丁樟乳膏的藥效學研究

曾國生，肖小華，羅美蘭

1.江西省皮膚病?？漆t(yī)院，江西 南昌 330001；2.江西省藥物研究所，江西 南昌 330029；3.江西省皮膚病臨床醫(yī)學研究中心，江西 南昌 330001

丁樟乳膏是江西省皮膚病?？漆t(yī)院取得國家發(fā)明專利授權［1］、擬開發(fā)為醫(yī)院制劑的化學復方制劑，由丁酸氫化可的松、樟腦和單硬脂酸甘油酯、十六醇、白凡士林、輕質液狀石蠟、甘油、丙二醇、平平加A-20、聚山梨酯80、枸櫞酸、枸櫞酸鈉、羥苯乙酯、純化水等制備而成，用于過敏性皮炎、脂溢性皮炎、濕疹、神經(jīng)性皮炎等皮膚病的治療。丁酸氫化可的松不含鹵族基團，生物利用度高，不良反應低，皮膚萎縮的危險小，是老人、兒童比較理想的中效外用糖皮質激素；樟腦具有透皮促進、用力涂搽能促進局部血液循環(huán)、局麻等作用，用于皮膚瘙癢癥、汗皰疹等的治療［2］。兩者組成復方制劑，一方面樟腦可促進丁酸氫化可的松的透皮吸收而增加其糖皮質激素作用；另一方面樟腦可減輕疾病的瘙癢癥狀，從而增加治療效果，增強患者的順應性。這些作用特點是基于兩成分藥理作用推斷所得，另外基質組成、生產(chǎn)工藝也會影響丁樟乳膏的治療效果，根據(jù)《醫(yī)療機構制劑注冊管理辦法》的要求，將其開發(fā)為醫(yī)院制劑前要進行主要藥效學作用研究，考察其抗炎、止癢、免疫抑制效果，以為后期的研究和應用提供參考和依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

ACS-3 電子計重器（德清拜杰電器有限公司）；JS15-01 電子天平（上海浦春計量儀器有限公司）；JA2103N 電子天平（上海民橋精密科學儀器有限公司）；ZH-ZZY 足趾容積測量儀（安徽正華生物儀器設備有限公司）。

1.2 動物

ICR 小鼠，SPF 級，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，合格證號：No.430727211100749917、430727201101 069267；SD 大鼠，SPF 級，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，合格證號：430727201101069131。實驗動物使用許可證號：SYXK（贛）2018-0008。

1.3 試藥

丁樟乳膏（自制，批號：200706）；丁樟乳膏賦形劑（自制，批號：200804）；丁酸氫化可的松乳膏（湖南迪諾制藥股份有限公司，國藥準字H20083557，批號：200531）；雙氯芬酸二乙胺乳膠劑（GSK Consumer Healthcare Schweiz AG，注冊證號：H20181225，批號：AE9V）；糠酸莫米松凝膠［華潤三九（南昌）藥業(yè)有限公司，國藥準字H20080010，批號：2007003J ］。二甲苯（西隴科學股份有限公司，批號：2009052）；雞蛋清（市售，試驗時用生理鹽水新鮮配制成10%濃度）；4-氨基吡啶（4-Aminopyridine，4-AP）（上海阿拉丁生化技術有限公司，批號：H2025036）；2、4-二硝基氯苯（DNCB）（成都艾科達化學試劑有限公司，批號：201712191）；橄欖油（上海麥克林生化試劑有限公司，分析純，批號：C10083060）；丙酮（青浦精細化學品廠，分析純，批號：060428）。

