靶向敲降Linc00673對胃癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響及其機(jī)制

郭紅艷 徐亞茹 李耕慧 孫曉杰 趙正林 吳琦 劉波

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院 1生化教研室,黑龍江 齊齊哈爾 161006;2附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科;3齊齊哈爾市第一醫(yī)院老年科;齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院 4臨床生化教研室;5附屬第二醫(yī)院辦公室)

目前,胃癌占我國消化道腫瘤的第一位,對身體健康危害嚴(yán)重,且在我國的發(fā)病率呈逐年遞增的趨勢。近年來多項(xiàng)研究結(jié)果顯示,長鏈非編碼RNA(LncRNA)與胃癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)〔1～3〕。Linc00673是2015年被鑒定的胰腺癌易感基因,參與非小細(xì)胞肺癌、肝癌、直腸癌和乳腺癌等多種腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移,在胃癌組織中的表達(dá)與該病的淋巴轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和TNM分期相關(guān)〔4〕,但其在胃癌中的生物學(xué)作用尚不完全清楚,對其作用機(jī)制也鮮有報(bào)道。本研究構(gòu)建靶向敲降Linc00673重組慢病毒載體,并將其轉(zhuǎn)染至胃癌MGC-803細(xì)胞系,觀察Linc00673敲降后胃癌細(xì)胞增殖和凋亡等生物學(xué)行為的變化,并探討其作用的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1主要材料與試劑 腎上皮細(xì)胞293T、胃癌細(xì)胞系MGC-803由本課題組凍存,慢病毒重組質(zhì)粒Linc00673-sh1～3由上海捷瑞生物工程有限公司構(gòu)建并測序鑒定,對照空載體質(zhì)粒PSIH1和慢病毒包裝質(zhì)粒pMD2.G、psPAX2由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院黃常志教授惠贈;DMEM、胎牛血清(FBS)和胰酶購自Gibco公司;嘌呤霉素、噻唑藍(lán)(MTT)和碘化丙啶(PI)購自Sigma-Aldrich公司;qPCR試劑盒購自Yeasen生物公司;細(xì)胞凋亡檢測試劑盒為北京四正柏公司產(chǎn)品;蛋白提取和含量測定試劑盒購自Beyotime生物公司,所用抗體均為Cst公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1qPCR檢測Linc00673敲降效率 分別用Linc00673-sh1～3慢病毒和對照空載體PSIH1慢病毒感染常規(guī)培養(yǎng)的MGC-803細(xì)胞,繼續(xù)培養(yǎng)48 h后用2 μg/ml嘌呤霉素篩選,獲得對照空載體和靶向敲降Linc00673的胃癌細(xì)胞系,0.25%的胰酶消化收集各組細(xì)胞,提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng),檢測上述細(xì)胞系中Linc00673的表達(dá)(設(shè)GAPDH為內(nèi)參)。引物由Invitrogen公司合成,Linc00673上游引物CTGCTCTTTGGCCTTGGATG,下游:ACGGATGGAGAAGAGGTCG-T;GAPDH上游引物:CCTGGTATGACA-ACGAATTTG,下游:CAGTGAGGGTCTCTCTCTTCC。反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃變性10 s,60 ℃退火及延伸30 s,40次循環(huán),3個復(fù)孔/樣品,2-ΔΔCt計(jì)算基因的相對表達(dá)量。

1.2.2MTT法檢測細(xì)胞增殖 將轉(zhuǎn)染Linc00673-sh1和PSIH1的MGC-803細(xì)胞分別接種于96孔板,每組6個復(fù)孔,每孔103個細(xì)胞,37 ℃、5%CO2、含10%FBS 的DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng),連續(xù)5 d,每24 h取一塊96孔板,棄培養(yǎng)液并用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗,加入110 μl MTT染液培養(yǎng)4 h,吸去上清液,每孔中加150 μl二甲基亞砜(DMSO),測定492 nm吸光度值,繪制細(xì)胞生長曲線。

1.2.3克隆形成實(shí)驗(yàn) 分別將Linc00673-sh1和PSIH1組細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),以200個細(xì)胞/孔和500個細(xì)胞/孔將細(xì)胞分別分散均勻接種于6孔板中,常規(guī)培養(yǎng)3 w,經(jīng)PBS清洗3次→甲醇固定→結(jié)晶紫染色,顯微鏡下進(jìn)拍照并對細(xì)胞集落計(jì)數(shù)。

