二氧化錳納米酶對(duì)小鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎的治療效果研究

周憧憬 任明星 楊 生

牙周炎是世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的口腔疾病之一，被認(rèn)為是成年人牙齒脫落的主要原因[1，2]。目前可用于牙周炎的治療方法包括機(jī)械清創(chuàng)、抗生素和抗炎藥物，以及嚴(yán)重病例的再生手術(shù)[3]。藥物治療作為牙周基礎(chǔ)治療的輔助措施，在控制牙周炎癥和組織破壞中發(fā)揮著重要作用。然而，目前牙周炎的藥物治療以抗菌為主，忽視了免疫調(diào)控在牙周炎癥發(fā)生和組織損傷中的作用而導(dǎo)致治療效果不佳[4～6]。因此，針對(duì)牙周炎特定的病理微環(huán)境，開(kāi)發(fā)牙周炎局部免疫調(diào)節(jié)藥將有助于解決目前的困境。

牙周炎的發(fā)生可歸因于細(xì)菌病原體數(shù)量和宿主對(duì)感染的免疫反應(yīng)之間的失衡。定植在齦下菌斑上的病原體引起的宿主免疫反應(yīng)可能導(dǎo)致活性氧（reactive oxygen species，ROS）的過(guò)度產(chǎn)生，導(dǎo)致氧化應(yīng)激，超出細(xì)胞內(nèi)的抗氧化防御能力，會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化、蛋白質(zhì)變性或DNA 損傷[7]，并對(duì)牙齦、牙槽骨、牙周膜和其他支持牙齒的組織造成損害[8～10]。由此可見(jiàn)，有效清除局部過(guò)量ROS 可以改善牙周微環(huán)境，減輕炎癥狀態(tài)和牙周組織損傷[11]。

最近的研究表明，基于天然酶、納米酶和抗氧化劑的各種抗氧化防御策略可以有效地維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷[12]。然而，大多數(shù)傳統(tǒng)抗氧劑都存在非特異性分布、溶解性低、生物利用度低、毒性代謝產(chǎn)物等缺陷導(dǎo)致治療效果不佳及各種不良反應(yīng)的問(wèn)題[2]。天然抗氧化酶固有的缺點(diǎn)一直限制著其臨床應(yīng)用，如穩(wěn)定性差、成本高、催化活性對(duì)環(huán)境條件敏感等。納米酶是一種極具潛力的新型人工酶，其結(jié)合了天然酶的功能和納米材料的特性，具有成本低、穩(wěn)定性高、可修飾、多功能等優(yōu)點(diǎn)[13～15]。其中，二氧化錳（MnO2）可作為一種類(lèi)似過(guò)氧化氫酶（Catalase，CAT）的納米酶，能催化H2O2生成水和O2，具有良好的抗氧化能力，在抗氧化損傷中得到了廣泛的研究[16，17]。

本研究以牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）為模板和還原劑，以模擬KMnO4消毒過(guò)程的方式制備了BSA-MnO2納米酶。檢測(cè)了其抗氧化功能和生物相容性，并通過(guò)建立小鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎模型，探究了納米酶減輕牙周炎癥和改善牙槽骨吸收的作用，為納米酶局部抗氧化治療牙周炎提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)參考。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)材料

高錳酸鉀（KMnO4，川東化工有限責(zé)任公司）；牛血清白蛋白（BSA，碧云天生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；透析袋（8～14 KDa，陜西白鯊生物科技公司）；PBS緩沖液（天津?yàn)笊镏破房萍加邢挢?zé)任公司）；過(guò)氧化氫（H2O2，Sigma-Aldrich公司）；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8（CCK-8，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；活∕死細(xì)胞試劑盒（上海貝博生物科技有限公司）；細(xì)胞內(nèi)活性氧探針（DCFH-DA；美國(guó)Sigma-Aldrich 公司）；多聚甲醛（PFA，天津?yàn)笊镏破房萍加邢挢?zé)任公司）；H&E 染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；RNAeasyTM動(dòng)物RNA 提取試劑盒（離心柱型，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。