2 方法

2.1 二甲苯致小鼠耳腫脹試驗［3-4］

取ICR 小鼠60 只，雌雄各半，隨機分為6 組，每組10 只，分別為丁樟乳膏低、中、高劑量組（12.5 mg/只，25 mg/只，50 mg/只），雙氯芬酸二乙胺乳膠劑組、丁酸氫化可的松乳膏組和空白（丁樟乳膏賦形劑）組（50 mg/只），分別將受試藥物涂抹小鼠右耳前后兩面，連續(xù)給藥3 d，1 次/天。末次給藥1 h 后，用蒸餾水除去各組小鼠試驗部位藥膏，取二甲苯20 μL 涂于小鼠右耳前后兩面，30 min 后斷頸處死動物，沿耳廓基線剪下左右兩耳，用8 mm 直徑打孔器分別在同一部位打下圓耳片，稱重。以每鼠左右耳片重量差作為腫脹度（mg），計算各組腫脹度均值及標準差，并以空白組平均腫脹度與給藥組平均腫脹度之差占空白對照組平均腫脹度的百分比計算腫脹抑制率，比較抗炎作用差異。

2.2 雞蛋清致大鼠足趾腫的試驗［3-4］

取SD 大鼠60 只，雌雄各半，隨機分為6 組，每組10 只，分別為丁樟乳膏低、中、高劑量組（50 mg/只，100 mg/只，200 mg/只），雙氯芬酸二乙胺乳膠劑組、丁酸氫化可的松乳膏組和空白（丁樟乳膏賦形劑）組（200 mg/只），分別將受試藥物涂抹大鼠右側后足，連續(xù)給藥3 d，1 次/天。末次給藥1 h 后，在每只大鼠右側后足跖掌心皮下注射10%雞蛋清0.1 mL，在注射雞蛋清前及注射后1 h、2 h、4 h 后以相同方法測量各組動物右側后足跖體積，以每鼠致炎前后足趾體積差作為腫脹度（mL），計算各組足跖腫脹度平均值和標準差，并計算腫脹抑制率（方法同“2.1”），比較抗炎作用差異。

2.3 對4-AP 致小鼠瘙癢的作用試驗［5-7］

取ICR 小鼠60 只，雌雄各半，按體重隨機分為6 組，每組10 只，分別為丁樟乳膏低、中、高劑量組（12.5 mg/只，25 mg/只，50 mg/只），糠酸莫米松凝膠組、丁酸氫化可的松乳膏組和空白（丁樟乳膏賦形劑）組（50 mg/只），給藥前去除小鼠腹部毛發(fā)，分別將受試藥物涂抹小鼠腹部，連續(xù)給藥3 d，1次/天。末次給藥1 h后，按1 mg/kg注射4-AP于每只小鼠頸背部皮下，立即觀察10 min 內(nèi)小鼠舔體反應，以小鼠連續(xù)反復扭頭舔兩側背部出現(xiàn)短暫停頓，作舔體1 次計算。記錄小鼠舔體反應的潛伏時間及舔體次數(shù)。計算各組潛伏時間、舔體次數(shù)均值與標準差，比較止癢作用差異。

2.4 對DNCB 誘導的小鼠遲發(fā)型超敏反應的影響［8］

取ICR 小鼠70 只，雌雄各半，按體重隨機分為7 組，每組10 只，分別為丁樟乳膏低、中、高劑量組（12.5 mg/只，25 mg/只，50 mg/只），糠酸莫米松凝膠組、丁酸氫化可的松乳膏組、空白（丁樟乳膏賦形劑）組和模型組（50 mg/只）。給藥前刮去小鼠背部毛發(fā)，分別將受試藥物涂抹小鼠背部，其中空白組和模型組均給予丁樟乳膏賦形劑，其余組分別給予相應的藥物，連續(xù)給藥6 d，1 次/天。除空白組外，其余組在試驗第1 天與第3 天用5 % DNCB 溶液0.1 mL 均勻涂抹于各組小鼠腹部致敏，第6 天涂藥后2 h 在各小鼠右耳涂1%DNCB 0.05 mL激發(fā)。激發(fā)24 h 后頸椎脫臼處死小鼠，剪下雙耳，對齊，用7 mm 打孔器取下圓形耳片，稱重，計算各組腫脹度（方法同“2.1”）、各組腫脹度均值與標準差，并以模型組平均腫脹度與給藥組平均腫脹度之差占模型組平均腫脹度的百分比計算腫脹抑制率；解剖取小鼠脾臟、胸腺，稱其濕重，計算各組臟器指數(shù)、均值與標準差，分別與模型組比較。

