通心絡(luò)對(duì)高脂血癥兔頸動(dòng)脈外膜微血管新生的影響及機(jī)制

劉美之 邊愛(ài)忠 王俊林 孫愛(ài)敏 安香珍 姚俊葉

(1石家莊市人民醫(yī)院,河北 石家莊 050000;2衡水市景縣中醫(yī)院;3邯鄲邯鋼醫(yī)院)

血管新生是在原有毛細(xì)血管基礎(chǔ)上通過(guò)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖等步驟,以芽生或分隔形式形成新血管的生物學(xué)過(guò)程。滋養(yǎng)血管主要起源于大動(dòng)脈外膜的微血管網(wǎng),這些微血管為動(dòng)脈管壁外層提供氧和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。血管新生是動(dòng)脈粥樣硬化血管病變的重要特征,外膜微血管新生伴隨動(dòng)脈硬化的病理過(guò)程。外膜微血管密度(MVD)增加被認(rèn)為是斑塊形成過(guò)程中動(dòng)脈壁增厚的反應(yīng)。有證據(jù)顯示這種增生反應(yīng)先于內(nèi)皮功能障礙、內(nèi)膜形成或斑塊形成〔1,2〕。外膜微血管被認(rèn)為是炎癥介質(zhì)或細(xì)胞進(jìn)入血管壁的通道,最終可導(dǎo)致斑塊形成,加速疾病的發(fā)展〔3,4〕?？寡苄律委熆梢杂行У亟档屯饽VD,延緩斑塊進(jìn)展〔5,6〕。神經(jīng)和血管在組織中構(gòu)成復(fù)雜的分支網(wǎng)絡(luò),在解剖和功能方面有著密切聯(lián)系〔7〕。血管生成過(guò)程不僅需要完整的內(nèi)皮細(xì)胞,外周神經(jīng)系統(tǒng)也是重要參與者。組織學(xué)研究發(fā)現(xiàn)在動(dòng)脈外膜與中膜交界處分布著大量去甲腎上腺素能和膽堿能神經(jīng)纖維,可釋放多種神經(jīng)遞質(zhì)促進(jìn)血管新生〔8,9〕。在胚胎發(fā)育中,血管外周神經(jīng)可以引導(dǎo)血管分支的結(jié)構(gòu)形成和動(dòng)脈分化〔10,11〕。神經(jīng)肽(NPY)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)是從交感神經(jīng)釋放支配心血管的神經(jīng)遞質(zhì),有潛在的促血管新生作用。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)NPY可以促進(jìn)人內(nèi)皮細(xì)胞黏附、遷移、增殖和毛細(xì)血管管腔形成〔12,13〕。在大鼠后肢缺血模型中,局部應(yīng)用NPY能夠顯著增加血管性血友病因子(vWF)和CD31陽(yáng)性血管的密度,促進(jìn)缺血組織的血管新生〔14〕。另外有文獻(xiàn)報(bào)道神經(jīng)調(diào)節(jié)似乎參與誘導(dǎo)了新生微血管的成熟和穩(wěn)定〔15〕。本研究主要探討通心絡(luò)對(duì)高脂血癥兔頸動(dòng)脈外膜微血管新生的影響及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 普通級(jí)健康新西蘭白兔,3～4月齡,雄性,平均體質(zhì)量(2.0±0.2)kg,購(gòu)自北京富豪實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖中心,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(京)2010-0010。

1.2模型建立及分組、藥物治療 參照文獻(xiàn)〔16〕,建立硅膠管包裹兔右頸總動(dòng)脈模型:3%戊巴比妥鈉(1 ml/kg)經(jīng)耳緣靜脈麻醉,待麻醉脫毛后,將兔仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上。常規(guī)消毒,鋪洞巾。沿其頸部正中線甲狀軟骨下方剪開(kāi)皮膚并逐層鈍性分離各層,暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈鞘,仔細(xì)游離出3～4 cm頸動(dòng)脈,采用醫(yī)用硅膠管,長(zhǎng)20 mm,內(nèi)徑1.7 mm,外徑3.2 mm,縱向切開(kāi)后包裹于新西蘭兔的右頸總動(dòng)脈,生理鹽水沖洗,縫合傷口,局部滴加青霉素鈉。術(shù)后,連續(xù)3 d,1次/d,局部滴加青霉素鈉80萬(wàn)U/d,預(yù)防感染。