2.實(shí)驗(yàn)細(xì)胞與動(dòng)物

小鼠RAW264.7 細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)（上海，中國(guó)）；C57BL∕6 小鼠由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，在重慶醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院動(dòng)物飼養(yǎng)室進(jìn)行為期10 天的適應(yīng)性喂養(yǎng)后，對(duì)其進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作。動(dòng)物處理和手術(shù)過(guò)程按照重慶醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院倫理委員會(huì)[2022（No.065）]批準(zhǔn)的方案進(jìn)行。

3.試驗(yàn)方法

（1）BSA-MnO2的制備：牛血清白蛋白二氧化錳（BSA-MnO2）納米顆粒是根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的方法，經(jīng)過(guò)一些修改合成的[16]。簡(jiǎn)單地說(shuō)，首先將35 mg KMnO4溶解在5 ml 超純水中；其次將250 mg BSA溶解在15 ml 超純水中的；將KMnO4溶液滴加到BSA 溶液中，邊滴加邊用磁力攪拌器攪拌，然后將整個(gè)溶液在室溫下攪拌4 小時(shí)；之后用透析袋在超純水中透析48 小時(shí)，以去除多余的前體；最后，BSAMnO2被冷凍干燥并儲(chǔ)存在4℃。

（2）BSA-MnO2的表征：①透射電子掃描顯微鏡（TEM）：將納米顆粒溶液滴加到銅網(wǎng)中，干燥后，透射電鏡觀察期形貌。②動(dòng)態(tài)光散射儀（DLS）：選擇合適濃度的納米顆粒溶液，檢測(cè)其水動(dòng)力直徑和Zeta電位。③X 射線光電子能譜儀（XPS）：檢測(cè)納米顆粒的元素。

（3）BSA-MnO2的類(lèi)過(guò)氧化氫酶活性檢測(cè)：通過(guò)使用紫外可見(jiàn)吸收光譜儀監(jiān)測(cè)它們對(duì)H2O2的催化清除而評(píng)估的。將H2O2（10 mM）與BSA-MnO2（50 μg∕ml）混合，通過(guò)紫外可見(jiàn)吸收光譜儀在一段時(shí)間內(nèi)監(jiān)測(cè)240 nm 處的特征吸光度來(lái)測(cè)量H2O2的消除情況。此外，拍照記錄氣泡的產(chǎn)生。

（4）CCK8 細(xì)胞活性檢測(cè)：為了進(jìn)行體外生物安全性檢測(cè)，我們將RAW264.7 細(xì)胞系以每孔1×104個(gè)細(xì)胞的密度接種在96 孔板中，并在完全培養(yǎng)基（89%H-DMEM 培養(yǎng)基，10%FBS，1%AB∕AM）中孵育24 小時(shí)。然后加入不同濃度（0～200 μg∕ml）的BSA-MnO2并培養(yǎng)24 小時(shí)，去掉原培養(yǎng)基后用PBS洗2 次，將10 μl CCK-8 試劑與90 μl 基礎(chǔ)培養(yǎng)基混合加入孔板。再避光孵育2 小時(shí)后，使用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)量每個(gè)孔的吸光度。

（5）活∕死細(xì)胞染色：此外，我們使用活∕死細(xì)胞試劑盒來(lái)驗(yàn)證其細(xì)胞生物相容性。我們將RAW264.7 細(xì)胞系以每孔2×104個(gè)細(xì)胞的密度接種在48孔板中，并在完全培養(yǎng)基中孵育24小時(shí)。然后加入50 μg∕ml 的BSA-MnO2培養(yǎng)24 小時(shí)，去掉原培養(yǎng)基后用PBS 洗2 次，用calcein AM 和PI 染色工作液避光處理20分鐘，PBS 洗3次；用熒光顯微鏡下觀察，活細(xì)胞呈綠色，死細(xì)胞呈紅色，隨機(jī)選擇區(qū)域拍照記錄。每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)對(duì)照。

