白頭翁湯含藥血清對口腔扁平苔蘚上皮細(xì)胞增殖、凋亡及Fas/FasL信號通路的影響

李敏 王雙雙 高毅 楊夢華 張子建 馮艷紅 李立芳

(河北省中醫(yī)院口腔科,河北 石家莊 050011)

口腔扁平苔蘚(OLP)屬于慢性炎性口腔黏膜性疾病中的一種,臨床有較高發(fā)病率〔1,2〕。OLP臨床表現(xiàn)多樣,主要為白色斑紋、充血及糜爛損害,其中充血、糜爛損害是患者出現(xiàn)疼痛等臨床癥狀的主要病損類型〔3〕。由于此病病因復(fù)雜,目前仍缺乏有效的治療手法,首選治療為糖皮質(zhì)激素藥物治療,但激素的治療常伴隨明顯的副作用,且極易復(fù)發(fā)〔4〕。研究發(fā)現(xiàn)中藥具有副作用小,能改善全身狀況,可長期服用來維持療效等優(yōu)點(diǎn)。白頭翁湯是由白頭翁、黃連、黃柏、秦皮4味中藥組成,可清熱解毒、涼血止痢〔5〕,能促進(jìn)非特異性免疫功能,具有抗炎、抗病毒、止瀉、鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛、抑制腸運(yùn)動的作用〔6〕,但其對OLP的作用機(jī)制還沒有明確的報道。凋亡誘導(dǎo)配體(FasL)受體(Fas)、FasL均是腫瘤壞死因子家族成員,其可特異性地與Fas結(jié)合〔7〕。Fas廣泛分布于不同類型的組織細(xì)胞,其在胞質(zhì)和血清中有少部分可溶性,而FasL分布相對局限,除在活化的T細(xì)胞中有表達(dá),還在一些免疫特殊部位有表達(dá),例如眼睛、胎盤等。Fas/FasL可促進(jìn)分泌炎癥細(xì)胞因子,激發(fā)炎性反應(yīng),參與免疫豁免、免疫逃逸、腫瘤形成及轉(zhuǎn)移等過程〔8,9〕。FasL還可以作為受體傳遞反向信號,促進(jìn)細(xì)胞增殖,并參與一些自身免疫性疾病的發(fā)生。本文旨在研究白頭翁含藥血清對口腔扁平苔蘚上皮細(xì)胞增殖、凋亡及Fas/FasL信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗細(xì)胞和動物 人口腔黏膜角質(zhì)形成細(xì)胞(HOK)購自美國Sciencell Research Laboratories公司。實(shí)驗大鼠均從上海富萊生物科技有限公司購買,共計20只。雄性SD大鼠體質(zhì)量為220～250 g,合格證號:SCXK(貴)2015-0005。在安靜、適當(dāng)室溫、避光的環(huán)境下自由攝食飲水。實(shí)驗動物符合倫理委員會規(guī)定。

1.2藥物及制備 白頭翁湯由白頭翁15 g、黃連6 g、黃柏12 g、秦皮12 g組成,上述藥材均購自新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院,經(jīng)水煎、濃縮成1.0 g/ml濃度藥液備用,制備工藝按照國家中醫(yī)藥管理局中藥制劑管理規(guī)范實(shí)施操作,由河北省中醫(yī)院制劑室完成。

1.3試劑和儀器 美國Sigma公司生產(chǎn)的脂多糖;德國Qiagen公司生產(chǎn)的Fas、FasL抗體;日本Olympus公司生產(chǎn)的顯微鏡;湖南湘儀實(shí)驗室儀器開發(fā)有限公司生產(chǎn)的離心機(jī);日本Nikon公司生產(chǎn)的DXM1200C型數(shù)碼相機(jī)。

