行了流式細(xì)胞實驗，結(jié)果顯示比較對照組，經(jīng)普萘洛爾處理24 h后，HUVECs 細(xì)胞凋亡增高63.88%（P＜0.001）（圖1C）。同時TUNEL 染色結(jié)果流式細(xì)胞檢測結(jié)果一致，實驗組高于對照組6.18 倍（P＜0.001）（圖1D）。普萘洛爾處理24 h 后，我們通過PCR 和Western Blot 法檢測Apaf-1、PARP、Caspase-9 和Caspase-3的基因和蛋白表達(dá)。PCR 結(jié)果說明與對照組相比（0 μM 普萘洛爾處理組），經(jīng)30 μM 普萘洛爾處理組 中 細(xì) 胞 凋 亡 因 子Apaf-1、PARP、Caspase-9、Caspase-3 mRNA 表達(dá)水平明顯增加，分別為1.37倍、17.12 倍、2.49 倍和2.42 倍（P＜0.001）（圖1E）。Western Blot 法檢測細(xì)胞凋亡因子Apaf-1、PARP、Caspase-9和Caspase-3的蛋白水平改變與PCR結(jié)果一致，分別為4.46 倍、8.21 倍、4.21 倍和8.71 倍（P＜0.001）（圖1F）。上述結(jié)果提示普萘洛爾在體外通過促進(jìn)HUVECs細(xì)胞凋亡，抑制HUVECs增殖。

圖1 普萘洛爾在體外有效抑制HUVECs細(xì)胞活性、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并上調(diào)細(xì)胞凋亡相關(guān)因子Apaf-1、PARP、Caspase-9和Caspase-3的表達(dá)

2.敲低miR-27b-3p 促進(jìn)普萘洛爾誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞凋亡

為了明確miR-27b-3p 在普萘洛爾誘導(dǎo)HUVECs 凋亡中的作用，我們檢測了普萘洛爾處理后HUVECs 中miR-27b-3p 的表達(dá)水平，結(jié)果顯示：普萘洛爾處理后，miR-27b-3p 的表達(dá)水平下調(diào)2.67倍（圖2A，P＜0.001）。同時，陰性對照組（NC 組）及miR-27b-3p 敲低組（IN 組）HUVECs 穩(wěn)轉(zhuǎn)株成功建立并鑒定（圖2B）。隨后，利用建立穩(wěn)轉(zhuǎn)株進(jìn)行CCK-8 實驗、流式細(xì)胞術(shù)和TUNEL 實驗，結(jié)果顯示與對照組相比，經(jīng)普萘洛爾處誘導(dǎo)后，miR-27b-3p敲低組的HUVECs 細(xì)胞活性被有效抑制（圖2C，P＜0.001），細(xì)胞凋亡水平增加6.77%（流式細(xì)胞檢測）和2.06 倍（TUNEL 染色）（圖2D-E，P＜0.001）。經(jīng)過30 μM 普萘洛爾處理HUVECs 穩(wěn)轉(zhuǎn)株NC 組和IN 組24 h 后，PCR 檢測Apaf-1、PARP、Caspase-9 和Caspase-3 的基因和蛋白表達(dá)變化。普萘洛爾誘導(dǎo)后，與陰性對照組相比，miR-27b-3p 敲低組Apaf-1、PARP、Caspase-9、Caspase-3 mRNA 表達(dá)水平明顯增高，分別為4.43 倍、10.76 倍、1.8 倍和（圖2F，P＜0.05 或P＜0.001）。同樣，Apaf-1、PARP、Caspase-9 和Caspase-3 的蛋白水平經(jīng)普萘洛爾處理24 h 后明顯上調(diào)，1.4倍、2.81 倍、1.42 倍和4.14 倍（P＜0.001，圖2G）。綜上，我們發(fā)現(xiàn)普萘洛爾處理后HUVECs 中miR-27b-3p 的表達(dá)降低，而敲低miR-27b-3p 后升高了HUVECs 細(xì)胞凋亡水平，提示miR-27b-3p 在普萘洛爾治療中起抑制作用。

圖2 敲低miR-27b-3p促進(jìn)普萘洛爾誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞凋亡

3.miR-27b-3p 靶向抑制Apaf-1 降低普萘洛爾誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞凋亡

通過targetscan.org 數(shù)據(jù)庫分析并預(yù)測miR-27b-3p 與Apaf-1 mRNA 的3'UTR 匹 配，并 且 熒光素酶報告實驗結(jié)果顯示在與WT Apaf-1 3’UTR（Apaf-1 WT）和miR-27b-3p mimics 共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，與miR-27b-3p 對照或突變Apaf-1 3’UTR（Apaf-1 Mu）相比，熒光素酶活性顯著降低2.45 倍，這證明miR-27b-3p 與Apaf-1 存在靶向關(guān)系（圖3A）。為了進(jìn)一步明確miR-27b-3p 通過降低Apaf-1 表達(dá)，進(jìn)而抑制普萘洛爾誘導(dǎo)HUVECs 細(xì)胞凋亡，我們通過轉(zhuǎn)染miR-27b-3p-mimics 進(jìn)行普萘洛爾處理下的挽救實驗（圖3B）。PCR 實驗結(jié)果顯示比較miR-27b-3p 敲低組（IN 組），miR-27b-3p-mimics 轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡相關(guān)因子mRNA 表達(dá)被顯著下調(diào)，分別為Apaf-1 1.46 倍、PARP 5.66 倍、Caspase-9 7.77倍及Caspase-3 2.66 倍（圖3C，P＜0.001）。同時，Western Blot 實驗結(jié)果與PCR 結(jié)果相一致，細(xì)胞凋亡相關(guān)因子Apaf-1、PARP、Caspase-9 和Caspase-3的蛋白水平分別1.42 倍、3.63 倍、1.7 倍及4.57 倍（圖3D，P＜0.05或P＜0.001）。

