仔豬副豬嗜血桿菌的分離鑒定及耐藥性檢測(cè)

仁增旺姆

摘 ?要：為了了解海南藏族自治州共和縣規(guī)?；i場(chǎng)中仔豬副豬嗜血桿菌分離株的流行情況及對(duì)常用抗菌藥的耐藥情況。本試驗(yàn)于2022—2023年采集海南藏族自治州共和縣規(guī)模化豬場(chǎng)中患疑似副豬嗜血桿菌病的仔豬鼻拭子、關(guān)節(jié)液、胸腔積液、肺臟等病料，共計(jì)283份。采用細(xì)菌分離鑒定、PCR方法對(duì)采集的病料進(jìn)行副豬嗜血桿菌分離鑒定，采用人工感染小鼠試驗(yàn)驗(yàn)證分離株的致病性，采用紙片擴(kuò)散法（Kirby-Bauer，簡(jiǎn)稱K-B法）檢測(cè)致病性副豬嗜血桿菌分離株對(duì)臨床中常用抗菌藥的耐藥性。結(jié)果顯示：從采集的283份病料中分離到128株副豬嗜血桿菌，通過(guò)致病試驗(yàn)顯示，91株副豬嗜血桿菌能引起小鼠不同程度發(fā)病與死亡，為致病性菌株；分離的91株致病性副豬嗜血桿菌對(duì)磺胺間甲氧嘧啶、阿莫西林、氨芐西林等6種藥物的耐藥率為85.7％以上，對(duì)其他藥物的耐藥率為3.3％～25.3％，本研究為該地區(qū)仔豬副豬嗜血桿菌合理用藥及防控提供參考。

關(guān)鍵詞：仔豬；副豬嗜血桿菌；致病性；藥敏試驗(yàn)

中圖分類號(hào)：S855.1+2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-0769（2023）03-0053-03

仔豬副豬嗜血桿菌病是由不同血清型的副豬嗜血桿菌引起的豬的一種傳染性呼吸道疾病，也是養(yǎng)豬生產(chǎn)過(guò)程中常見(jiàn)的細(xì)菌性傳染病之一。副豬嗜血桿菌可以通過(guò)不同的途徑感染不同生產(chǎn)階段的豬，仔豬最易感，感染率和死亡率均較高，尤其對(duì)4～8周齡的仔豬危害較厲害，仔豬感染后臨床上的常見(jiàn)癥狀為纖維素性胸膜炎、呼吸困難和關(guān)節(jié)炎等，會(huì)給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1-3]。相關(guān)研究表明，在養(yǎng)豬生產(chǎn)過(guò)程中，仔豬的副豬嗜血桿菌病經(jīng)常與豬圓環(huán)病毒病、豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征等免疫抑制性病毒性疾病混合發(fā)生，加快發(fā)病動(dòng)物的死亡，給臨床診斷帶來(lái)一定的困難[4-5]。

仔豬副豬嗜血桿菌病在世界不同國(guó)家的豬場(chǎng)廣泛流行，已經(jīng)成為多個(gè)國(guó)家和地區(qū)普遍流行的豬病之一，不同的國(guó)家與地區(qū)流行的仔豬副豬嗜血桿菌血清型具有差異性[6-7]。在臨床上，仔豬副豬嗜血桿菌具有多種血清型，在疫苗制備上存在一定的困難，防控仔豬副豬嗜血桿菌病主要通過(guò)抗生素，隨著抗菌藥的廣泛應(yīng)用，已經(jīng)產(chǎn)生嚴(yán)重的耐藥性，給仔豬副豬嗜血桿菌病的臨床治療帶來(lái)了一定的困難，給人類的健康也帶來(lái)嚴(yán)重的危害[6]。

本試驗(yàn)于2022—2023年采集海南藏族自治州共和縣規(guī)?；i場(chǎng)中疑似患副豬嗜血桿菌病的仔豬鼻拭子、關(guān)節(jié)液、胸腔積液、肺臟等病料組織共計(jì)283份，對(duì)仔豬副豬嗜血桿菌進(jìn)行分離鑒定，并分析其耐藥性，以期對(duì)海南藏族自治州共和縣仔豬副豬嗜血桿菌病的綜合防控提供參考。