1.4含藥血清的制備 將大鼠分為空白組和藥物組,各10只?？瞻捉M給予1 ml生理鹽水灌胃干預(yù),2次/d,共3 d;藥物組給予1.4 g/kg白頭翁湯灌胃,每日兩次,連續(xù)用藥3 d;給藥后大鼠均禁食8 h,于給藥后第4天麻醉各組大鼠,取腹主動脈血于離心管中,離心15 min后收集血清并通過0.22 μm過濾器過濾,分裝于離心管中,56 ℃水浴30 min滅活補(bǔ)體,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5HOK細(xì)胞建立體外OLP炎癥模型 HOK細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清(FBS)溶液、100 U/ml青霉素和鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基中,將培養(yǎng)基置于培養(yǎng)箱(37 ℃、5%CO2)中培養(yǎng);消化并傳代細(xì)胞,3 d傳代1次,取3代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗。將細(xì)胞密度調(diào)整為5×105ml,按照每孔1 ml的劑量分別加入6孔板內(nèi),繼續(xù)培養(yǎng)24 h,棄掉培養(yǎng)基。取1 ml脂多糖,將其加入無血清的培養(yǎng)基中,充分振蕩30 min使二者完全相溶,配制成1 mg/ml的脂多糖溶液,分裝于EP管中。將細(xì)胞分為空白組(僅加入含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基)和實(shí)驗組(在DMEM培養(yǎng)至中加入10 μg/ml脂多糖培養(yǎng)HOK細(xì)胞)。

1.6白頭翁含藥血清干預(yù) 空白組培養(yǎng)細(xì)胞于含10%FBS溶液的培養(yǎng)基中,脂多糖組培養(yǎng)細(xì)胞于含10 μg/ml脂多糖+75 μl 10%空白血清的DMEM培養(yǎng)基中,低劑量組將細(xì)胞培養(yǎng)于含10 μg/ml脂多糖+75 μl 2.5%大鼠白頭翁湯含藥血清+75 μl 57.5%大鼠空白血清的培養(yǎng)基中,中劑量組將細(xì)胞培養(yǎng)于含10 μg/ml脂多糖+75 μl 5%大鼠白頭翁湯含藥血清+75 μl 5%大鼠空白血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng),高劑量組將細(xì)胞培養(yǎng)于含10 μg/ml脂多糖+150 μl 10%大鼠白頭翁湯含藥血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng),分別處理各組細(xì)胞6 h后檢測細(xì)胞因子產(chǎn)物。

1.7酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測細(xì)胞分泌的白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-6和腫瘤壞死因子(TNF)-α表達(dá) 用離心管分別收集各組細(xì)胞培養(yǎng)基中的上清液,離心上清液后測定450 nm處的吸光度值,計算各個樣本細(xì)胞因子的濃度。

1.8CCK-8檢測HOK增殖 收集對數(shù)生長的HOK并接種于孔板內(nèi),在每孔中加入細(xì)胞懸液,再加入每組相應(yīng)的藥物(同1.6)。將孔板置入常規(guī)培養(yǎng)箱(37 ℃、5%CO2)中培養(yǎng),分別孵育細(xì)胞48、72和96 h。將CCK-8溶液加入孔板內(nèi),繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞4 h。測定每孔在450 nm處的OD值。

1.9流式細(xì)胞儀檢測HOK凋亡 將5×結(jié)合緩沖液稀釋為1×結(jié)合緩沖液,將10 μl膜聯(lián)蛋白(Annexin)Ⅴ和20 μl碘化丙啶(PI)加入后配制成Annexin Ⅴ/PI 染色工作液。將培養(yǎng)基棄掉后洗滌細(xì)胞,吸去磷酸鹽緩沖液(PBS),每孔加入0.5 ml 0.25%胰酶,孵育細(xì)胞,棄掉胰酶,PBS洗滌后吹打細(xì)胞,制成細(xì)胞懸液并收集于離心管中,離心5 min后棄掉上清液,用200 μl Annexin Ⅴ/PI 染色液重懸細(xì)胞,輕輕吹打,避光孵育15 min,上機(jī)檢測。