1.2.4細(xì)胞周期與凋亡檢測 Linc00673-sh1和PSIH1組細(xì)胞培養(yǎng)48 h,胰酶消化收集細(xì)胞,PBS洗3次,按試劑盒說明書操作,膜聯(lián)蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)/PI雙染檢測細(xì)胞凋亡,PI單染檢測細(xì)胞周期(BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀,USA),細(xì)胞凋亡結(jié)果用CellQuest軟件分析,ModFit軟件分析細(xì)胞周期。

1.2.5qPCR檢測相關(guān)調(diào)控因子及microRNA表達(dá) 將細(xì)胞用胰酶消化收集后提取總RNA,熒光定量PCR試劑盒檢測細(xì)胞E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)7、p19基因及miR-1254、miR-4491的表達(dá)水平,mRNA檢測以GAPDH為內(nèi)參,microRNA檢測以U6為內(nèi)參(試劑盒自帶),反應(yīng)條件同前,各基因引物序列如下:E-cadherin上游引物:5′-CGAGAGCTACACGTTCACGG-3′、下游:5′-GGGTGTCGAGGGAAAAATAGG-3′,p19上游引物:5′-AACCGCTTCGGCAAGAC-3′、下游:5′-ACTGGA-CTGGTACCGGAGGT-3′,MMP7上游引物:5′-AGTGGTCACCTACAGGATCG-3′、下游:5′-GGGATCTCTT-TGCCCCACAT-3′,GAPDH上游引物:5′-CCTGGTATGACAACGAATTTG-3′、下游:5′-CAGTGAGGGTC-TCTCTCTTCC-3′,miR-1254上游引物:5′-AGCCTGGAAGCTGGAGCCTG-3′,miR-4491上游引物:5′-AATGTGGACTGGTGTGACCAAA-3′。

1.2.6Western印跡實(shí)驗(yàn) 提取Linc00673-sh1和PSIH1組細(xì)胞總蛋白,測定蛋白濃度,蛋白樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)并轉(zhuǎn)膜,5%脫脂奶粉常溫封閉2 h,TBST洗聚偏氟乙烯(PVDF)膜后用1∶1 000稀釋的一抗〔B細(xì)胞淋巴瘤基因(Bcl)-2、磷酸化-蛋白激酶B(p-Akt)、核因子(NF)-κB、Zeste增強(qiáng)子同源物(EZH)2、β-catenin和GAPDH〕4 ℃孵育過夜,加二抗(1∶5 000)37 ℃孵育1 h,電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色,凝膠成像處理系統(tǒng)成像。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行Dunnett-t檢驗(yàn)和Studentt檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法鑒定MGC-803細(xì)胞中Linc00673的表達(dá) 將重組慢病毒轉(zhuǎn)染MGC-803細(xì)胞后,Linc00673-sh1、Linc00673-sh2、Linc00673-sh3組細(xì)胞Linc00673相對表達(dá)量(0.297±0.021、0.306±0.008、0.403±0.010)均明顯低于PSIH1組(1.008±0.153,均P<0.01),其中Linc00673-sh1敲降效果最為顯著。

2.2Linc00673敲降抑制MGC-803細(xì)胞生長 與PSIH1組相比,Linc00673-sh1組細(xì)胞增殖速度減慢,細(xì)胞生長的第2～5天,Linc00673-sh1組A492均明顯低于PSIH1組(P<0.01)。見表1。

表1 各組細(xì)胞生長A492比較

2.3Linc00673敲降抑制MGC-803細(xì)胞克隆增殖 在孔板中分別接種200和500個細(xì)胞/孔,培養(yǎng)21 d后可見,轉(zhuǎn)染Linc00673-sh1組的胃癌細(xì)胞集落數(shù)量明顯少于PSIH1組(P<0.05,P<0.01)。見表2、圖1。

圖1 靶向敲降Linc00673抑制細(xì)胞增殖(結(jié)晶紫染色)

表2 各組細(xì)胞集落形成數(shù)比較

2.4靶向敲降Linc00673對MGC-803細(xì)胞周期的影響 靶向敲降Linc00673后的MGC-803細(xì)胞較PSIH1組細(xì)胞G0/G1期、S期比例無明顯變化,而G2/M期細(xì)胞占比明顯高于PSIH1組(P<0.01)。見表3。

