獸用疫苗佐劑的研究進(jìn)展

錢忠輝 張華弟 葛宇燕 張子悅 朱永軍

摘 ?要：獸用疫苗免疫佐劑可以輔助獸用疫苗進(jìn)入動(dòng)物機(jī)體，增強(qiáng)疫苗的免疫效力，維持疫苗的穩(wěn)定性，幫助疫苗更加有效地預(yù)防、控制動(dòng)物傳染病，減少損失，保障安全的生態(tài)環(huán)境。用作獸用疫苗免疫佐劑的物質(zhì)越來越多，有水性疫苗佐劑和油性疫苗佐劑等，各種佐劑的有效成分和作用方式各不相同。本文就獸用疫苗佐劑的特點(diǎn)做了概述，以期為疫苗研發(fā)過程中佐劑的篩選提供參考。

關(guān)鍵詞：獸用疫苗；疫苗佐劑；免疫應(yīng)答

中圖分類號(hào)：S859.79+9.9 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A ? ? ? 文章編號(hào)：1001-0769（2023）03-0074-05

我國動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)正朝著集約化規(guī)?；较虬l(fā)展，但集約化發(fā)展的同時(shí)也導(dǎo)致動(dòng)物傳染病更易發(fā)生，在保障生物安全的前提下，需要研制具有安全性、有效性的獸用疫苗，用于防治畜禽疫病的發(fā)生流行，提高養(yǎng)殖效益。在疫苗制備過程中，選擇合適的免疫佐劑非常重要。免疫佐劑簡稱佐劑，是一種自身不具備抗原特性的非特異性免疫增強(qiáng)劑，協(xié)同抗原預(yù)先或一起注入動(dòng)物機(jī)體，可充分發(fā)揮抗原的免疫原性，進(jìn)一步提高機(jī)體的免疫應(yīng)答，或引起免疫反應(yīng)類型發(fā)生改變的一類輔助性物質(zhì)。因此，選擇正確的佐劑，能有效減少抗原的使用量，降低疫苗的生產(chǎn)成本，提升疫苗的有效性。

佐劑這個(gè)詞源自拉丁文。1925年，法國獸醫(yī)加斯頓·拉蒙（Gaston Ramon）經(jīng)過反復(fù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)疫苗注射部位出現(xiàn)炎癥時(shí)，動(dòng)物機(jī)體會(huì)產(chǎn)生更好的免疫反應(yīng)。隨后他觀察到，在疫苗中添加木薯粉、卵磷脂、瓊脂、淀粉油、皂素等物質(zhì)，可提高免疫效果，首次用“Adjuvant”來描述這種物質(zhì)。開發(fā)安全有效的疫苗佐劑是一個(gè)漫長的過程，佐劑成分也經(jīng)歷了從天然成分到人工合成化合物的轉(zhuǎn)變過程。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，新型疫苗的種類越來越多，佐劑發(fā)揮的作用機(jī)理也各不相同，新近發(fā)現(xiàn)的新型獸用疫苗佐劑的作用機(jī)制不斷被提出。絕對(duì)安全、沒有任何副作用的疫苗佐劑不存在。優(yōu)勢佐劑的篩選需要考量佐劑自身的優(yōu)勢與劣勢，結(jié)合主體抗原的特點(diǎn)，盡可能地在免疫刺激作用最大化和毒副作用最低化之間取得一個(gè)平衡。疫苗佐劑之間沒有明顯的分類界限，無法進(jìn)行系統(tǒng)而明確的劃分，根據(jù)疫苗佐劑的成分性狀不同，佐劑可分為油性佐劑和水性佐劑。

1 ?水性佐劑

1.1 礦物質(zhì)佐劑

礦物質(zhì)佐劑屬于疫苗的傳統(tǒng)佐劑之一，其中常見的鋁鹽佐劑是一種乳白色的凍膠狀半固體，主要有氫氧化鋁[Al（OH）3]、磷酸鋁、硫酸鋁、銨明礬及鉀明礬等，以Al（OH）3佐劑最為常用，是目前唯一被國際開發(fā)協(xié)會(huì)（International Development Association，IDA）批準(zhǔn)的既可應(yīng)用于人用疫苗又可應(yīng)用于獸用疫苗的佐劑。氫氧化鋁成本較為低廉，使用操作方便，通針性強(qiáng)，被廣泛應(yīng)用于獸用疫苗，特別是以菌苗為主的以抗體為保護(hù)性免疫的獸用疫苗。Glenny等在1926年首次發(fā)現(xiàn)，在獸用白喉外毒素疫苗中以鋁鹽作為佐劑，可有效增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體對(duì)抗原的特異性免疫應(yīng)答。然而，鋁鹽佐劑也存在一些局限性，包括引起局部反應(yīng)，導(dǎo)致IgE抗體反應(yīng)增強(qiáng)；對(duì)某些抗原無效以及無法增強(qiáng)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，如小分子蛋白，分子量小、免疫原性低，與氫氧化鋁共同使用時(shí)，很難產(chǎn)生足夠的抗體應(yīng)答。

