LncRNA FOXD3-AS1靶向miR-127-3p對AngⅡ誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞的影響

杜美玲 王曉元 李會賢 李方江 李飛星

(河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院心血管內(nèi)科,河北 張家口 075400)

長鏈非編碼RNA(LncRNA)是長度大于200 nt蛋白編碼能力缺失的RNA轉(zhuǎn)錄本,其通過表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)在細(xì)胞增殖、分化,遷移和侵襲等生物學(xué)過程中具有重要功能,LncRNA的表達(dá)改變與心腦血管疾病、腫瘤的進(jìn)展密切相關(guān)〔1,2〕。叉頭盒轉(zhuǎn)錄基因D3反義RNA1(FOXD3-AS1)是近年發(fā)現(xiàn)的LncRNA,研究發(fā)現(xiàn)FOXD3-AS1表達(dá)上調(diào)明顯促進(jìn)糖氧剝奪的心肌細(xì)胞凋亡和缺血/再灌注損傷〔3〕。膠質(zhì)瘤、乳腺癌中FOXD3-AS1表達(dá)上調(diào),具有促增殖、促遷移作用〔4,5〕。血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)是動脈粥樣硬化等心血管疾病進(jìn)展的重要步驟。但FOXD3-AS1在VSMCs中的表達(dá)和功能未見報(bào)道。生物信息學(xué)預(yù)測顯示miR-127-3p是FOXD3-AS1的候選靶基因之一。miR-127-3p骨肉瘤組織中表達(dá)下調(diào),上調(diào)miR-127-3p表達(dá)抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖,遷移和侵襲〔6,7〕。然而,FOXD3-AS1是否miR-127-3p參與調(diào)控VSMCs增殖、遷移、侵襲和凋亡尚未可知。本研究以血管緊張素(Ang)Ⅱ誘導(dǎo)人主動脈VSMCs,探討FOXD3-AS1在VSMCs增殖、遷移、侵襲及凋亡中的作用和潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1主要試劑 杜氏改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)和胰蛋白酶購于美國Gibco公司;AngⅡ購于美國Sigma公司;小干擾RNA(si-RNA)、過表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA3.1-RNA)、miRNA模擬物(miRNA mimics)、miRNA抑制物(anti-miRNA)、熒光素酶報(bào)告基因載體合成、構(gòu)建和測序由上海吉瑪制藥公司完成;實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)試劑盒購于大量Takara公司;CCK-8、膜聯(lián)蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin Ⅴ-FITC/PI)雙染細(xì)胞凋亡試劑盒購于北京索萊寶生物技術(shù)有限公司;Transwell小室和基質(zhì)膠購于美國Corning公司;兔源磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶(p-PI3K)單克隆抗體、兔源磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)單克隆抗體、兔源β-actin抗體單克隆購于美國CST公司;兔源細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)D1單克隆抗體、兔源活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(C-caspase)-3多克隆抗體、兔源基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)2多克隆抗體、兔源MMP9多克隆抗體、山羊抗兔IgGⅡ抗購于美國Abcam公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和分組 人主動脈VSMCs購于上海信裕生物工程有限公司,用DMEM于37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng),當(dāng)細(xì)胞生長匯合度達(dá)到85%時,加入胰酶消化,磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后加入細(xì)胞培養(yǎng)液,接種于6孔板進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。分為對照(NC)組:正常培養(yǎng)的VSMCs;AngⅡ組:采用0.001 mol/L AngⅡ處理VSMCs 48 h;AngⅡ+si-con組:轉(zhuǎn)染si-con后進(jìn)行AngⅡ處理;AngⅡ+si-FOXD3-AS1組:轉(zhuǎn)染si-FOXD3-AS1后進(jìn)行AngⅡ處理;AngⅡ+miR-con組:轉(zhuǎn)染miR-con后進(jìn)行AngⅡ處理;AngⅡ+miR-127-3p組:轉(zhuǎn)染miR-127-3p mimics后進(jìn)行AngⅡ處理;AngⅡ+si-FOXD3-AS1+ anti-miR-con組:共轉(zhuǎn)染si-FOXD3-AS1和anti-miR-con后進(jìn)行AngⅡ處理;AngⅡ+si-FOXD3-AS1+anti-miR-127-3p組:共轉(zhuǎn)染si-FOXD3-AS1和anti-miR-127-3p后進(jìn)行AngⅡ處理。細(xì)胞轉(zhuǎn)染參照脂質(zhì)體LipofectamineTM2000說明書進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染,收集轉(zhuǎn)染48 h細(xì)胞進(jìn)行AngⅡ處理。