表3 Linc00673敲降對MGC-803細(xì)胞周期的影響

2.5Linc00673敲降對相關(guān)調(diào)控因子及microRNA表達(dá)的影響 Linc00673敲降后較PSIH1組細(xì)胞E-cadherin和p19表達(dá)量均明顯增加、MMP7表達(dá)明顯降低,而miR-1254和miR-4491表達(dá)量明顯增加(P<0.05,P<0.01)。見表4。

表4 Linc00673敲降對MGC-803細(xì)胞相關(guān)調(diào)節(jié)因子、microRNA表達(dá)、細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白及PI3K/Akt信號通路關(guān)鍵因子的影響

2.6Linc00673敲降影響細(xì)胞增殖與凋亡的機(jī)制 Linc00673敲降后的胃癌細(xì)胞中PI3K/Akt信號通路相關(guān)因子p-Akt、NF-κB和Bcl-2及增殖相關(guān)蛋白β-catenin和EZH2表達(dá)較PSIH1組明顯降低(P<0.01,P<0.001)。見表4、圖2。

圖2 Western印跡檢測各組細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白及PI3K/Akt信號通路關(guān)鍵因子

2.7Linc00673敲降對MGC-803細(xì)胞凋亡的影響 PSIH1組細(xì)胞晚期凋亡(UR)率和總凋亡(LR+UR)率分別為(7.34±0.76)%和(9.93±0.70)%,而Linc00673-sh1組明顯增加〔(14.39±1.83)%和(15.74±2.06)%,P<0.01〕。見圖3。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測胃癌MGC-803細(xì)胞凋亡

3 討 論

胃癌是發(fā)病率和死亡率均較高的一種惡性腫瘤,早發(fā)現(xiàn)、早治療對降低該病死亡率十分重要〔5〕,盡管近年來胃癌的診斷和治療方面有了顯著的改善,但目前仍缺乏有效的診斷生物標(biāo)志物。因此,闡明胃癌的分子機(jī)制、提高該病診斷水平并有針對性的分子治療十分必要。

Linc00673定位于人染色體17q24.3,其序列包含一個與類固醇受體RNA激活劑(SRA)1非常相似的保守區(qū)域,因此也被稱為“SRA樣非編碼RNA”(SLNCR)Linc00673被鑒定在包括GC在內(nèi)的多種惡性腫瘤的發(fā)生中起作用〔6～8〕,其表達(dá)與癌癥患者臨床預(yù)后的關(guān)系表明,其表達(dá)水平可作為一個潛在的預(yù)后指標(biāo)。本研究結(jié)果可見,Linc00673敲降對GC的發(fā)展起到一定的抑制作用。

越來越多的研究表明,LncRNA 是細(xì)胞內(nèi)信號通路的重要介質(zhì),也是調(diào)控基因表達(dá)的重要分子,參與調(diào)節(jié)mRNA的穩(wěn)定和轉(zhuǎn)運(yùn)及microRNA的海綿作用〔9,10〕。LncRNA 與microRNA相互作用調(diào)控基因表達(dá)是其發(fā)揮作用的主要途徑。

本研究結(jié)果顯示,靶向敲降Linc00673后胃癌細(xì)胞中PI3K下游分子p-Akt及分別具有促進(jìn)增殖和抑制凋亡作用的NF-κB、Bcl-2表達(dá)均降低,這些基因表達(dá)的改變影響PI3K/Akt信號通路活性,從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡抑制細(xì)胞增殖。因此,Linc00673敲降后通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號通路對MGC-803細(xì)胞生物學(xué)行為產(chǎn)生的一系列影響有可能是其發(fā)揮作用的機(jī)制之一。

此外,靶向敲降Linc00673后,細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白β-catenin和EZH2的表達(dá)量也有所降低,而前者參與Wnt信號通路,眾所周知,細(xì)胞信號傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)交錯復(fù)雜,有研究者提出〔11〕,Linc00673還參與SRC-EPK、Wnt、p53和EMT相關(guān)信號通路觀點(diǎn),Linc00673作為一種新發(fā)現(xiàn)的非編碼RNA,其上游調(diào)控和下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的確切機(jī)制有待系統(tǒng)研究和深入研究,以促進(jìn)其臨床應(yīng)用。

盡管目前已經(jīng)明確Linc00673參與了腫瘤進(jìn)程的調(diào)控,但其是否參與其他疾病的發(fā)病,其發(fā)揮作用是否與外泌體相關(guān)?目前還沒有研究者對這些問題進(jìn)行研究探討,其是否可以作為胃癌的診斷、治療、預(yù)后甚至是治療的分子靶標(biāo)仍有待進(jìn)一步研究。