1.10Western印跡檢測細(xì)胞中Fas、FasL蛋白表達(dá) 取各組細(xì)胞加入細(xì)胞蛋白裂解液0.5 ml均漿,在4 ℃環(huán)境下離心15 min,取上清液測量蛋白濃度;煮沸蛋白,電泳變性的蛋白樣品轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,封閉1h后加入Fas和、FasL抗體;繼續(xù)孵育24 h后加入1抗,暗室發(fā)光。

1.11RT-PCR檢測細(xì)胞中Fas、FasL mRNA表達(dá) 取各組細(xì)胞,裂解后提取,合成cDNA,在儀器上檢測Fas和FasL的表達(dá)情況。轉(zhuǎn)錄條件94 ℃ 5 min,94 ℃ 45 s,62 ℃ 45 s,72 ℃ 45 s,共35個循環(huán)。用2-ΔΔCt法進(jìn)行計算相對表達(dá)量,引物序列:Fas正向:5′-TGAAAGCTTGACCTAGAGTG-3′,反向:5′-CAGG-GGCTAGGTACTTGA-3′;FasL正向:5′-TCTTTCCC-TCCATCAGCAC-3′,反向:5′-TCTTTCCCTCCATCAGCAC-3′;β-actin正向:5′-CTGGCATTGTCATGGAC-TCT-3′,反向5′-GCGATGATCTTGATCTTCAT-3′。

1.12統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行單因素方差、t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組細(xì)胞中IL-1β、IL-6和TNF-α表達(dá)比較 低、中、高劑量組和脂多糖組IL-1β、IL-6和TNF-α表達(dá)較空白組顯著增加(P<0.05);與脂多糖組相比,低劑量組、中劑量組和高劑量組細(xì)胞中IL-1β、IL-6和TNF-α表達(dá)均顯著降低,且呈逐漸遞減趨勢(P<0.05);高劑量組細(xì)胞中IL-1β、IL-6和TNF-α表達(dá)較低劑量組和中劑量組下降顯著(P<0.05),見表1。

表1 各組細(xì)胞中IL-1β、IL-6和TNF-α表達(dá)比較

2.2各組HOK增殖比較 與空白組相比,脂多糖組48、72和96 h HOK細(xì)胞的增殖能力顯著降低(P<0.05);與脂多糖相比,低、中和高劑量組HOK在48、72和96 h的增殖能力均顯著升高(P<0.05);與低劑量組相比,中劑量組和高劑量組HOK的增殖能力顯著增加(P<0.05);高劑量組HOK增殖能力較中劑量組回升明顯(P<0.05),見表1。

2.3各組HOK凋亡能力比較 與空白組相比,低、中、高劑量組和脂多糖組HOK細(xì)胞凋亡率顯著增加(P<0.05);低劑量組、中劑量組和高劑量組細(xì)胞凋亡率較脂多糖組均明顯回降,且呈逐漸遞減趨勢(P<0.05),其中高劑量組細(xì)胞凋亡率回降的最為顯著(P<0.05),見圖1、表2。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測HOK細(xì)胞凋亡

表2 各組細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞中Fas、FasL蛋白及mRNA表達(dá)比較

2.4各組細(xì)胞Fas、FasL蛋白和mRNA表達(dá) 與空白組相比,低、中、高劑量組和脂多糖組細(xì)胞中Fas、FasL蛋白及mRNA表達(dá)顯著增加(P<0.05);與脂多糖組相比較,低劑量組、中劑量組和高劑量組細(xì)胞中Fas、FasL蛋白及mRNA表達(dá)均顯著降低(P<0.05);高劑量組細(xì)胞中Fas和FasL蛋白表達(dá)較中劑量組和低劑量組回降的較為顯著(P<0.05),見表2、圖2。