磷酸鈣也是一種常見的礦物質(zhì)佐劑，是構(gòu)成機(jī)體的天然組成成分。最初由巴斯德研究所以輕基磷灰石[Ca10（PO4）6（OH）2]的形式開發(fā)，具有良好的組織相容性、生物降解性和可吸收性，無毒且廉價(jià)易得，目前已運(yùn)用在對(duì)抗各種類毒素和病毒的疫苗生產(chǎn)中。有研究表明，與鋁佐劑相比，磷酸鈣對(duì)動(dòng)物局部組織的刺激較小，lgE抗體產(chǎn)生減少。

1.2 蜂膠佐劑

蜂膠是一種天然的免疫增強(qiáng)劑，富含多種生物活性成分，主要含有各種維生素、酸類化合物、醇類化合物等，同時(shí)還含有鈣、磷、鎂、鐵、錳等微量元素。蜂膠具有抑菌、消炎、促進(jìn)動(dòng)物局部組織再生等作用。蜂膠主要含有蜜蜂從植物中采集的花粉、樹脂以及蜂蠟等，具有廣譜抗病毒、抗細(xì)菌和抗霉菌等多種藥理學(xué)活性作用，并具有免疫調(diào)節(jié)和提高機(jī)體免疫力的功能。給動(dòng)物接種含有蜂膠佐劑的疫苗，可激活免疫活性細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞的吞噬能力和自然殺傷細(xì)胞的殺傷作用，調(diào)整細(xì)胞免疫的發(fā)生。作為免疫輔助劑，蜂膠能顯著刺激免疫球蛋白的產(chǎn)生，使血清總蛋白的含量增高，更好地發(fā)揮體液免疫。使用水性蜂膠作為佐劑的疫苗，可使動(dòng)物機(jī)體以更快的速度產(chǎn)生抗體，且保護(hù)率高，安全性好，無毒副作用。

1.3 中藥佐劑

有研究發(fā)現(xiàn)，迄今為止有200余種具有免疫增強(qiáng)作用的動(dòng)植物中藥佐劑。多糖是從中草藥中提取的一種大分子物質(zhì)，是植物細(xì)胞壁的重要組分，具有天然、無毒、無副作用的突出特點(diǎn)，對(duì)動(dòng)物的體液免疫系統(tǒng)和細(xì)胞免疫系統(tǒng)可進(jìn)行全方位的調(diào)節(jié)，因而可以用作低毒疫苗的免疫增強(qiáng)劑。在一定條件下，天然成分的多糖與抗原物質(zhì)混合后會(huì)形成一種復(fù)合劑，通過刺激動(dòng)物免疫器官自身細(xì)胞的生長發(fā)育和分裂增殖，激活巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞等，達(dá)到增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體特異性免疫反應(yīng)的效果，導(dǎo)致免疫器官重量成指數(shù)級(jí)增加，從而達(dá)到增強(qiáng)免疫反應(yīng)的作用，穩(wěn)定地發(fā)揮免疫增強(qiáng)劑的功能。多糖雖然安全、穩(wěn)定，但因產(chǎn)地不同，采收時(shí)間差異較大，有效成分含量不確定；制作工藝尚不成熟，質(zhì)量控制不確定，導(dǎo)致效果不穩(wěn)定；生產(chǎn)過程煩瑣，價(jià)格較高。這些因素制約了中藥多糖佐劑的應(yīng)用。

存在于多種植物中的皂苷類皂素及其三萜衍生物是另一種應(yīng)用較為廣泛的中藥佐劑。作為天然產(chǎn)物，它們具有廣泛的生物活性，進(jìn)入動(dòng)物機(jī)體后，可激活Ｔ細(xì)胞和抗原遞呈細(xì)胞，免疫誘導(dǎo)各種免疫相關(guān)細(xì)胞的分化成熟，如促炎性1型輔助性T細(xì)胞（Helper T cells 1，Th1）/Th2免疫或抗炎性Th2，中性粒細(xì)胞的富集，以及巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）的分化成熟。皂苷作為疫苗佐劑，通過免疫調(diào)節(jié)和免疫刺激作用，能顯著增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體的免疫應(yīng)答，延長疫苗的免疫保護(hù)周期，減少疫苗接種次數(shù)。皂苷還能刺激動(dòng)物機(jī)體提高干擾素、腫瘤壞死因子等細(xì)胞因子的分泌水平，進(jìn)一步發(fā)揮疫苗的有效性。但是，此類佐劑也存在明顯的細(xì)胞毒性、神經(jīng)毒性、溶血性，會(huì)改變腸道通透性，損害肝臟和腎臟。未來可以通過結(jié)構(gòu)修飾，使皂苷達(dá)到減毒增效的目的，通過開發(fā)新的劑型，解決其溶血性和細(xì)胞毒性等問題，使其在疫苗應(yīng)用中更加廣泛。