（6）體外細(xì)胞內(nèi)ROS 水平檢測(cè)：細(xì)胞內(nèi)ROS 水平通過(guò)使用熒光探針DCFH-DA 來(lái)識(shí)別的。我們通過(guò)DCFH-DA 染色后熒光顯微鏡觀察和流式細(xì)胞儀定量檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS 水平。細(xì)胞接種在48 孔板培養(yǎng)24 小時(shí)后，用含有BSA-MnO2（50 μg∕ml）的完全培養(yǎng)基處理24 小時(shí)后，最后用大腸桿菌的LPS（500 ng∕ml）處理24 小 時(shí)。用PBS 清 洗3 次，最后用10 μM DCFH-DA 染色工作液避光培養(yǎng)10 分鐘，然后，使用FITC 通道的熒光顯微鏡測(cè)量細(xì)胞內(nèi)的熒光信號(hào)，隨機(jī)拍攝照片。后者將Raw264.7細(xì)胞接種在12孔板中，如前處理后，離心法收集細(xì)胞，用10 μM DCFH-DA 染色工作液避光培養(yǎng)10 分鐘，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行了流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

（7）小鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎模型的建立和體內(nèi)治療效果的評(píng)估：將18 只6 周齡雄性C57BL∕6 小鼠隨機(jī)分為3組進(jìn)行體內(nèi)治療效果的評(píng)估（每組n=6），實(shí)驗(yàn)分組為：對(duì)照組（Control）、絲線誘導(dǎo)的牙周炎組（Periodontitis，PD）、用BSA-MnO2治療的牙周炎組（PD+BSA-MnO2）。小鼠用異氟烷麻醉后，用5.0 絲線在小鼠雙側(cè)上頜第二磨牙的頸部進(jìn)行結(jié)扎以誘導(dǎo)牙周炎。從造模第一天開(kāi)始，BSA-MnO2治療組的小鼠，我們使用顯微注射器將溶液注射至小鼠第二磨牙結(jié)扎處腭側(cè)牙齦組織內(nèi)（5 mg∕kg，10 mg∕ml，5～6 μl∕側(cè)），治療期間每天給藥一次。在對(duì)照組和牙周炎組的小鼠被以同樣的方式局部注射等量的PBS。每天檢查結(jié)扎情況，在實(shí)驗(yàn)期間所有小鼠的結(jié)扎線都保持在原位。治療7天后，將小鼠CO2安樂(lè)處死，隨后通過(guò)micro-CT、qPCR、HE 等方法評(píng)估體內(nèi)治療效果。

（8）qPCR：采用TRIzol 試劑（Invitrogen，美國(guó)）從Raw264.7 細(xì)胞中提取總RNA。利用含不銹鋼珠的勻漿器將牙周組織在裂解液中勻漿，離心（14000 g，2 min，4℃）收集上清液，使用RNAeasyTM動(dòng)物RNA提取試劑盒（離心柱型）提取組織中RNA。采用PrimeScriptTMRT Master Mix（TAKARA，日本）合成cDNA。使用SYBR Premix Ex TaqTMII（TAKARA，日本）進(jìn)行定量聚合酶鏈反應(yīng)?；虮磉_(dá)是通過(guò)使用基于已發(fā)表的小鼠序列的引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增來(lái)評(píng)估的。引物序列見(jiàn)表1，GADPH為內(nèi)參。每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)對(duì)照。