1.2.2RT-qPCR檢測FOXD3-AS1和miR-127-3p的表達(dá)水平 按照TRIzol使用說明提取各組HA-VSMC細(xì)胞的總RNA,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成互補(bǔ)DNA(cDNA),以cDNA為模板,利用熒光定量試劑盒于ABI 7500型PCR儀上進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增。FOXD3-AS1和miR-127-3p引物由上海生工公司合成,序列(5′-3′):FOXD3-AS1上游引物GAATAGTTGCCGA-GAGAAA,下游GACAGACAGGGATTGGGTT;miR-127-3p上游引物GGAAGATCTGTAGTCCTGTCTGTTGGTCAG,下游CCCAAGCTTCCTGAAGAACTGCTTCCGCC;β-actin上游引物AAGATGACCCAGATCA-TGTTTGAG,下游TAGATGGGCACAGTGTGGGTG;U6上游引物CTCGCTTCGGCAGCACA,下游AACG-CTTCACGAATTTGCGT。利用2-ΔΔCt法計(jì)算FOXD3-AS1和miR-127-3p的新的表達(dá)水平。

1.2.3CCK-8法檢測細(xì)胞增殖 將各組將HA-VSMC細(xì)胞接種于96孔板,貼壁后,每孔加入10 μl的CCK-8試劑,37 ℃避光孵育4 h。酶標(biāo)儀檢測450 nm波長處各孔的吸光度(A)值,計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 收集各組細(xì)胞,采用結(jié)合緩沖液制成1×106個/ml的細(xì)胞懸液。取100 μl的細(xì)胞懸液,分別加入5 μl的Annexin Ⅴ-FITC和5 μl的PI,室溫下加入400 μl的結(jié)合緩沖液,混勻后1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況,見圖1。

圖1 凋亡細(xì)胞(×200)

1.2.5Transwell法檢測遷移和侵襲遷移實(shí)驗(yàn) 無血清DMEM培養(yǎng)基稀釋各組細(xì)胞為5×105個/ml細(xì)胞懸液,取300 μl加入到Transwell小室,24孔板下室加入500 μl的含20%胎牛血清的培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)箱孵育24 h,經(jīng)多聚甲醛室溫固定和結(jié)晶紫染色后,倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞過膜情況,隨機(jī)選取3個視野,拍照記錄細(xì)胞遷移細(xì)胞數(shù)目。侵襲實(shí)驗(yàn):按照1∶8稀釋的基質(zhì)膠鋪于在小室內(nèi),其他步驟參考遷移實(shí)驗(yàn)。

1.2.6雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證FOXD3-AS1和miR-127-3p的靶向關(guān)系 構(gòu)建含有miR-127-3p結(jié)合位點(diǎn)的FOXD3-AS1的野生型(WT-FOXD3-AS1)和突變型(MUT-FOXD3-AS1)熒光素酶報(bào)告基因載體。將WT-FOXD3-AS1和MUT-FOXD3-AS1分別與miR-127-3p mimics和miR-con共轉(zhuǎn)染至VSMCs細(xì)胞,轉(zhuǎn)染48 h檢測各組VSMCs的熒光素酶活性。為證實(shí)FOXD3-AS1對miR-127-3p的調(diào)控關(guān)系,將pcDNA3.1、pcDNA3.1-FOXD3-AS1、si-con、si-FOXD3-AS1分別轉(zhuǎn)染VSMCs,轉(zhuǎn)染48 h時RT-qPCR檢測各組HA-VSMC細(xì)胞miR-127-3p的表達(dá)水平。

1.2.7Western印跡檢測CyclinD1、C-caspase-3、MMP2、MMP9、p-PI3K和p-AKT的表達(dá) 裂解各組細(xì)胞,測定蛋白樣品濃度。取等量蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳,并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。膜封閉后,加入Ⅰ抗(β-actin和p-PI3K抗體1∶1 000稀釋,p-AKT抗體1∶2 000稀釋,其余為1∶500稀釋)室溫孵育2 h。加入Ⅱ抗(1∶2 000)低速搖床室溫孵育1 h。化學(xué)發(fā)光顯影后,以β-actin為內(nèi)參,應(yīng)用ImageJ軟件測定各組細(xì)胞的灰度值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS18.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、方差分析、SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1VSMCs中LncRNA FOXD3-AS1和miR-127-3p的表達(dá)情況 AngⅡ誘導(dǎo)后VSMCs中LncRNA FOXD3-AS1表達(dá)水平顯著升高,miR-127-3p表達(dá)水平顯著降低(P<0.001)。見表1。