臟器指數(shù)=臟器重量（mg）÷小鼠體重（g）。

2.5 統(tǒng)計學方法

3 結果

3.1 對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響

與空白組相比，各給藥組小鼠的耳腫脹度均明顯下降（P<0.05），其中丁樟乳膏中、高劑量組下降更為明顯（P<0.01），說明丁樟乳膏低、中、高劑量均具有明顯的抗急性炎癥作用。與雙氯芬酸二乙胺乳膠劑組、丁酸氫化可的松乳膏組比較，丁樟乳膏各劑量組耳腫脹度差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），低劑量組數(shù)值上相當，中、高劑量組略優(yōu)，說明丁樟乳膏抗炎作用不低于雙氯芬酸二乙胺乳膠劑和丁酸氫化可的松乳膏。結果見表1。

表1 對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響

3.2 對雞蛋清致大鼠足趾腫的影響

與空白組相比，各給藥組給藥4 h 后大鼠足跖腫脹度均明顯下降（P<0.05），其中丁樟乳膏中、高劑量組下降更為明顯（P<0.01），說明丁樟乳膏低、中、高劑量均具有明顯的抗雞蛋清致大鼠足趾腫作用。與雙氯芬酸二乙胺乳膠劑組、丁酸氫化可的松乳膏組比較，丁樟乳膏各劑量組腫脹度差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），低、中、高劑量組數(shù)值更小，說明丁樟乳膏抗足趾腫作用強于雙氯芬酸二乙胺乳膠劑和丁酸氫化可的松乳膏。結果見表2。

表2 對雞蛋清致大鼠足趾腫的影響

3.3 對4-AP 致小鼠瘙癢的作用

與空白組相比，丁酸氫化可的松乳膏組，丁樟乳膏低、中劑量組能延長4-AP 致小鼠瘙癢潛伏時間，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；糠酸莫米松凝膠組能非常顯著地延長4-AP 致小鼠瘙癢的潛伏時間（P<0.01）；丁酸氫化可的松乳膏組、丁樟乳膏高劑量組能顯著地減少4-AP 致小鼠瘙癢的舔體次數(shù)，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；丁樟乳膏低、中劑量組、糠酸莫米松凝膠組均能非常顯著地減少4-AP 致小鼠瘙癢的舔體次數(shù),差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。與丁酸氫化可的松乳膏組相比，低、中劑量丁樟乳膏在延長瘙癢潛伏時間、減少舔體次數(shù)方面略有優(yōu)勢。上述結果表明丁樟乳膏對4-AP 致小鼠瘙癢具有較好的止癢作用，但效果有隨劑量增加而減弱的趨勢。結果見表3。

表3 對4-AP致小鼠瘙癢的作用試驗

3.4 對DNCB 誘導的小鼠遲發(fā)型超敏反應的影響

3.4.1 對小鼠耳腫脹的影響與空白組相比，模型組耳腫脹度差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），說明成功建立小鼠耳腫脹模型。與模型組比較，丁樟乳膏低劑量組能一定程度減輕小鼠耳腫脹，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；中、高劑量組能非常顯著地抑制小鼠耳腫脹（P<0.01）；丁酸氫化可的松乳膏組、糠酸莫米松凝膠組能顯著的抑制小鼠耳腫脹（P<0.05）。各試驗組數(shù)據(jù)與丁酸氫化可的松乳膏組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。結果見表4。

表4 對DNCB誘發(fā)小鼠遲發(fā)型超敏反應耳腫脹的影響

3.4.2 對小鼠脾、胸腺指數(shù)的影響與空白組相比，模型組脾指數(shù)、胸腺指數(shù)差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），說明成功建立了小鼠遲發(fā)型超敏反應模型。與模型組比較，丁酸氫化可的松乳膏組、糠酸莫米松凝膠組、丁樟乳膏低、中、高劑量組均能非常顯著的降低小鼠脾指數(shù)（P<0.01）；丁樟乳膏低劑量組、糠酸莫米松凝膠組能一定程度降低小鼠胸腺指數(shù)，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；丁樟乳膏中劑量組能顯著降低小鼠胸腺指數(shù)（P<0.05）；丁樟乳膏高劑量組、丁酸氫化可的松乳膏組能非常顯著的降低小鼠的胸腺指數(shù)（P<0.01）。從數(shù)值上分析，丁樟乳膏對脾、胸腺的抑制作用隨劑量增加而增強。結果見表5。

