紫荊皮鎮(zhèn)痛抗炎活性部位的篩選

李正紅，鄭志田，梁生林

1.南昌大學(xué)第四附屬醫(yī)院，江西 南昌 330003；2.井岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)部，江西 吉安 343009

紫荊（Cercis chinensisBunge）是豆科紫荊屬植物，其干樹(shù)皮為紫荊皮。紫荊皮全年可采，鮮用或干用，別名肉紅、內(nèi)消、紫荊木皮、白林皮。紫荊有很高的藥用價(jià)值，其花、果、木、皮皆可入藥。紫荊皮味苦、性平，入肝經(jīng)；具有活血、解毒、通淋的功效，主治風(fēng)濕痹痛、瘀滯腹痛、月經(jīng)不調(diào)、小便淋痛、疥癬、癤癰腫毒、跌撲損傷、蟲(chóng)蛇叮咬等［1］。研究報(bào)道紫荊皮主要含槲皮素等黃酮類物質(zhì)［2-4］，藥理作用主要為鎮(zhèn)痛［5-7］、抗炎［5-6］、抗菌［1］等。而關(guān)于紫荊皮發(fā)揮止痛消炎效果的具體活性部位，未見(jiàn)有關(guān)研究報(bào)道，為更深一步探明紫荊皮發(fā)揮止痛消炎效果的具體活性部位，本研究利用熱板法、乙酸扭體法疼痛模型對(duì)紫荊皮不同極性溶劑萃取部位的止痛效果進(jìn)行觀測(cè)；利用小鼠耳腫脹法、大鼠腳跖腫脹法和大鼠棉球肉芽腫法炎癥模型，對(duì)紫荊皮不同極性溶劑萃取部位的抗炎效果進(jìn)行了觀測(cè)，并由此判斷其止痛消炎效果的具體活性部位，為紫荊皮的防病治病以及進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

RE-201D 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水真空泵，DHG-9070A 型鼓風(fēng)電熱干燥箱，均購(gòu)于上海市力辰儀表技術(shù)公司；RB-200 型智能熱板儀，PV-200 型足腫容量測(cè)試儀，均購(gòu)于成都泰盟軟件公司；ZH-YLS-25A 電動(dòng)耳腫打耳儀，購(gòu)于安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司；電子分析天平，購(gòu)于上海靳瀾儀器制造有限公司。

1.2 藥品與試劑

紫荊皮于2019 年8 月采自吉安市安?？h，由井岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)部中醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)系周秋貴副教授確認(rèn)為豆科紫荊屬的紫荊（Cercis chinensis）Bunge的樹(shù)皮。鹽酸嗎啡注射液，1 mL∶10 mg，批號(hào)：190801-1，中國(guó)東北制藥集團(tuán)公司沈陽(yáng)第一制藥廠；阿司匹林片，25 mg/片，國(guó)藥準(zhǔn)字H13022944，中國(guó)河北常山生化醫(yī)藥集團(tuán)有限公司；乙酸、二甲苯（均為分析純），廣東翁江化學(xué)試劑有限公司；石油醚、乙酸乙酯、正丁醇（均為分析純），天津市恒興化學(xué)藥劑制造公司。

1.3 動(dòng)物

清潔級(jí)的昆明小鼠，雄性120 只，雌性240 只，體質(zhì)量18～22 g；清潔型SD 大鼠240 只，雄雌各半，體質(zhì)量180～220 g。試驗(yàn)的大鼠購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物產(chǎn)品許可證號(hào)為SCXK（湘）2018-0003；試驗(yàn)的小鼠購(gòu)自長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司，動(dòng)物產(chǎn)品許可證號(hào)為SCXK（湘）2019-0014。