表1 引物序列

（9）蛋白印跡分析：為了從組織中提取蛋白質(zhì)，牙周組織在混有蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解緩沖液中，被帶有不銹鋼珠的組織勻漿器中勻漿。然后通過(guò)高速離心機(jī)離心收集上清液（14000 g，15 min，4℃）。定量和變性后，用蛋白質(zhì)凝膠電泳（SDSPAGE）分離等量的蛋白質(zhì)，然后轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。用5%BSA 在TBST（含0.1% Tween 的TBS）中封閉1.5 小時(shí)，然后將膜與相關(guān)抗體，包括IL-1β（Abcam，ab283818，美國(guó)）和β-actin（CST，#3700，美國(guó)）抗體孵育。β-actin被用作內(nèi)參。二抗在室溫下孵育2小時(shí)后，用顯影劑（Merck Milli-pore，Darmstadt，德國(guó)）和凝膠成像系統(tǒng)對(duì)蛋白條帶進(jìn)行可視化。

（10）免疫組化染色：上頜牙槽骨切片脫蠟后，在37℃下用胃蛋白酶消化20 分鐘，以進(jìn)行抗原修復(fù)。然后將切片在3%的過(guò)氧化氫溶液中在室溫下孵化10 分鐘以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。然后用5%的山羊血清封閉，并在4℃下用適當(dāng)稀釋的一抗孵育過(guò)夜（4-HNE，Abcam，ab46545，美國(guó)，1：200）。然后，將切片與二抗（Bioss 抗體，中國(guó)，山羊抗兔IgG H&L 抗體，#bs-40295G-HRP，1:300）在室溫下孵育1 小時(shí)。再用顯色液DAB 對(duì)切片進(jìn)行染色，最后，切片用蘇木精染色以顯示細(xì)胞核。顯微鏡拍攝照片。

（11）牙槽骨吸收的檢測(cè)：為了觀察牙槽骨的形態(tài)、數(shù)量和質(zhì)量的變化，我們將小鼠安樂(lè)死后，取下小鼠的上頜骨，用體式顯微鏡拍攝牙槽骨照片，用Micro-CT 儀對(duì)上頜骨進(jìn)行掃描，使用3D Slicer 軟件對(duì)上頜骨進(jìn)行三維數(shù)字化圖像重建并分別測(cè)量近中和遠(yuǎn)中五個(gè)近遠(yuǎn)中切面釉牙骨質(zhì)界-牙槽嵴頂（cementoenamel junction to alveolar bone crest，CEJ-ABC）的距離，并計(jì)算平均值。

（12）組織學(xué)分析：上頜牙槽骨樣本處理后嵌入石蠟中；制備5 μm厚的矢狀切片，用HE 染色后，進(jìn)行組織學(xué)分析，以評(píng)估牙周組織的組織學(xué)變化，所有的切片都在顯微鏡下拍照。

（13）統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用 SPSS 25.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；兩組比較，用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較組間差異；多組比較，用單因素方差分析比較組間差異；使用GraphPad Prism 8.0.2 制作統(tǒng)計(jì)圖，數(shù)據(jù)以平均值和標(biāo)準(zhǔn)差表示；閾值設(shè)置為P＜0.05（*）、P＜0.01（**）或P＜0.001（***）表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.BSA-MnO2納米酶的合成與表征

我們使用牛血清白蛋白作為模板和還原劑，以一種極其巧妙的方式模擬KMnO4的消毒過(guò)程制備了BSA-MnO2。簡(jiǎn)單地說(shuō)，將預(yù)定比例的KMnO4溶液和BSA 溶液混合反應(yīng)，在室溫下攪拌4 小時(shí)，以獲得BSA-MnO2納米顆粒（圖1A）。通過(guò)透射電子顯微鏡（TEM）可以看出，BSA-MnO2納米顆粒呈現(xiàn)較規(guī)則的球形形態(tài)，而且大小比較均勻（圖1B）。通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射粒徑儀（DLS）檢測(cè)了納米顆粒的平均粒徑和Zeta 電位，結(jié)果顯示BSA-MnO2的粒徑大小約8 nm（圖1C），Zeta 電位約-25 mV（圖1D）。為了驗(yàn)證納米顆粒中存在二氧化錳，我們通過(guò)X 射線光電子能譜（XPS）檢測(cè)BSA-MnO2的元素，其XPS光譜中出現(xiàn)641.8 eV 和653.5 eV 兩處結(jié)合能峰，可分別歸因 于MnO2的Mn2p 3∕2 和Mn2p 1∕2（圖1F 和 圖1G）[16]。此外，通過(guò)BSA-MnO2與H2O2的催化反應(yīng)，來(lái)驗(yàn)證其類(lèi)過(guò)氧化氫酶活性，結(jié)果顯示其以時(shí)間依賴的方式清除H2O2（圖1H）。而且反應(yīng)后，能觀察到了大量的氣泡（O2）（圖1E），表明H2O2被MnO2迅速分解為H2O和O2。