表5 對DNCB誘發(fā)小鼠遲發(fā)型超敏反應脾、胸腺指數(shù)的影響

綜合上述試驗結果，可知丁樟乳膏對DNCB 誘發(fā)的小鼠遲發(fā)型超敏反應具有顯著的抑制作用，能減輕耳腫脹度，降低脾、胸腺指數(shù)。

4 討論

丁樟乳膏的適應證為過敏性皮炎、脂溢性皮炎、濕疹、神經(jīng)性皮炎等皮膚病，這些是皮膚科的常見病、多發(fā)病，如濕疹是由復雜的內(nèi)、外激發(fā)因子引起的一種遲發(fā)型變態(tài)反應，常反復發(fā)作，易成慢性，各年齡段均可發(fā)生，但以嬰幼兒、老年人多發(fā)［9］。神經(jīng)性皮炎是一種常見的皮膚慢性神經(jīng)功能障礙性疾病，臨床以陣發(fā)性皮膚瘙癢與皮膚苔蘚樣變?yōu)橹饕卣?，病程長，易復發(fā)，遷延難愈［10］。局部外用糖皮質激素類藥物是治療這些疾病的常用方法，往往需要長期、反復使用。但長期使用含氟糖皮質激素制劑易出現(xiàn)表皮與真皮萎縮變薄等不良反應，臨床使用受到一定限制。丁酸氫化可的松是一種不含氟的中效糖皮質激素，局部外用不良反應發(fā)生率低，皮膚萎縮風險小，可用于兒童、老年人及面部皮膚，但長期使用仍有發(fā)生糖皮質激素類藥物不良反應的可能［11］。樟腦是一種萜類有機化合物，具有止癢作用，外用軟膏制劑濃度一般為10%～20%，但由于身體各部位都可吸收從而存在產(chǎn)生不良反應的可能，在嬰幼兒、老年人、孕婦等患者的應用方面受到了較大限制［11］。課題組在總結疾病、藥物特點的基礎上研究制定丁樟乳膏處方，其中丁酸氫化可的松含量為0.1%,與市售制劑相同；樟腦含量為1%，遠低于市售樟腦軟膏含量，期望開發(fā)出一種療效可靠、安全性高、便于患者使用的醫(yī)院制劑。

由于丁樟乳膏中樟腦含量較低，借助其局麻、止癢、透皮促進以及能刺激冷覺感受器、用于皮膚有清涼感等作用增加丁酸氫化可的松的治療效果，因此對本品的藥效學研究主要基于丁酸氫化可的松的糖皮質激素樣作用展開，主要研究其抗炎、止癢和免疫抑制作用。本研究采用經(jīng)典的化學試劑刺激方法建立動物疾病模型來研究丁樟乳膏的藥效學作用；為避免不同批次產(chǎn)品差異對藥效的影響，試驗組使用的是同一批次制劑；基于本品為化學復方制劑，其藥理作用可能強于單方丁酸氫化可的松乳膏的考量，各項試驗高劑量組給藥劑量與上市藥品相同，中、低劑量組給藥劑量分別為高劑量組的50%、25%。

本研究結果表明，丁樟乳膏具有明顯的抗炎、止癢和免疫抑制作用。其抗炎作用不低于丁酸氫化可的松乳膏；在止癢效果上，低、中劑量組效果強于高劑量組和丁酸氫化可的松乳膏，不及糠酸莫米松凝膠，而高劑量組低于丁酸氫化可的松乳膏；在免疫抑制作用方面效果不及丁酸氫化可的松乳膏。這些研究結果在一定程度上體現(xiàn)丁樟乳膏藥效作用與單方制劑的差異，與研究預期一致，對以后的臨床研究和應用具有一定的參考意義。但差異的具體原因需要通過進一步的病理、血清學等研究探明，臨床療效需要進一步的臨床研究進行證實。