2 方法

2.1 紫荊皮不同萃取部位的制備

2.1.1 水提［8-10］把600 g 干燥紫荊皮用小型中藥機(jī)粉碎成粗粉，在不銹鋼鍋中加純化水后浸泡0.5 h，第1 次加入12 倍藥材量的純化水先用大火煮沸后，再用慢火煎熬1 h，用多層紗布過(guò)濾煎取液，第2、3 次再各加10 倍藥材量的純化水用相同的方式煎熬0.5 h，用多層紗布過(guò)濾煎取液，把3 次煎取液混在一起靜置去渣后，倒入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行旋蒸濃縮至600 mL，把其中200 mL 倒出放入冰箱保存?zhèn)溆茫Ｏ碌?00 mL 用于后續(xù)的萃取。

2.1.2 萃取［8-10］將400 mL 煎取液直接注入1 000 mL的分液漏斗內(nèi)，然后根據(jù)萃取溶劑極性不同首先加入溶劑石油醚500 mL 進(jìn)行萃取，重復(fù)多次，直到萃取液的色澤逐漸變?yōu)闊o(wú)色即可，將得到的石油醚萃取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋蒸，將石油醚溶劑處理干凈后，得石油醚萃取部位浸膏0.30 g；再分別以溶劑乙酸乙酯、正丁醇以相同的方式進(jìn)行萃取，得乙酸乙酯萃取部位浸膏1.26 g、正丁醇萃取部位浸膏3.86 g，然后再將正丁醇萃取以后剩余的液體，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋蒸干后得水部位浸膏16.36 g。

石油醚萃取部位、醋酸乙酯萃取部位、正丁醇萃取部位、水部位用時(shí)均用純化水溶解。

2.2 紫荊皮不同萃取部位的鎮(zhèn)痛作用

2.2.1 熱板法［8-12］插上智能熱板儀電源插頭，等熱板溫度升至并恒定（55.0±0.1）℃時(shí)，把雌性小鼠放到熱板上，觀察并記下小鼠放在熱板到開(kāi)始舔后爪的時(shí)間（s），將這個(gè)時(shí)間作為這只小鼠的痛閾值。采用隨機(jī)數(shù)字表法將120 只痛閾為5～30 s 的合格雌性小鼠隨機(jī)分成12 組，每組10 只：正常對(duì)照組（純化水，10 mL/kg），陽(yáng)性對(duì)照組（鹽酸嗎啡溶液，20 mg/kg），紫荊皮水提液（生藥3 000、1 500 mg/kg）組，紫荊皮石油醚萃取部位（2.250、1.125 mg/kg）組，紫荊皮醋酸乙酯萃取部位（9.450、4.725 mg/kg）組，紫荊皮正丁醇萃取部位（28.950、14.475 mg/kg）組，紫荊皮水部位（122.700、61.350 mg/kg）組。紫荊皮水提液的給藥劑量參照《中藥大辭典》成人每天使用6～15 g［1］，按人類與哺乳動(dòng)物的每千克體質(zhì)量等效劑量換算比率（10 倍）換算為小鼠的使用劑量，以此為高劑量，其數(shù)量減半為低劑量，而紫荊皮各萃取部位的用藥量則按萃取所得數(shù)量相等于生藥數(shù)量的比值進(jìn)行換算。將每只小鼠的痛閾值間隔10 min 各測(cè)量1 次，將測(cè)得的2 次平均數(shù)值為該鼠藥前正常痛閾值。給藥方式除陽(yáng)性對(duì)照組鹽酸嗎啡溶液皮下注射（sc）2 d 外，其余各組小鼠均采用灌胃（ig）給藥，灌服容積均為10 mL/kg，1 次/天，并連續(xù)用藥5 d。在末次給藥后0.5、1、1.5、2 h 分別測(cè)量實(shí)驗(yàn)小鼠痛閾值，若在給藥后放置熱板至60 s 后仍無(wú)反應(yīng)，則將實(shí)驗(yàn)小鼠取出，其痛閾值按60 s 進(jìn)行計(jì)算。