圖1 BSA-MnO2納米酶的合成與表征

2.BSA-MnO2納米酶的體外生物學(xué)作用

在進(jìn)行體外和體內(nèi)的生物評(píng)價(jià)和治療研究之前，我們首先檢測(cè)了BSA-MnO2的體外生物安全性。BSA-MnO2在RAW264.7 細(xì)胞中的細(xì)胞毒性是通過(guò)CCK-8 實(shí)驗(yàn)評(píng)估的。如圖2A 所示，BSA-MnO2在濃度達(dá)到50 μg∕mL時(shí)對(duì)細(xì)胞活力沒(méi)有明顯影響，表明納米顆粒具有良好的生物相容性。此外，我們通過(guò)活細(xì)胞和死細(xì)胞染色實(shí)驗(yàn)分析了50 μg∕mL BSAMnO2在RAW264.7 細(xì)胞中的細(xì)胞毒性，結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，細(xì)胞活力沒(méi)有明顯差異（圖2B）。因此，我們?cè)陔S后的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中使用50 μg∕ml。

圖2 BSA-MnO2納米酶的體外生物學(xué)作用

接下來(lái)通過(guò)DCFH-DA 孵育細(xì)胞后的熒光強(qiáng)度來(lái)檢測(cè)細(xì)胞中活性氧水平的變化。如圖2C 熒光顯微鏡拍攝圖像顯示，LPS 刺激導(dǎo)致熒光信號(hào)明顯增強(qiáng)；然而，這些信號(hào)在與BSA-MnO2孵育后明顯減弱，表明納米顆粒具有良好的清除ROS 的能力。此外，我們用流式細(xì)胞儀對(duì)熒光進(jìn)行量化，與DCFH-DA 染色熒光圖顯示出的結(jié)果一致，BSA-MnO2有效地降低了細(xì)胞的熒光強(qiáng)度（圖2D）。

在上述結(jié)果的鼓舞下，我們進(jìn)一步評(píng)估了其對(duì)LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞炎癥的抑制作用。qPCR結(jié)果顯示，在LPS 刺激后，RAW264.7 細(xì)胞中與炎癥相關(guān)的基因iNOS、TNF-α的表達(dá)明顯增加，而用BSA-MnO2預(yù)處理的細(xì)胞與單獨(dú)用LPS 處理的細(xì)胞相比，這些基因的表達(dá)明顯減少（P＜0.01）（圖2E 和F）。

3.BSA-MnO2納米酶的體內(nèi)生物學(xué)作用

為了評(píng)估BSA-MnO2在體內(nèi)的治療效果，我們建立了小鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎模型。每天牙周局部給予BSA-MnO2治療，7 天后，將小鼠安樂(lè)死，再進(jìn)行后續(xù)的一系列研究。

首先，qPCR 結(jié)果，如圖3A-C 結(jié)果顯示，在牙周炎小鼠的牙周組織中，炎癥因子表達(dá)明顯上調(diào)，而B(niǎo)SA-MnO2處理后，iNOS、IL-1β、IL-6的表達(dá)明顯下降。蛋白質(zhì)印跡分析結(jié)果，如圖3D 和圖3E 所示，在患有牙周炎的小鼠中，IL-1β 的蛋白水平明顯增加，表明BSA-MnO2能有效抑制牙周組織炎癥。