實(shí)驗(yàn)兔90只,適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后,頸動(dòng)脈套管術(shù)后隨機(jī)分為正常組、模型組、低劑量通心絡(luò)組、中劑量通心絡(luò)組、高劑量通心絡(luò)組和阿托伐他汀組,每組15只。正常組全程給予普通飼料,其余各組給予高脂飼料(配方為膽固醇1%,豬油5%,蛋黃粉7.5%,基礎(chǔ)飼料86.5%),飼料由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心加工定制,每兔每日限量喂食120 g。高、中、低劑量通心絡(luò)組分別給予通心絡(luò)超微粉0.60、0.30、0.15 g/(kg·d)。阿托伐他汀組給予阿托伐他汀2.50 mg/(kg·d)灌胃給藥。先配制一定濃度的藥物,然后按照3 ml/kg體質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)灌胃。頸動(dòng)脈套管術(shù)后次日開(kāi)始灌胃給藥,正常組、模型組按3 ml/kg體質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)給予0.5%羧甲基纖維素鈉溶液,實(shí)驗(yàn)周期為4 w。

1.3標(biāo)本采集 各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于4 w末取材,取材前,動(dòng)物禁食12 h,使用3%戊巴比妥鈉1 ml/kg處死動(dòng)物,獲取右頸總動(dòng)脈,冰生理鹽水沖洗后,小心剝離外周附著的結(jié)締組織。取材組織一段置于10%的中性甲醛溶液中固定,留做石蠟切片,備用馬松(Masson)染色和免疫組化、免疫熒光實(shí)驗(yàn)。整個(gè)過(guò)程保持無(wú)菌操作,動(dòng)作迅速。另外每組隨機(jī)選取3只動(dòng)物,彩色微球?qū)嶒?yàn)檢測(cè)右頸動(dòng)脈壁微血管血流量。

1.4Masson染色 切片脫蠟至水,鐵蘇木素染色液(Weigert)5～10 min,1%鹽酸酒精分化,麗春紅酸性品紅液染5～10 min,1%磷鉬酸水溶液處理5 min,苯胺藍(lán)液復(fù)染5 min,1%冰醋酸處理1 min,95%酒精脫水,無(wú)水酒精脫水,二甲苯透明,中性樹(shù)膠封固。結(jié)果為膠原纖維呈綠色,血管壁平滑肌細(xì)胞呈紅色,胞核呈藍(lán)褐色。

1.5免疫組織化學(xué) 采用即用型快速酶免疫組化染色方法檢測(cè)VEGF、CD31在頸動(dòng)脈組織的定位和表達(dá)。在石蠟切片脫蠟后,將厚度5 μm頸動(dòng)脈標(biāo)本切片放入3%過(guò)氧化氫(H2O2)溶液,阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。用5%牛血清白蛋白(BSA)按一定比例稀釋好的一抗(CD31 1∶200 Abcam UK;VEGF 1∶200 Abcam UK)覆蓋標(biāo)本組織,4 ℃孵育過(guò)夜。添加辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗覆蓋組織,二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。蘇木素復(fù)染細(xì)胞核,脫水透明封片,在光學(xué)顯微鏡下觀察。結(jié)果判定:VEGF陽(yáng)性染色為位于細(xì)胞質(zhì)的棕黃色顆粒,根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及陽(yáng)性信號(hào)出現(xiàn)的位置綜合判斷結(jié)果,參照文獻(xiàn)〔17〕采用半定量積分法,根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞率和陽(yáng)性細(xì)胞著色強(qiáng)度分別記分。CD31陽(yáng)性著色部位為胞膜或胞質(zhì),采用Weidner等〔18〕提出的方法進(jìn)行CD31標(biāo)記的MVD量化分析。首先在40倍光鏡視野下掃視整個(gè)切片尋找微血管高密度集中區(qū)域作為“熱點(diǎn)”,然后在400倍光鏡視野下隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)高倍視野,取其平均值作為該標(biāo)本的MVD。