2.2.2 乙酸扭體法［8-12］120 只雄雌各半小鼠，按雄雌和體質(zhì)量用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為12 組，每組10 只，除陽(yáng)性對(duì)照組為阿司匹林溶液（500 mg/kg）外，其他組別同“2.2.1”項(xiàng)。各組小鼠均ig 給藥，灌服容量均為10 mL/kg，1 次/天，并連續(xù)用藥5 d。在末次用藥后1 h，每只小鼠均用0.2 mL 的0.6%乙酸腹腔注射（ip）。記下各組小鼠乙酸ip 后在15 min內(nèi)扭體反應(yīng)（腹部?jī)?nèi)凹、軀體扭動(dòng)、后肢與軀干伸張）的扭動(dòng)次數(shù)，并算出扭體反應(yīng)次數(shù)的抑制率。

2.3 紫荊皮不同萃取部位的抗炎作用

2.3.1 小鼠耳腫脹法［8-12］小鼠分組及灌藥方式與“2.2.2”項(xiàng)相同。于最后一次灌服1 h 后，在每只小鼠左耳廓內(nèi)外二面均勻涂布二甲苯0.05 mL 造成炎癥，右耳則不涂布作對(duì)照組。0.5 h 后，用手拉斷頸椎將小鼠全部處死，用組織剪從小鼠的耳根基線將雙耳剪下，再分別于左右耳耳尖的同一個(gè)部位，用耳腫打耳器（口徑8 mm）打下圓形耳片，用分析天平稱其質(zhì)量，以左耳片質(zhì)量減右耳片質(zhì)量的差值為耳腫脹度，并算出小鼠的耳腫脹抑制率。

2.3.2 大鼠腳跖腫脹法［8-12］按性別和體質(zhì)量要求用隨機(jī)數(shù)字表法將雄雌各半120 只SD 大鼠隨機(jī)分為12 組：正常對(duì)照組（純化水，10 mL/kg），阿司匹林溶液（350 mg/kg）陽(yáng)性對(duì)照組，紫荊皮水提液（生藥2 000、1 000 mg/kg）組，紫荊皮石油醚萃取部位（1.50、0.75 mg/kg）組，紫荊皮醋酸乙酯萃取部位（6.30、3.15 mg/kg）組，紫荊皮正丁醇萃取部位（19.30、9.65 mg/kg）組，紫荊皮水部位（81.80、40.90 mg/kg）組，每組10 只。各組大鼠均采用ig給藥，灌服用量各為10 mL/kg，1 次/天，持續(xù)5 d。在末次灌服1 h 后，再用10%新鮮蛋清生理鹽水溶液0.1 mL 于每只大鼠左后腳跖sc 造成炎癥腫脹，并分別以容積法測(cè)量各鼠致炎前及致炎后1、2、4、6 h 的腳跖體積，從而算出腳跖腫脹發(fā)生率。

2.3.3 大鼠棉球肉芽腫法［8-12］大鼠分組與“2.3.2”相同。用1%戊巴比妥鈉5 mL/kg 采用ip 麻醉大鼠后，用碘伏棉球?qū)γ恐淮笫笞笥腋构蓽喜肯?，再?5%酒精棉球脫碘后，在大鼠兩側(cè)腹股溝部各切1 cm 左右的切縫，隨后用眼科鑷夾住20 mg 的滅菌棉球（10 g/L 氨芐西林液浸泡，烘干）在切縫部埋入皮下，再縫合好切縫。術(shù)后第2 天開(kāi)始給大鼠灌服給藥，劑量與“2.3.2”項(xiàng)一樣，連灌7 d。第8天處死大鼠，然后將原切縫剪開(kāi)，取出埋著的棉球及周圍連著的結(jié)締組織，小心將脂肪組織去掉干凈，然后放在溫度設(shè)定的60 ℃鼓風(fēng)電熱干燥箱中進(jìn)行烘烤干燥，烘烤24 h 后再將其取出稱質(zhì)量。將所稱得的質(zhì)量與棉球原質(zhì)量之差即為肉芽腫質(zhì)量，以計(jì)算肉芽腫抑制效果。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