圖3 BSA-MnO2的體內(nèi)抗炎抗氧化效果

接下來(lái)，我們進(jìn)一步研究了BSA-MnO2是否在體內(nèi)發(fā)揮了積極的抗氧化作用。對(duì)各個(gè)組牙周組織中的4-HNE 進(jìn)行免疫組化染色，以驗(yàn)證其在體內(nèi)的抗氧化效果。如圖3F 結(jié)果顯示，在對(duì)照組中很少觀察到4-HNE 陽(yáng)性細(xì)胞，但在牙周炎組中陽(yáng)性細(xì)胞明顯增多。

我們通過(guò)體式顯微鏡觀察實(shí)驗(yàn)性牙周炎小鼠牙槽骨的吸收，如圖4A所示，建立牙周炎模型后，小鼠上頜第二磨牙周?chē)难啦酃敲黠@被破壞，而B(niǎo)SAMnO2治療后，明顯地減輕了結(jié)扎引起的上頜第二磨牙周?chē)难啦酃俏?。Micro-CT 分析顯示出相同的結(jié)果，通過(guò)三維重建圖像，我們可以直觀的觀察到小鼠牙槽骨吸收的代表性形態(tài)變化。如圖4B顯示，與對(duì)照組相比，牙周炎組的牙槽骨吸收明顯，而B(niǎo)SA-MnO2治療組，牙槽骨吸收減少；此外，我們對(duì)各組近遠(yuǎn)中釉牙骨質(zhì)界-牙槽嵴頂?shù)木嚯x進(jìn)行測(cè)量，如圖4D 和4E 所示，牙周炎組CEJ-ABC 的距離較健康對(duì)照組明顯增加，而B(niǎo)SA-MnO2治療組CEJABC的距離較牙周炎組明顯降低，進(jìn)一步表明BSAMnO2顯著減輕了牙周炎小鼠牙槽骨吸收。

圖4 BSA-MnO2的體內(nèi)治療效果

為了進(jìn)一步確認(rèn)納米顆粒治療后，小鼠牙周的組織學(xué)變化，我們對(duì)小鼠牙周組織進(jìn)行了HE 染色。如圖4C顯示，正常小鼠的牙周組織上皮附著接近釉質(zhì)邊緣的交界，結(jié)構(gòu)具有完整性，并且沒(méi)有觀察到明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。然而，患有牙周炎的小鼠顯示出結(jié)合上皮附著被顯著破壞，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，表明牙周組織有廣泛的炎癥；而B(niǎo)SA-MnO2治療組顯示出炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和組織破壞的明顯減少；基于炎癥細(xì)胞數(shù)量的定量分析，如圖4F所示，BSA-MnO2治療組炎癥細(xì)胞總數(shù)明顯低于牙周炎組，表明炎癥被緩解，牙周組織健康得到改善。

討 論

筆者以牛血清白蛋白為模板和還原劑，成功制備了具有良好抗氧化性能的二氧化錳納米酶[16]。有文獻(xiàn)研究證明，與相同合成條件下制備的Fe3O4納米顆粒（迄今為止已知模仿酶的最活躍的納米材料）相比，二氧化錳納米顆粒具有更強(qiáng)的超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫酶活性[18]。本文的TEM 和DLS 結(jié)果顯示二氧化錳納米酶呈球形分散，粒徑大小約8 nm左右。XPS 分析中Mn 的特征峰顯示出二氧化錳的成功合成[19]。此外，BSA-MnO2能有效中和H2O2并生成O2，保持了良好的過(guò)氧化氫酶活性[20]。這些結(jié)果表明，BSA-MnO2納米酶同時(shí)滿足制備簡(jiǎn)單、易于保存、分散均勻、水動(dòng)力學(xué)直徑小、過(guò)氧化氫酶活性高等優(yōu)點(diǎn)，顯示了其良好的體內(nèi)外抗氧化應(yīng)用潛力。