1.6免疫熒光 石蠟切片脫蠟至水,抗原修復(fù)后,滴加用5%BSA按一定比例稀一抗〔酪氨酸羥化酶(TH)1∶100 Abcam UK;NPY 1∶200 Abcam UK〕覆蓋組織,切片平放于濕盒內(nèi)4 ℃孵育過(guò)夜。玻片置于磷酸鹽緩沖液(PBS,pH7.4)中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次,每次5 min,滴加與一抗相應(yīng)種屬的二抗覆蓋組織,避光室溫孵育60 min。將玻片置于PBS(pH7.4)中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次,每次5 min。4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)復(fù)染細(xì)胞核:玻片置于PBS(pH7.4)中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次,每次5 min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加DAPI染液,避光室溫孵育10 min,切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片,于IX71 熒光倒置顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.7心肌血流量(MBF)檢測(cè) 彩色微球血流測(cè)量系統(tǒng)(Triton Technology,Inc.,USA)檢測(cè)頸動(dòng)脈壁滋養(yǎng)血管的血流量。動(dòng)物麻醉、固定,股動(dòng)脈插管,然后剪斷二、三、四肋骨,暴露心臟,將0.3 ml含有2.1×105個(gè)黃色微球(最大吸光度波長(zhǎng)448 nm)懸浮液與0.2 ml 0.05%吐溫混合液在10 s內(nèi)用注射器直接注入左心室。留取血液及組織標(biāo)本:在微球注射后5 s開(kāi)始勻速股動(dòng)脈采血,持續(xù)1 min。股動(dòng)脈采血后立即取右頸總動(dòng)脈段。血樣本及各組織樣本分置于提前稱(chēng)重的15 ml或50 ml聚丙烯離心管中。再次稱(chēng)重后計(jì)算血樣本及組織重量。每個(gè)離心管中加入濃度為1.0×105個(gè)/ml藍(lán)色微球懸浮液100 μl作為內(nèi)控。通過(guò)強(qiáng)堿溶解,沉降法回收嵌頓在頸動(dòng)脈組織的微球。使用酸化乙氧乙酸乙酯200 μl萃取微球表面的染料,紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)檢測(cè)吸光度值以計(jì)算評(píng)估各待測(cè)器官或組織的微血管血流量,將所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)輸入Triton Technology公司提供的軟件,計(jì)算出各組MBF。

2 結(jié) 果

2.1頸動(dòng)脈Masson染色 如圖1所示,平滑肌細(xì)胞被染成紅色,膠原纖維呈藍(lán)色。正常組腹主動(dòng)脈大體觀察呈乳白色,內(nèi)膜平整光滑,未見(jiàn)脂質(zhì)沉積,模型組腹主動(dòng)脈段內(nèi)膜出現(xiàn)多病灶、散在的脂質(zhì)沉積,脂質(zhì)成分呈紅色,呈斑點(diǎn)或長(zhǎng)短不一的條紋,即脂質(zhì)條紋形成,為動(dòng)脈粥樣硬化早期病變。低、中、高劑量通心絡(luò)組及阿托伐他汀組不同程度減少腹主動(dòng)脈內(nèi)膜的脂質(zhì)沉積,高劑量通心絡(luò)組腹主動(dòng)脈內(nèi)膜脂質(zhì)沉積明顯減少。

A:正常組;B:模型組;C:低劑量通心絡(luò)組;D:中劑量通心絡(luò)組;E:高劑量通心絡(luò)組;F:阿托伐他汀組圖1 各組腹主動(dòng)脈(油紅染色)

2.2頸動(dòng)脈壁MBF變化 模型組頸動(dòng)脈管壁血流量MBF較正常組顯著升高(P<0.01),與模型組比較,通心絡(luò)各劑量組和阿托伐他汀組不同程度降低,以高、中劑量通心絡(luò)組和阿托伐他汀組降低明顯(P<0.05,P<0.01),高劑量通心絡(luò)組較阿托伐他汀組顯著降低(P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 各組MVD、VEGF、MBF比較

2.3頸動(dòng)脈外膜微血管新生 VEGF陽(yáng)性物為棕黃色顆粒狀,主要位于細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞外間質(zhì)中。正常組頸動(dòng)脈組織內(nèi)膜、中膜及外膜均可見(jiàn)VEGF少量陽(yáng)性表達(dá);模型組VEGF在血管各層的陽(yáng)性表達(dá)明顯增多,以外膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞及周邊部位表達(dá)陽(yáng)性;低、中、高劑量通心絡(luò)組和阿托伐他汀組VEGF陽(yáng)性表達(dá)不同程度上減少。模型組VEGF陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于正常組(P<0.01),與模型組比較,高、中劑量通心絡(luò)組和阿托伐他汀干預(yù)后,外膜VEGF陽(yáng)性表達(dá)率明顯降低(P<0.05,P<0.01),以高劑量通心絡(luò)組降低最為顯著(P<0.01),高、中劑量通心絡(luò)組和阿托伐他汀組組間比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

正常組頸動(dòng)脈可見(jiàn)位于頸動(dòng)脈外膜CD31標(biāo)記的少量微血管。模型組血管外膜微血管數(shù)量明顯增多,中膜未見(jiàn)CD31標(biāo)記的微血管。通心絡(luò)各劑量組和阿托伐他汀組外膜微血管數(shù)量不同程度減少,以高、中劑量通心絡(luò)組和阿托伐他汀組外膜微血管數(shù)量減少較為明顯。管壁MVD定量分析顯示,模型組MVD陽(yáng)性標(biāo)記指數(shù)較正常組顯著升高(P<0.01),高、中劑量通心絡(luò)組和阿托伐他汀組MVD陽(yáng)性標(biāo)記指數(shù)較模型組顯著降低(P<0.01),通心絡(luò)高劑量組較阿托伐他汀組MVD陽(yáng)性標(biāo)記指數(shù)降低明顯(P<0.05)。見(jiàn)表1、圖2。