1 ?材料與方法

1.1 菌株來(lái)源

2022—2023年，從青海省海南藏族自治州共和縣規(guī)?；i場(chǎng)疑似患副豬嗜血桿菌病的仔豬上，采集鼻拭子、關(guān)節(jié)液、胸腔積液、肺臟等病料樣本，共計(jì)283份。

1.2 細(xì)菌分離與培養(yǎng)

在無(wú)菌的條件下，將采集的各種樣本接種于巧克力培養(yǎng)基，挑取巧克力培養(yǎng)基上單個(gè)的典型菌落接種于胰酪大豆胨 （tryptone soy broth，TSB）液體培養(yǎng)基中進(jìn)行純化培養(yǎng)， ?37 ℃下震蕩培養(yǎng)12～18 h，取菌液進(jìn)行革蘭染色鏡檢和生化特性鑒定。

1.3 細(xì)菌PCR鑒定

參照王同兆等[8]推薦的副豬嗜血桿菌鑒定引物，引物序列如下：F1：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAGG-3'；F2：5'- TACGGCTACCTTGTTTTG-3'，由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。取純化培養(yǎng)的副豬嗜血桿菌分離株，用水煮沸提取分離株的基因組DNA，以提取的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR鑒定。

1.4 致病性試驗(yàn)

參照王麗榮等[9]的方法，將臨床上分離的副豬嗜血桿菌分離株接種于TSB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，調(diào)整菌液濃度至106 CFU/mL。攻毒組每株分離株腹腔注射2只昆明系小鼠，劑量為0.25 mL；對(duì)照組昆明系小鼠腹腔注射等量的無(wú)菌生理鹽水。試驗(yàn)期為6 d，試驗(yàn)期間觀察小鼠的發(fā)病情況，對(duì)死亡的小鼠進(jìn)行細(xì)菌學(xué)鑒定。

1.5 藥敏試驗(yàn)

紙片擴(kuò)散法（Kirby-Bauer，簡(jiǎn)稱K-B法）參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）的要求對(duì)副豬嗜血桿菌分離株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)和結(jié)果判定。

2 ?結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)

疑似副豬嗜血桿菌的分離株在巧克力培養(yǎng)基上生長(zhǎng)出圓形、隆起、整齊、表面光滑的灰白半透明的菌落；利用革蘭染色鏡檢觀察其形態(tài)學(xué)，發(fā)現(xiàn)分離株呈桿狀、短桿狀等多形性形態(tài)的革蘭陰性菌，與報(bào)道的副豬嗜血桿菌培養(yǎng)特性及形態(tài)學(xué)基本上一致。生化特性鑒定結(jié)果顯示，分離株為副豬嗜血桿菌。

2.2 細(xì)菌PCR鑒定

用PCR法對(duì)疑似副豬嗜血桿菌的分離株進(jìn)一步鑒定。結(jié)果顯示，臨床上分離到的 ? ? 128株疑似副豬嗜血桿菌的分離株均擴(kuò)增出大約為320 bp的目的條帶（圖1）。對(duì)分離株的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，同源性比對(duì)顯示，128株分離株均為副豬嗜血桿菌，分離率為45.2％（128/283）。

2.3 致病性試驗(yàn)

攻毒后2～4 d，攻毒組小鼠出現(xiàn)了精神沉郁、采食量減少、呼吸困難等不同的臨床癥狀，個(gè)別小鼠死亡。死亡小鼠剖檢可見(jiàn)肺臟、肝臟、腎臟、脾臟等臟器有不同程度的出血，并可分離得到副豬嗜血桿菌；對(duì)照組小鼠無(wú)臨床癥狀健康存活。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，91株副豬嗜血桿菌能引起小鼠發(fā)病和死亡，為致病性副豬嗜血桿菌。

2.4 耐藥性試驗(yàn)

用K-B法檢測(cè)致病性副豬嗜血桿菌分離株對(duì)臨床常用抗菌藥耐藥性分析，結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1可知，分離的91株致病性副豬嗜血桿菌對(duì)臨床中常用的藥物具有不同的耐藥性，其中對(duì)磺胺間甲氧嘧啶、阿莫西林、氨芐西林、多西環(huán)素等、恩諾沙星、環(huán)丙沙星6種藥物的耐藥率介于85.7％～98.9％，對(duì)頭孢噻呋、頭孢噻肟、頭孢曲松、替米考星、氟苯尼考、多黏菌素、大觀霉素、林可霉素8種藥物的耐藥率為3.3％～25.3％。

