一種檢測(cè)飼料中聚醚類(lèi)抗生素的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法

陳彤 鐘名琴 邱永為 何玉榆 黃婷

摘 ?要：本研究基于液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜建立了一種高精密度檢測(cè)飼料中聚醚類(lèi)抗生素的方法，并對(duì)所建立的方法進(jìn)行了方法學(xué)的考察與驗(yàn)證，參考已有的標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)的相關(guān)處理步驟進(jìn)行優(yōu)化，采用液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行分析。馬杜霉素、莫能菌素、鹽霉素和甲基鹽霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)相關(guān)系數(shù)分別為0.999 79、0.999 71、0.998 52、0.999 38，方法檢出限分別為3.58 μg/kg、2.47 μg/kg、3.32 μg/kg、2.82 μg/kg，回收率范圍為90.4％～101.5％、89.2％～102.0％、90.5％～101.0％、88.3％～103.0％，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.2％～1.3％、1.4％～2.2％、1.5％～3.2％、1.9％～3.8％。所得結(jié)果表明，該方法具有檢出限低、回收率較好、精準(zhǔn)度高、重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)，可以為檢測(cè)飼料中聚醚類(lèi)抗生素提供有力的方法支撐。

關(guān)鍵詞：聚醚類(lèi)抗生素；液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜；精密度；回收率

中圖分類(lèi)號(hào)：S859.84 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A ? ? ? 文章編號(hào)：1001-0769（2023）03-0070-04

聚醚類(lèi)抗生素（polyether antibiotics，PEs）是20世紀(jì)70年代發(fā)展起來(lái)的一類(lèi)具有離子載體性質(zhì)的抗生素，由鏈霉菌等微生物發(fā)酵產(chǎn)生，包括莫能菌素、馬杜霉素、鹽霉素和甲基鹽霉素等，是一類(lèi)被廣泛應(yīng)用于畜禽飼養(yǎng)行業(yè)中的廣譜抗球蟲(chóng)藥和促生長(zhǎng)劑[1-3]。從化學(xué)結(jié)構(gòu)上看，此類(lèi)藥物分子含有若干環(huán)狀醚鍵，分子一側(cè)帶有羧基，故而容易與Na+、K+等離子結(jié)合形成多種金屬鹽，不溶于水，易溶于低級(jí)醇、丙酮、氯仿、苯、乙醚、石油醚、乙酸乙酯、四氯化碳及正己烷等有機(jī)溶劑，且在堿性或中性條件下穩(wěn)定存在。它們能與球蟲(chóng)細(xì)胞中的陽(yáng)離子緊密結(jié)合，改變細(xì)胞膜上脂質(zhì)屏障的滲透性，增加向球蟲(chóng)細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸離子，為了平衡滲透壓，大量水分進(jìn)入球蟲(chóng)細(xì)胞內(nèi)，導(dǎo)致球蟲(chóng)腫脹而死亡，因此也被稱(chēng)為離子載體類(lèi)抗球蟲(chóng)藥[4]。其對(duì)球蟲(chóng)子孢子第一代、第二代裂殖子有抑殺作用，同時(shí)又能有效促進(jìn)動(dòng)物的生長(zhǎng)，提高畜禽產(chǎn)品的飼料利用率，提高養(yǎng)殖場(chǎng)經(jīng)濟(jì)效益，故被廣泛添加于飼料中。但是，聚醚類(lèi)抗生素本身在毒理學(xué)上屬于高毒或劇毒物質(zhì)，具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，因此藥物的安全范圍非常窄。過(guò)量使用聚醚類(lèi)抗生素容易導(dǎo)致其在動(dòng)物產(chǎn)品中殘留，并通過(guò)食物鏈在人體中蓄積，會(huì)嚴(yán)重危害人體健康。因此，研究聚醚類(lèi)藥物在飼料中殘留量的檢測(cè)技術(shù)，對(duì)保障畜禽產(chǎn)品質(zhì)量安全有著重要的意義[5-6]。

如今，聚醚類(lèi)抗生素的殘留分析方法主要包括微生物檢測(cè)法、免疫學(xué)法、分光光度法、高效液相色譜法、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等[7-9]。其中，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法將色譜的高分離能力與質(zhì)譜的高靈敏度和高選擇性?xún)?yōu)點(diǎn)相結(jié)合，不但對(duì)樣本的前處理要求低，而且可以同時(shí)測(cè)定多種藥物殘留；該方法抗干擾能力強(qiáng)，靈敏度高，既可以完成對(duì)藥物的定性，又可以達(dá)到定量的效果，減少了測(cè)定的時(shí)間，提高了檢測(cè)質(zhì)量，是一種非常優(yōu)秀的測(cè)定多種聚醚類(lèi)抗生素的方法。

本研究以農(nóng)業(yè)部1862號(hào)公告-4-2012《飼料中5種聚醚類(lèi)藥物的測(cè)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》為基礎(chǔ)，在保證檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠的前提下，優(yōu)化了前處理的操作，并使用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)飼料中的馬杜霉素、莫能菌素、鹽霉素以及甲基鹽霉素進(jìn)行定性定量檢測(cè)，提高了檢測(cè)效率，為聚醚類(lèi)藥物的檢測(cè)提供有力的技術(shù)支持[10]。