圖2 免疫熒光標(biāo)記TH、NGF、NPY在各組兔頸動(dòng)脈壁表達(dá)(×200)

2.4免疫熒光結(jié)果 正常組TH陽(yáng)性標(biāo)記的交感神經(jīng)分布在動(dòng)脈內(nèi)膜和中膜-外膜交界區(qū)域,模型組外膜微血管周?chē)鶷H表達(dá)顯著,通心絡(luò)各劑量組外膜微血管周?chē)鶷H表達(dá)不同程度減弱。免疫熒光顯示NGF、NPY在頸動(dòng)脈管壁的定位及表達(dá),模型組外膜微血管周?chē)鶱GF和NPY陽(yáng)性表達(dá)明顯增多,通心絡(luò)各劑量組外膜區(qū)域NGF、NPY的陽(yáng)性表達(dá)不同程度下降。見(jiàn)圖2。

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn),通心絡(luò)在一定程度上抑制高脂血癥兔頸動(dòng)脈外膜抑制外膜微血管新生,下調(diào)VEGF和CD34陽(yáng)性表達(dá),減少微血管血流量,及抑制血管外膜神經(jīng)內(nèi)分泌因子NGF及NPY的表達(dá)。因此推測(cè)高脂血癥兔頸動(dòng)脈外膜微血管的新生,可能與降低外膜神經(jīng)內(nèi)分泌因子表達(dá)有關(guān)。

新生內(nèi)膜形成或內(nèi)膜增生是動(dòng)脈粥樣硬化和再狹窄的重要病理標(biāo)志,與外膜滋養(yǎng)血管有關(guān)。外膜血管新生被認(rèn)為是斑塊不穩(wěn)定的因素,促進(jìn)了新生內(nèi)膜形成。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示,長(zhǎng)期應(yīng)用血管新生抑制劑,可以抑制動(dòng)脈粥樣硬化病變進(jìn)展〔19〕。其他數(shù)據(jù)證明了血管新生的程度與斑塊大小的相關(guān)性。血管新生是促血管新生因子與抗血管生成因子相互作用的結(jié)果。VEGF是血管新生的主要調(diào)節(jié)因子,VEGF治療明顯增強(qiáng)了斑塊的發(fā)展〔20〕。血管新生作為一種代償機(jī)制,會(huì)重新分配動(dòng)脈壁微血管血流量。本研究采用彩色微球檢測(cè)了頸動(dòng)脈壁微血管血流量變化,研究數(shù)據(jù)顯示外膜血管新生驅(qū)動(dòng)滋養(yǎng)血管的血流量的增加,通心絡(luò)降低了動(dòng)脈壁微血管血流量。微血管血流量的減少可能潛在減輕了新生內(nèi)膜增生,滋養(yǎng)血管新生在新生內(nèi)膜形成的作用,可以在之前的研究中得到證明〔21〕。

交感神經(jīng)似乎一定程度上刺激了外膜微血管新生,TH免疫熒光顯示滋養(yǎng)血管周?chē)嬖诮桓猩窠?jīng)末梢,提示交感神經(jīng)與外膜血管新生可能具有一定聯(lián)系。模型組外膜微血管新生最顯著,而NPY、NGF的表達(dá)也最明顯,通心絡(luò)各劑量治療組NPY、NGF表達(dá)不同程度下降。頸動(dòng)脈外膜區(qū)域存在著交感神經(jīng)末梢,因此推測(cè)在外膜神經(jīng)末梢釋放神經(jīng)內(nèi)分泌因子會(huì)刺激微血管的新生。通心絡(luò)膠囊具有益氣活血,化瘀通絡(luò)止痛的功效,方中人參味甘微苦,性溫,補(bǔ)益心氣,使氣旺血行,為君藥;水蛭活血化瘀,通經(jīng)透絡(luò);土鱉蟲(chóng)逐瘀通絡(luò);全蟲(chóng)、蜈蚣、蟬蛻蟲(chóng)類(lèi)藥,善于走竄解痙,引諸藥通經(jīng)透絡(luò),共為臣藥,現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究顯示蜈蚣、全蝎等蟲(chóng)類(lèi)藥與調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌密切相關(guān)〔22～24〕;赤芍活血化瘀止痛;冰片芳香走散,疏通經(jīng)絡(luò),共為佐使藥。因此推測(cè)通心絡(luò)抑制外膜微血管新生可能與通過(guò)影響調(diào)節(jié)下調(diào)神經(jīng)內(nèi)分泌因子表達(dá)相關(guān),尚需后續(xù)深入研究。