表1 HA-VSMC中LncRNA FOXD3-AS1和miR-127-3p表達(dá)量

2.2抑制FOXD3-AS1表達(dá)對VSMCs增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響 與NC組比較,AngⅡ組VSMCs FOXD3-AS1表達(dá)、CyclinD1、MMP2和MMP9蛋白表達(dá)、細(xì)胞存活率、細(xì)胞遷移、侵襲能力顯著升高,C-caspase-3蛋白表達(dá)、細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05);與AngⅡ+si-con組比較,AngⅡ+si-FOXD3-AS1組VSMCs FOXD3-AS1表達(dá)、CyclinD1、MMP2和MMP9蛋白表達(dá)、細(xì)胞存活率、細(xì)胞遷移、侵襲能力顯著降低,C-caspase-3蛋白表達(dá)、細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。見圖2、圖3、表2、圖4。

表2 低表達(dá)FOXD3-AS1對細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響

圖2 低表達(dá)FOXD3-AS1對細(xì)胞凋亡的影響

圖3 低表達(dá)FOXD3-AS1對細(xì)胞遷移和侵襲的影響(結(jié)晶紫染色,×200)

1～4:對照組、AngⅡ組、AngⅡ+si-con組、AngⅡ+si-FOXD3-AS1組圖4 低表達(dá)FOXD3-AS1對CyclinD1、C-caspase-3、MMP2、MMP9蛋白表達(dá)的影響

2.3過表達(dá)miR-127-3p對VSMCs增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響 與AngⅡ+miR-con組比較,AngⅡ+miR-127-3p組VSMCs miR-127-3p表達(dá)、C-caspase-3蛋白表達(dá)、細(xì)胞凋亡率顯著升高,CyclinD1、MMP2和MMP9蛋白表達(dá)、細(xì)胞存活率、細(xì)胞遷移侵襲能力顯著降低(均P<0.001)。見圖5、圖6、圖7、表3。

表3 高表達(dá)miR-127-3p對HA-VSMC細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響

圖5 過表達(dá)miR-127-3p對VSMCs凋亡的影響

圖6 過表達(dá)miR-127-3p對VSMCs遷移、侵襲的影響(結(jié)晶紫染色,×200)

圖7 過表達(dá)miR-127-3p對VSMCs相關(guān)蛋白的影響

2.4LncRNA FOXD3-AS1靶向miR-127-3p 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示,與miR-con和WT-FOXD3-AS1共轉(zhuǎn)染組比較,miR-127-3p mimcis和WT-FOXD3-AS1共轉(zhuǎn)染組VSMCs相對雙熒光素酶活性顯著降低(P<0.05);與miR-con和MUT-FOXD3-AS1共轉(zhuǎn)染組比較,miR-127-3p mimcis和MUT-FOXD3-AS1共轉(zhuǎn)染組VSMCs相對雙熒光素酶活性變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖8、表4。與pcDNA-con組(1.00±0.13)比較,pcDNA-FOXD3-AS1組VSMCs miR-127-3p表達(dá)水平顯著降低(0.40±0.04,P<0.05);與si-con組(0.98±0.10)比較,si-FOXD3-AS1組VSMCs miR-127-3p表達(dá)水平顯著升高(2.39±0.24,P<0.05)。4組差異顯著(F=298.854,P=0.000)。以上結(jié)果提示LncRNA FOXD3-AS1靶向負(fù)性調(diào)控miR-127-3p表達(dá)。

表4 相對熒光素酶活性檢測

圖8 LncRNA FOXD3-AS1靶向miR-127-3p

2.5抑制miR-127-3p表達(dá)可以部分逆轉(zhuǎn)抑制FOXD3-AS1對VSMCs增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響 與AngⅡ+FOXD3-AS1+anti-miR-con組比較,AngⅡ+si-FOXD3-AS1+anti-miR-127-3p組VSMCs miR-127-3p表達(dá)、C-caspase-3蛋白表達(dá)、細(xì)胞凋亡率顯著降低,CyclinD1、MMP2和MMP9蛋白表達(dá)、細(xì)胞存活率、細(xì)胞遷移、侵襲能力顯著升高(均P<0.001)。見表5、圖9、圖10、圖11。

表5 低表達(dá)miR-127-3p可以部分逆轉(zhuǎn)FOXD3-AS1低表達(dá)對VSMC增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響

1,2:AngⅡ+FOXD3-AS1+anti-miR-con組、AngⅡ+si-FOXD3-AS1+anti-miR-127-3p組;圖10、圖11同圖9 抑制miR-127-3p表達(dá)可以部分逆轉(zhuǎn)FOXD3-AS1對VSMCs凋亡的影響