利用 SPSS 16.0 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)比較采用表示，組間之間的比較進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05 表明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 紫荊皮不同萃取部位對(duì)熱板法所致小鼠疼痛的影響

與正常對(duì)照組相較，用藥前各組疼痛閾差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；給藥后對(duì)各時(shí)間段熱板刺激所導(dǎo)致的小鼠疼痛閾，紫荊皮醋酸乙酯萃取部位和水提液高、低用量組延長(zhǎng)明顯（P<0.01），而石油醚提取部分、正丁醇萃取部分及水部位則差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與自身給藥前相較，給藥后對(duì)各時(shí)間段熱板刺激所引發(fā)的小鼠疼痛閾，紫荊皮醋酸乙酯萃取部位和水提液高、低用量組延長(zhǎng)明顯（P<0.01），而石油醚提取部分、正丁醇萃取部分及水部位變化也差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 紫荊皮不同萃取部位對(duì)小鼠熱板法痛閾值的影響（,n=10）

表1 紫荊皮不同萃取部位對(duì)小鼠熱板法痛閾值的影響（,n=10）

注：與正常對(duì)照組比較，aP<0.01；與自身給藥前痛閾值比較，bP<0.01。

3.2 紫荊皮不同萃取部位對(duì)乙酸所致小鼠扭體反應(yīng)次數(shù)的影響

與正常對(duì)照組相較，對(duì)乙酸刺激腹膜所引起的小鼠扭體次數(shù)，紫荊皮乙酸乙酯萃取部位和水提液高、低用量組減少顯著（P<0.01），而石油醚提取部分、正丁醇萃取部分及水部位則差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 紫荊皮不同萃取部位對(duì)小鼠扭體次數(shù)的抑制作用（，n=10）

表2 紫荊皮不同萃取部位對(duì)小鼠扭體次數(shù)的抑制作用（，n=10）

注：與正常對(duì)照組比較，aP<0.01。

3.3 紫荊皮不同萃取部位對(duì)二甲苯所引起小鼠耳腫的影響

與正常對(duì)照組相較，對(duì)二甲苯涂布所引起的小鼠耳廓腫脹，紫荊皮醋酸乙酯萃取部位和水提液高、低用量組均抑制顯著（P<0.01），而石油醚提取部分、正丁醇萃取部分及水部位則差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 紫荊皮不同萃取部位對(duì)二甲苯引起小鼠耳腫的抑制作用（，n=10）

表3 紫荊皮不同萃取部位對(duì)二甲苯引起小鼠耳腫的抑制作用（，n=10）

注：與正常對(duì)照組比較，aP<0.01。

3.4 紫荊皮不同萃取部位對(duì)蛋清引起大鼠腳跖腫脹的影響

與正常對(duì)照組相較，對(duì)注射蛋清后所產(chǎn)生的大鼠腳跖腫脹，紫荊皮乙酸乙酯萃取部位和水提液高、低用量組給藥后抑制顯著（P<0.01），而石油醚提取部分、正丁醇萃取部分及水部位則差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 紫荊皮不同萃取部位對(duì)蛋清引起大鼠腳跖腫脹的抑制作用（，n=10）

表4 紫荊皮不同萃取部位對(duì)蛋清引起大鼠腳跖腫脹的抑制作用（，n=10）

注：與正常對(duì)照組比較，aP<0.01。

3.5 紫荊皮不同萃取部位對(duì)大鼠棉球肉芽腫的影響

與正常對(duì)照組相較，對(duì)皮下埋棉球所產(chǎn)生的大鼠肉芽腫，紫荊皮乙酸乙酯萃取部位和水提液高、低劑量組均抑制顯著（P<0.01），而石油醚萃取部分、正丁醇萃取部分及水部位則差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 紫荊皮不同萃取部位對(duì)大鼠棉球肉芽腫的抑制作用（,n=10）