3 ?討論

副豬嗜血桿菌為臨床中常見(jiàn)的條件性致病菌之一，有多種血清型，廣泛存在于自然的飼養(yǎng)環(huán)境（空氣、糞便、污水）中，主要定植于豬的上呼吸道，可以通過(guò)多種途徑（直接接觸、空氣、飼料和飲水等）在不同豬之間傳播，當(dāng)豬的免疫力下降時(shí)，容易引發(fā)副豬嗜血桿菌病[1]。副豬嗜血桿菌病為養(yǎng)豬生產(chǎn)中常見(jiàn)的傳染性疾病之一，具有發(fā)病急、死亡率較高等特點(diǎn)，嚴(yán)重危害我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展[10]。近幾年，關(guān)于仔豬副豬嗜血桿菌病的報(bào)道越來(lái)越多。本試驗(yàn)從采集的283份病料樣本中分離到91株致病性副豬嗜血桿菌，說(shuō)明副豬嗜血桿菌在該地區(qū)豬場(chǎng)中流行嚴(yán)重，應(yīng)注意副豬嗜血桿菌病的疫苗接種與綜合防控。藥敏試驗(yàn)顯示，分離的91株致病性副豬嗜血桿菌對(duì)磺胺間甲氧嘧啶、阿莫西林、氨芐西林等6種藥物的耐藥率為85.7％～98.9％，對(duì)其他被檢藥物耐藥率為3.3％～25.3％。在臨床上，在防治副豬嗜血桿菌病時(shí)應(yīng)進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，選用敏感的藥物，并交替使用，同時(shí)應(yīng)配合環(huán)境的消毒，提高其治療效果。

參考文獻(xiàn)

[1] 肖敏，劉建，盧昌，等．副豬嗜血桿菌的分離鑒定與滅活疫苗的初步研制[J]．動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2022，43（8）：35-40.

[2] 趙自亮，田宇森，莊鴻琨，等．副豬嗜血桿菌與PCV3混合感染的實(shí)驗(yàn)室診斷及分析[J]．中國(guó)動(dòng)物檢疫，2022，39（12）：18-25.

[3] 范春梅．湖南省部分家庭豬場(chǎng)呼吸道疾病流行病學(xué)調(diào)查分析[J]．中國(guó)豬業(yè)，2020，15（5）：80-83.

[4] 杜炎斌，袁麗英，東笑，等．英德市某規(guī)模化豬場(chǎng)副豬嗜血桿菌分離鑒定及藥敏試驗(yàn)[J]．動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2022，43（6）：32-36.

[5] 馮建遠(yuǎn)，吳廷瑛，郭旋，等．廣西規(guī)?；i場(chǎng)呼吸道病原菌調(diào)查及耐藥性分析[J]．中國(guó)豬業(yè)，2020，15（2）：66-69.

[6] 陳超群，陳佳莉，周萱儀，等．β-內(nèi)酰胺類藥物對(duì)副豬嗜血桿菌流行病學(xué)臨界值的建立及耐藥性的測(cè)定[J]．畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2021，52（11）：3234-3245.

[7] 王慶云．安陽(yáng)地區(qū)副豬嗜血桿菌分離株的耐藥性與耐藥基因檢測(cè)[J]．動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2021，42（4）：131-134.

[8] 王同兆，張付賢，雷連成．1株副豬嗜血桿菌血清4型的分離鑒定及耐藥性分析[J]．中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2022，49（3）：1096-1105.

[9] 王麗榮，董永軍，張守平，等．副豬嗜血桿菌試驗(yàn)感染KM小鼠及在其體內(nèi)的分布[J]．中國(guó)獸醫(yī)雜志，2020，56（11）：43-46，122.

[10] 解金秋，馬立孔，孫福方．某規(guī)?；i場(chǎng)副豬嗜血桿菌分離鑒定及藥敏試驗(yàn)[J]．中國(guó)豬業(yè)，2023，18（1）：76-78.