圖10 抑制miR-127-3p表達(dá)可以部分逆轉(zhuǎn)FOXD3-AS1對VSMCs遷移和侵襲的影響(結(jié)晶紫染色,×200)

圖11 各組CyclinD1、C-caspase-3、MMP2、MMP9蛋白表達(dá)

2.6PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白表達(dá) 與NC組比較,AngⅡ組VSMCs細(xì)胞p-PI3K和p-AKT表達(dá)水平顯著升高(P<0.05);與AngⅡ組比較,AngⅡ+si-FOXD3-AS1組VSMCs p-PI3K和p-AKT表達(dá)水平顯著降低;與AngⅡ+si-FOXD3-AS1+anti-miR-con組比較,AngⅡ+si-FOXD3-AS1+anti-miR-127-3p組VSMCs p-PI3K和p-AKT表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。見表6、圖12。

表6 各組PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)

1～5:對照組、AngⅡ組、AngⅡ+si-FOXD3-AS1組、AngⅡ+FOXD3-AS1+anti-miR-con組、AngⅡ+si-FOXD3-AS1+anti-miR-127-3p組圖12 Western印跡檢測各組PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)

3 討 論

AngⅡ在體外具有誘導(dǎo)VSMCs增殖、遷移和侵襲的作用,采用AngⅡ刺激VSMCs是研究動脈粥樣硬化常用的體外細(xì)胞模型。

FOXD3-AS1在高氧誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞中表達(dá)上調(diào),FOXD3-AS1高表達(dá)促進(jìn)高氧誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞死亡,加劇肺損傷〔8〕。FOXD3-AS1的上調(diào)與結(jié)腸癌患者的生存率較低相關(guān),FOXD3-AS1可促進(jìn)腫瘤生長,敲減FOXD3-AS1表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞增殖,遷移和侵襲及細(xì)胞周期并促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔9〕。然而在神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織和細(xì)胞系中FOXD3-AS1下調(diào),高表達(dá)FOXD3-AS1可誘導(dǎo)神經(jīng)元分化,降低神經(jīng)母細(xì)胞瘤在體內(nèi)外的侵襲能力〔10〕。本研究結(jié)果提示,FOXD3-AS1高表達(dá)可能與VSMCs細(xì)胞的異常生物學(xué)行為有關(guān)。MMP2和MMP9參與多種血管過程,其可催化和去除VSMCs周圍的細(xì)胞外基質(zhì),促進(jìn)從VSMC從靜止?fàn)顟B(tài)向增殖和遷移的活躍狀態(tài)轉(zhuǎn)變〔11,12〕。本研究結(jié)果提示,干擾FOXD3-AS1表達(dá)抑制VSMCs的增殖、遷移和侵襲能力,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,對遏制動脈粥樣硬化進(jìn)展具有一定積極意義。

LncRNA發(fā)揮miRNA分子海綿作用是近年來的研究熱點(diǎn),為進(jìn)一步探討FOXD3-AS1調(diào)控VSMCs生物學(xué)行為的分子機(jī)制,本研究采用生物信息學(xué)網(wǎng)站對FOXD3-AS1的靶基因進(jìn)行預(yù)測,顯示miR-127-3p是FOXD3-AS1的潛在靶點(diǎn)。研究顯示miR-127-3p在連續(xù)注射阿霉素誘發(fā)的心臟功能障礙小鼠血漿中表達(dá)下調(diào)〔13〕。在腎臟缺血再灌注大鼠模型中,miR-127-3p是缺血后腎組織修復(fù)過程中HIF-1α的效應(yīng)子〔14〕。此外,miR-127-3p在口腔鱗癌和上皮性卵巢癌中表達(dá)下調(diào),過表達(dá)miR-127-3p可抑制體外腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,是口腔鱗癌和上皮性卵巢癌的潛在治療靶標(biāo)〔15,16〕。本研究結(jié)果提示,FOXD3-AS1通過調(diào)控miR-127-3p表達(dá)進(jìn)而影響VSMCs的增殖、凋亡、遷移和侵襲。

PI3K/AKT信號通路在VSMCs的增殖、遷移和表型轉(zhuǎn)換中具有重要作用,其激活可促進(jìn)血管重塑性疾病的發(fā)生〔17,18〕。本研究提示FOXD3-AS1靶向miR-127-3p對VSMCs的增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響與調(diào)控PI3K/AKT信號通路有關(guān)。