表5 紫荊皮不同萃取部位對(duì)大鼠棉球肉芽腫的抑制作用（,n=10）

注：與正常對(duì)照組比較，aP<0.01。

4 討論

炎癥是機(jī)體的一種防御反應(yīng)和保護(hù)措施，是機(jī)體組織受到細(xì)菌、病毒、紫外線等損傷因子的刺激時(shí)通過(guò)釋放組胺、前列腺素、緩激肽、5-羥色胺等炎癥介質(zhì)所引起的病理生理過(guò)程，可表現(xiàn)為紅、腫、痛、熱和功能障礙的局部反應(yīng)，也可表現(xiàn)為全身發(fā)熱、血白細(xì)胞計(jì)數(shù)變化等的全身反應(yīng)。疼痛是人體的一項(xiàng)復(fù)雜的生物心理行為，是人體組織結(jié)構(gòu)遭受破壞時(shí)出現(xiàn)的一類較為不愉悅的心理體驗(yàn)和心境感受［13］，它包含創(chuàng)傷性刺激所產(chǎn)生的痛感受和機(jī)體對(duì)創(chuàng)傷性刺激產(chǎn)生的痛反應(yīng)。炎癥和疼痛可見(jiàn)于許多急性和慢性疾病，可使患者遭受著精神和肉體上的折磨，甚至影響他們的工作和生活。對(duì)炎癥、炎性疼痛的處理，臨床上常使用解熱鎮(zhèn)痛抗炎藥如布洛芬、阿司匹林、吲哚美辛等，對(duì)于劇烈疼痛則使用阿片類止疼藥如嗎啡、哌替啶等，但解熱鎮(zhèn)痛抗炎藥久用會(huì)導(dǎo)致明顯胃腸反應(yīng)、凝血障礙、過(guò)敏、肝腎損害等不良反應(yīng)，阿片類止疼藥久用會(huì)導(dǎo)致成癮性、耐受性、呼吸抑制、惡嘔、便秘等不良反應(yīng)。我國(guó)中醫(yī)藥已有數(shù)千年的發(fā)展史，承載了中華民族數(shù)千年的保健養(yǎng)生思想和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，是中華民族的偉大創(chuàng)造和我國(guó)古代醫(yī)學(xué)的瑰寶。許多中草藥對(duì)疼痛及炎癥都有明顯和確切的緩解效果且有著較小的毒副反應(yīng)［14］，因而尋找和開(kāi)發(fā)一些毒副反應(yīng)小的中草藥來(lái)減輕疼痛和治療炎癥是一條可行且有效的途徑。

小鼠熱板試驗(yàn)是一項(xiàng)物理致痛法，利用特定的高溫（55 ℃）刺激小鼠足爪以產(chǎn)生舔足等疼痛反應(yīng)，常以小鼠的疼痛閾值為測(cè)痛指標(biāo)［12］，并且用痛閾值大小來(lái)評(píng)價(jià)藥品的鎮(zhèn)痛能力。有高位中樞參與熱板反應(yīng)［15］，本試驗(yàn)中紫荊皮乙酸乙酯萃取部位可顯著延長(zhǎng)因熱板激發(fā)而產(chǎn)生的小鼠疼痛閾，這說(shuō)明了紫荊皮乙酸乙酯萃取部位對(duì)高溫等物理刺激而產(chǎn)生的疼痛具有顯著鎮(zhèn)痛效果。小鼠乙酸扭體試驗(yàn)是一項(xiàng)化學(xué)刺激致痛法，是利用腹腔內(nèi)注入乙酸后刺激小鼠腹膜的臟、壁層所產(chǎn)生的，以腹部?jī)?nèi)凹、軀體擰傾、軀干與后肢伸張等扭體反應(yīng)為主要特征的炎癥性疼痛反應(yīng)，有利于弱止疼藥物的篩選，同時(shí)也是一項(xiàng)敏感性高、應(yīng)用簡(jiǎn)單、重復(fù)性好的方法［15］。在本試驗(yàn)中，紫荊皮乙酸乙酯萃取部位可明顯降低因乙酸刺激小鼠腹膜所產(chǎn)生的扭體次數(shù)。