圖2 各組細(xì)胞中Fas和FasL蛋白表達(dá)比較

3 討 論

OLP主要的組織病理學(xué)表現(xiàn)是皮下T細(xì)胞為主的淋巴細(xì)胞帶狀浸潤、基底角質(zhì)形成細(xì)胞液化變性及基底膜角化過度或角質(zhì)層萎縮〔10〕。OLP細(xì)胞損傷的主要因素是損傷部位出現(xiàn)免疫和炎癥反應(yīng),其中上皮細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是OLP中組織損傷的重要機(jī)制〔11〕?；罨亩拘訲細(xì)胞誘導(dǎo)的基底角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡,是OLP重要的組織病理學(xué)特征,即基底膜空泡變性。

研究證實(shí),在OLP患者的唾液及口腔分泌物中發(fā)現(xiàn)核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB及相關(guān)細(xì)胞因子均呈高表達(dá),例如IL-1β、IL-6和TNF-α等,這提示 NF-κB的激活及其相關(guān)細(xì)胞因子的分泌在導(dǎo)致OLP炎性反應(yīng)、促進(jìn)病程發(fā)展過程中起到了重要作用〔12,13〕。有研究〔14〕發(fā)現(xiàn)TNF-α參與OLP的發(fā)病機(jī)制,TNF-α通過激活NF-κB增加OLP的炎性反應(yīng),造成局部炎性反應(yīng)慢性遷延不愈,同時,被炎性因子活化的上皮角質(zhì)形成細(xì)胞本身也會產(chǎn)生TNF-α等炎性因子,這些因子協(xié)同作用,最終導(dǎo)致了OLP病損區(qū)域以細(xì)胞凋亡及炎性反應(yīng)為代表的慢性組織損傷。本研究結(jié)果提示,白頭翁含藥血清對OLP細(xì)胞分泌的炎性因子有抑制作用。白頭翁湯方中白頭翁對涼血止痢有顯著療效;秦皮味苦,對涼肝益腎有顯著療效;黃連對涼心清肝有顯著療效;黃柏對瀉火補(bǔ)水有顯著療效〔15,16〕。

機(jī)體維持穩(wěn)態(tài)的基本條件是細(xì)胞增生與凋亡之間的平衡,而這種平衡一旦被破壞就會引起疾病〔17〕。研究表明,OLP上皮細(xì)胞增殖、修復(fù)、凋亡異常,其中增殖和凋亡異常在OLP損害發(fā)生中有重要作用。本研究結(jié)果提示白頭翁含藥血清可促進(jìn)OLP上皮細(xì)胞的增殖,抑制細(xì)胞凋亡。張婷婷等〔18〕研究證實(shí),與正常對照組凋亡指數(shù)相比,模型組細(xì)胞凋亡指數(shù)升高,其表達(dá)率為85.7%,提示口腔扁平苔蘚的發(fā)生或進(jìn)展可能與上皮細(xì)胞凋亡的異常有關(guān)。Fas-FasL途徑是細(xì)胞毒性T細(xì)胞引起靶細(xì)胞凋亡的主要途徑,與OLP的細(xì)胞凋亡有密切關(guān)系〔19〕。本研究結(jié)果顯示,體外培養(yǎng)的OLP細(xì)胞中Fas和FasL表達(dá)顯著增加,不同濃度的白頭翁含藥血清干預(yù)后細(xì)胞中Fas和FasL表達(dá)顯著降低,且濃度越高蛋白表達(dá)降低越為顯著。有研究證實(shí)〔20〕,在OLP患者中發(fā)現(xiàn)Fas/FasL及顆粒酶B與口腔黏膜角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡相關(guān),且FasL及顆粒酶B的高表達(dá)與OLP病情發(fā)展有密切關(guān)系。

綜上,白頭翁含藥血清可調(diào)節(jié)口腔扁平蘚上皮細(xì)胞的生物學(xué)活性,促進(jìn)口腔黏膜角質(zhì)形成細(xì)胞增殖,抑制其凋亡,降低炎性水平,其作用機(jī)制可能與調(diào)控Fas、FasL蛋白有一定相關(guān)性。