1 ?材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

安捷倫1290液相色譜儀，AB Science質(zhì)譜儀，氮吹儀，漩渦混合儀，電子天平，冷凍離心機(jī)，超純水儀，超聲波清洗機(jī)，硅膠固相萃取柱（500 mg/3 mL）。

1.1.2 藥品與試劑

乙腈（色譜純），甲醇（色譜純），正己烷，乙醚，二氯甲烷，甲酸（色譜純）。

1.2 樣本制備

用四分法稱(chēng)取適量飼料，經(jīng)粉碎過(guò)40目孔篩，混勻后裝入磨口瓶中備用。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制

準(zhǔn)確稱(chēng)取馬杜霉素、莫能菌素、鹽霉素和甲基鹽霉素的標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇分別配成1 000 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，－20 ℃保存?zhèn)溆?，有效?2個(gè)月；分別移取適量的4種1 000 μg/mL的聚醚類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于同一容量瓶中，用甲醇稀釋成100 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)液，－20 ℃保存?zhèn)溆?，有效?個(gè)月；再移取100 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)液稀釋為 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?10 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.4 樣本前處理

準(zhǔn)確稱(chēng)取試樣2.00 g（精確到0.01 g）于50 mL離心管中，加5 mL乙腈，渦旋10 min，超聲提取20 min，9 000 r/min離心5 min，取上清液轉(zhuǎn)移至另一個(gè)50 mL離心管。殘?jiān)? mL乙腈重復(fù)提取一次，合并兩次上清液，取全部上清液于15 mL離心管中，40 ℃氮?dú)獯蹈?，加? mL正己烷溶解殘?jiān)?，渦旋45 s，備用。

取硅膠固相萃取柱，加5 mL正已烷預(yù)洗，將備用液過(guò)柱，加乙醚-正己烷（體積比1∶1）10 mL，洗滌，抽干，加二氯甲烷-甲醇（體積比9∶1）5 mL洗脫，收集洗脫液，50 ℃下氮?dú)獯蹈?，用乙腈（?.1％甲酸）1.0 mL溶解殘?jiān)?，渦旋45 s后過(guò)0.22 μm濾膜，用于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（liquid chromatograph mass spectrometer / mass spectrometer，LC-MS/MS）分析。

2 ?結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

按照農(nóng)業(yè)部1862號(hào)公告-4-2012標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置儀器參數(shù)，配制一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣本溶液（10.0 μg/kg、20.0 μg/kg、40.0 μg/kg、100 μg/kg、400 μg/kg），待儀器參數(shù)穩(wěn)定后，對(duì)該系列標(biāo)準(zhǔn)樣本溶液進(jìn)行測(cè)定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，馬杜霉素、莫能菌素、鹽霉素及甲基鹽霉素相關(guān)系數(shù)分別為0.999 79、0.999 71、0.998 52、0.999 38，具體見(jiàn)表1。

2.2 方法檢出限確定

以空白飼料樣本為基質(zhì)，做7個(gè)平行添加試驗(yàn)，聚醚類(lèi)藥物（馬杜霉素、莫能菌素、鹽霉素、甲基鹽霉素）的陽(yáng)性添加濃度均為10.0 μg/kg，按照1.4方法進(jìn)行前處理，然后上機(jī)測(cè)定，測(cè)得馬杜霉素、莫能菌素、鹽霉素、甲基鹽霉素的方法檢出限（method detection limit，MDL）分別為3.58 μg/kg、 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?2.47 μg/kg、3.32 μg/kg、2.82 μg/kg，具體見(jiàn)表1。計(jì)算公式如下：

方法檢出限（μg/kg）＝k·Sb·C/X

式中k取3；Sb為平行測(cè)試樣含量的標(biāo)準(zhǔn)偏差；C為加標(biāo)濃度（μg/kg）；X為平行測(cè)試樣含量的平均值。

2.3 回收率及精密度確定

以空白飼料樣本為基質(zhì)，向飼料樣本中添加聚醚類(lèi)藥物（馬杜霉素、莫能菌素、鹽霉素、甲基鹽霉素）濃度水平分別為10.0 μg/kg、20.0 μg/kg、100 μg/kg進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)。按照方法進(jìn)行前處理，上機(jī)測(cè)試，結(jié)果如表2和表3所示。

根據(jù)表2與表3中相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差和回收率結(jié)果可發(fā)現(xiàn)，該方法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差較低，且回收率較好，馬杜霉素、莫能菌素、鹽霉素、甲基鹽霉素的回收率范圍分別為90.4％～101.5％、89.2％～102.0％、90.5％～101.0％、88.3％～103.0％，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.2％～1.3％、1.4％～2.2％、1.5％～3.2％、1.9％～3.8％。該方法的檢出限較低、重復(fù)性較好，并且能保持較為理想的回收率，可用于馬杜霉素、莫能菌素、鹽霉素、甲基鹽霉素的定性、定量檢測(cè)。

3 ?結(jié)論

本研究旨在建立一種飼料中聚醚類(lèi)抗生素的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的簡(jiǎn)便測(cè)定方法，為相關(guān)行業(yè)檢測(cè)工作提供該類(lèi)藥物的檢測(cè)方法及技術(shù)支持。結(jié)果表明，此方法前處理簡(jiǎn)單，精密度高而且穩(wěn)定性好，較大地提高了實(shí)驗(yàn)整體的效率，適用于飼料中馬杜霉素、莫能菌素、鹽霉素、甲基鹽霉素殘留量的定性、定量檢測(cè)。

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