抗炎試驗(yàn)中，使用二甲苯均勻涂布小鼠耳廓內(nèi)外二面引起小鼠耳廓腫脹，和用腳跖皮下注射蛋清引起的大鼠腳跖腫脹都是一類以液體滲出及組織水腫為主的急性炎癥反應(yīng)，而使用皮下埋棉球引起的大鼠肉芽腫則是一類以結(jié)締組織增生為主的慢性炎癥反應(yīng)［12］。本試驗(yàn)中紫荊皮乙酸乙酯萃取部位明顯抑制二甲苯刺激所引起的小鼠耳廓腫脹和蛋清刺激所引起的大鼠腳跖腫脹，并明顯抑制棉球所導(dǎo)致的大鼠肉芽腫增殖，結(jié)果證明紫荊皮乙酸乙酯萃取部位對(duì)急慢性炎癥都有明顯的抑制作用。

多數(shù)中草藥都含黃酮類成分，有實(shí)驗(yàn)表明蘆丁等黃酮類成分對(duì)疼痛有顯著鎮(zhèn)痛效應(yīng)，其作用的產(chǎn)生主要與鈣拮抗密切相關(guān)［16］；槲皮素等黃酮類化合物，可以拮抗NO 合酶等炎癥酶以及炎癥細(xì)胞因子（TNF-α、IL-1、IL-6、IL-10）而起到有效的抗炎效果［17］。紫荊皮中含有較豐富的黃酮類化合物，李君玲［3］報(bào)道采用超聲提取法獲得紫荊皮總黃酮，得總黃酮6.62 mg/g，謝龍?jiān)龋?］報(bào)道應(yīng)用正交試驗(yàn)法獲得紫荊皮總黃酮，得總黃酮6.56 mg/g；穆麗華等［2］對(duì)紫荊皮分別用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、95%乙醇和甲醇進(jìn)行萃取，對(duì)乙酸乙酯萃取部位進(jìn)行成分分析，從中分離出槲皮素、3-甲氧基槲皮素、（2R）-柚皮素、3'5,5',7-四羥基雙氫黃酮、（+）-紫杉葉素等多種黃酮類物質(zhì)，因而紫荊皮醋酸乙酯萃取部位抑制炎癥及減輕疼痛也可能與它含有黃酮類物質(zhì)有關(guān)。

綜上，本研究采用了2 種疼痛模型和3 種炎癥模型，對(duì)紫荊皮鎮(zhèn)痛消炎活性部位進(jìn)行了篩選。試驗(yàn)研究結(jié)果表明，紫荊皮乙酸乙酯萃取部位對(duì)熱板法和乙酸扭體法所產(chǎn)生的疼痛都有顯著鎮(zhèn)痛效果，表明了紫荊皮乙酸乙酯萃取部位是其止疼的主要活性部位；在抗炎方面，紫荊皮乙酸乙酯萃取部位對(duì)二甲苯導(dǎo)致的小鼠耳腫脹、蛋清導(dǎo)致的大鼠腳跖腫脹急性炎癥，以及對(duì)棉球引起的大鼠肉芽腫慢性炎癥等都有很好的緩解效果，表明了紫荊皮乙酸乙酯萃取部位同時(shí)亦是其消炎的主要活性部位。試驗(yàn)結(jié)果也為紫荊皮在臨床上的防病治病提供了藥理學(xué)基礎(chǔ)，為進(jìn)一步科研開(kāi)展提供了必要的試驗(yàn)依據(jù)。但到底是紫荊皮的哪種或哪幾種活性成分發(fā)揮鎮(zhèn)痛抗炎藥效，以及怎樣發(fā)揮鎮(zhèn)痛抗炎的，還有待于后續(xù)進(jìn)一步的研究。