牙周炎的發(fā)展可歸因于致病菌的毒性和宿主的免疫反應(yīng)之間的失衡[21]。由于對(duì)致病菌入侵的強(qiáng)烈反應(yīng)，牙周組織中的免疫細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)量的ROS，超過(guò)了細(xì)胞內(nèi)的抗氧化防御能力，誘發(fā)氧化應(yīng)激，導(dǎo)致不可逆的組織損傷[22]。內(nèi)毒素是由革蘭氏陰性菌引起的牙周炎的主要致病因素，而巨噬細(xì)胞是抵御牙周致病菌的第一道防線[23，24]。用LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞來(lái)模擬牙周炎中免疫細(xì)胞對(duì)致病細(xì)菌入侵的反應(yīng)。筆者結(jié)果顯示BSA-MnO2預(yù)處理RAW264.7 細(xì)胞后，能有效地降低LPS 刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS 水平以及炎癥相關(guān)因子表達(dá)，表明BSA-MnO2納米酶在體外具有良好的抗氧化和抗炎特性。

在體外模擬的炎癥環(huán)境下，納米酶在降低巨噬細(xì)胞氧化應(yīng)激中發(fā)揮了積極作用，筆者認(rèn)為BSAMnO2納米酶可能是一種有前景的牙周炎治療策略。qPCR、蛋白質(zhì)印記分析和免疫組化結(jié)果顯示，BSAMnO2在體內(nèi)發(fā)揮了良好的抗炎和抗氧化作用。此外，體式圖像、Micro-CT、組織切片的HE 染色結(jié)果一致顯示，BSA-MnO2顯著減輕了牙周炎小鼠的牙槽骨吸收[25，26]。所有這些結(jié)果表明，BSA-MnO2在牙周炎的抗氧化治療方面具有巨大潛力。

盡管包括二氧化錳在內(nèi)的金屬和金屬氧化物納米酶克服了天然酶的許多局限性，如穩(wěn)定性低、制備復(fù)雜和儲(chǔ)存成本高等，但目前仍未轉(zhuǎn)化為確切的臨床治療技術(shù)，未來(lái)的研究仍然存在嚴(yán)峻挑戰(zhàn)：①與大多數(shù)天然酶相比，基于金屬和金屬氧化物的納米酶似乎缺乏底物特異性，對(duì)催化性能的精確控制有待提高，特別是對(duì)于具有多酶樣活性的納米酶，還有很長(zhǎng)的路要走；②對(duì)內(nèi)部催化機(jī)制的探索是理解和掌握納米酶催化反應(yīng)的基礎(chǔ)，然而與新型納米材料的合成和應(yīng)用相比，目前對(duì)納米酶工作機(jī)制的深入研究相對(duì)較少，且致力于機(jī)制探索的先進(jìn)策略也很有限；③納米酶的長(zhǎng)期體內(nèi)毒性仍然是其臨床應(yīng)用的挑戰(zhàn)，盡管大量的研究已經(jīng)涉及到生物相容性的討論，但系統(tǒng)的毒性機(jī)制和相應(yīng)的解決方案仍然是迫切需要的[20，27～29]。因此，BSA-MnO2的臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用仍然有待更多研究和完善。

越來(lái)越多研究表明，線粒體是細(xì)胞的能量中心，亦是細(xì)胞內(nèi)ROS 的主要來(lái)源，在感染或細(xì)胞損傷的情況下，線粒體在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[30～32]。因此，在炎癥性疾病的治療中，應(yīng)用靶向線粒體的抗氧化劑可能是未來(lái)的重要方向。在后續(xù)研究中，我們將繼續(xù)深入調(diào)研能夠靶向線粒體抗氧化納米酶，為治療免疫介導(dǎo)的炎癥性疾?。ㄈ缪乐苎祝┨峁└咝?、精確的抗氧化治療方案。