圖3 miR-27b-3p靶向抑制Apaf-1降低普萘洛爾誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞凋亡

討 論

IH 是由胚胎期血管內(nèi)皮細(xì)胞過度增殖引起的皮膚良性腫瘤。IH 的治療通常開始于腫瘤增殖的早期，此時有多種治療方法，其中普萘洛爾被公認(rèn)為治療IH的一線藥物，具有加速血管瘤消退的療效[9]。早期研究發(fā)現(xiàn)普萘洛爾通過誘導(dǎo)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞凋亡達(dá)到嬰幼兒血管瘤的快速消退。然而，臨床上仍有部分患兒對普萘洛爾治療敏感度差，甚至無效。已有研究尚不足以解釋普萘洛爾介導(dǎo)的分子網(wǎng)絡(luò)，其治療血管瘤的分子機(jī)制尚未完全理解[10]。

課題組前期研究表明，普萘洛爾通過p53-BAX線粒體凋亡途徑促進(jìn)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，從而加速IH 消退[11～12]。凋亡蛋白酶活化因子-1（Apaf-1）是一種內(nèi)源性凋亡及線粒體依賴性細(xì)胞凋亡通路中的關(guān)鍵因子，Apaf-1 與細(xì)胞色素c 和dATP 結(jié)合后形成一個寡聚凋亡小體，凋亡小體通過結(jié)合和切割Caspase-9 前體蛋白，釋放并激活Caspase-9，進(jìn)而誘導(dǎo)Caspase 級聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[13]。普萘洛爾處理 后，HUVECs 中 Apaf-1、PARP、Caspase-9、Caspase-3的基因和蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)，這與文獻(xiàn)報道普萘洛爾促進(jìn)caspase-3 和caspase-9 的裂解產(chǎn)物和caspase-8 表達(dá)，進(jìn)而介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡相一致[14]，證明普萘洛爾激活A(yù)paf-1 介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路，誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞凋亡。正如文獻(xiàn)報道，miRNA作為非編碼RNA 的一員，在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)，與腫瘤的發(fā)生及發(fā)展具有密切關(guān)系[15]。有報道顯示，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的miR-23a∕b 和miR-27a∕b 抑 制Apaf-1 的 表 達(dá)[8]。而miR-23a 和miR-221 通過與Apaf-1 mRNA 的3'-非翻譯區(qū)結(jié)合來抑制喉癌組織中Apaf-1 的表達(dá)[16，17]。此外，miR-17-5p 通過抑制Apaf-1 凋亡途徑中PARP1∕HMGB1介導(dǎo)的線粒體DNA 損傷來調(diào)節(jié)膿毒癥誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡[18]。通過RNA 干擾技術(shù)敲低HUEVCs 中miR-27b-3p的表達(dá)，顯著增加了細(xì)胞凋亡水平及相關(guān)細(xì)胞凋亡因子表達(dá)。這部分結(jié)果提示miR-27b-3p 可能參與調(diào)控Apaf-1 介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路的調(diào)控。為進(jìn)一步明確這一發(fā)現(xiàn)，我們通過targetscan.org 基因數(shù)據(jù)庫對miR-27b-3p 與Apaf-1 進(jìn)行預(yù)測析，并發(fā)現(xiàn)miR-27b-3p 與Apaf-1 mRNA3’-UTR 區(qū)域互補(bǔ)。同時，雙熒光素酶報告實驗結(jié)果也證實miR-27b-3p與Apaf-1存在靶向關(guān)系。這提示miR-27b-3p 作為非編碼RNA 通過靶向結(jié)合Apaf-1 mRNA，抑制Apaf-1 的表達(dá)，負(fù)向調(diào)控Apaf-1 介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程。因此，我們設(shè)計挽救實驗：向敲低miR-27b-3p 的HUVECs 穩(wěn)轉(zhuǎn)株中轉(zhuǎn)染miR-27b-3p-mimics，挽救miR-27b-3p 表達(dá)。普萘洛爾誘導(dǎo)后，實驗結(jié)果顯示與未轉(zhuǎn)染miR-27b-3p-mimics 組相比miR-27b-3p IN-mimics 組細(xì)胞凋亡水平顯著下降，細(xì)胞凋亡相關(guān)因子的基因和蛋白表達(dá)也顯著被下調(diào)。

綜上所述，本研究揭示普萘洛爾通過激活A(yù)paf-1 介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路治療血管瘤，而miRNA-27b-3p 靶向抑制Apaf-1 表達(dá)，進(jìn)而引起普萘洛爾誘導(dǎo)HUVECs 細(xì)胞凋亡水平下降，而這也是首次關(guān)于miR-27b-3p 在普萘洛爾治療血管瘤中作用的報道。這些研究結(jié)果將加深普萘洛爾治療嬰幼兒血管瘤的理解，為普萘洛爾作為臨床一線用藥治療嬰幼兒血管瘤提供了理論基礎(chǔ)。