1.4 細(xì)胞因子佐劑

細(xì)胞因子是由免疫原或其他誘導(dǎo)劑刺激動(dòng)物機(jī)體的多種細(xì)胞而產(chǎn)生的，是一種低分子量的高活性多功能可溶性蛋白，通過與細(xì)胞表面受體相互作用，發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、修復(fù)損傷組織等多種功能，并可誘導(dǎo)免疫細(xì)胞發(fā)揮功能，明顯增強(qiáng)固有免疫和適應(yīng)性免疫。細(xì)胞因子作為疫苗佐劑可分為白細(xì)胞介素、干擾素、腫瘤壞死因子超家族、集落刺激因子、趨化因子、生長因子等。

最早用作疫苗佐劑的細(xì)胞因子是白介素-1（interleukin 1，IL-1）。IL-1是淋巴細(xì)胞活化因子，由刺激物誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞和其他多種組織細(xì)胞活化后分泌產(chǎn)生的一類激素樣多肽，介導(dǎo)固有炎性反應(yīng)，在抗感染免疫、免疫腫瘤細(xì)胞生長及維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的平衡上起著重要作用，可增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體的二次抗體應(yīng)答。IL-1的佐劑活性與其注射的時(shí)間和劑量密切相關(guān)，表現(xiàn)為時(shí)間和劑量的依賴性，通常在免疫后注射IL-1可獲得較好的活性。毒副作用最強(qiáng)的劑量，也是疫苗效果最好的劑量。有研究表明，由B細(xì)胞產(chǎn)生的IL-12是效果最好的細(xì)胞因子佐劑，是Th1分化和增殖、產(chǎn)生γ干擾素（interferon-γ，IFN-γ）以及與Thl型相關(guān)的免疫球蛋白所必不可少的。除此之外，IL-12可提高黏膜和體液免疫應(yīng)答中IgG2a和IgA的水平，減少病原體的侵入。IL-12通過Th1型應(yīng)答反應(yīng)對(duì)細(xì)菌、腫瘤細(xì)胞和寄生蟲抗原具有有效殺傷作用。目前，運(yùn)用基因工程的方法，可生產(chǎn)各種細(xì)胞因子，大大降低了生產(chǎn)成本。但高劑量細(xì)胞因子會(huì)激活過多的效應(yīng)因子，造成多余的中間物質(zhì)泄漏，過量使用將破壞應(yīng)答平衡，并導(dǎo)致非特異細(xì)胞活化的細(xì)胞因子，引起自身免疫病的發(fā)生。

1.5 脂質(zhì)體

脂質(zhì)體主要是脂質(zhì)小囊，由磷脂和固醇類組成，既是免疫佐劑，同時(shí)也具備抗原載體的功能。脂質(zhì)體表面的疏水結(jié)構(gòu)和內(nèi)部的親水結(jié)構(gòu)，使其具有廣泛的適用性，既可包被親水性抗原，又可包被親脂性抗原，通過將抗原輸送和遞呈給合適的免疫細(xì)胞發(fā)揮佐劑作用。脂質(zhì)體具有多種優(yōu)點(diǎn)：天然靶向性佐劑，易定位于單核細(xì)胞豐富的器官；類細(xì)胞膜材料，無毒性，可被生物降解，沒有殘留，安全性高；對(duì)細(xì)胞膜有較好的親和性，可將包被的抗原（或編碼抗原的DNA）輸送到細(xì)胞內(nèi)，激活細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答反應(yīng)；作為載體，攜帶半抗原，誘發(fā)動(dòng)物機(jī)體對(duì)半抗原的免疫反應(yīng)。脂質(zhì)體能夠降低被包被抗原的毒性，有效提高動(dòng)物機(jī)體對(duì)免疫原的耐受，良好地鞏固了抗原的穩(wěn)定性；同時(shí)還能延長疫苗使用期，改善疫苗貯存條件。但是，脂質(zhì)體分子含有不飽和脂肪酸鏈，在貯存時(shí)不穩(wěn)定；脂質(zhì)體的實(shí)驗(yàn)室制備技術(shù)雖已趨于成熟，但工業(yè)生產(chǎn)的制備工藝仍有待改進(jìn)，大規(guī)模合成難，費(fèi)用也較高。此外，脂質(zhì)體對(duì)動(dòng)物體內(nèi)某些酶敏感，進(jìn)入機(jī)體后不穩(wěn)定；小脂質(zhì)體傾向于相互融合成大脂質(zhì)體，在融合過程中會(huì)丟失抗原。脂質(zhì)體對(duì)抗原的包封率不均一，很難發(fā)揮疫苗的免疫作用。

2 ?油乳佐劑

油乳佐劑是指將一定比例的油相和水相通過乳化制備而成的混合物，其作用機(jī)理大致如下。首先，油乳佐劑對(duì)抗原進(jìn)行包被，在抗原進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)后，保護(hù)其不被體液中的各種酶迅速分解，通過緩慢釋放抗原，延長刺激機(jī)體的時(shí)間；同時(shí)貯庫效應(yīng)可使特異性抗原持續(xù)刺激動(dòng)物機(jī)體，從而產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，提高抗原的免疫原性。其次，油佐劑疫苗可引起注射部位細(xì)胞浸潤，誘發(fā)動(dòng)物機(jī)體局部產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，誘使巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等抗原呈遞細(xì)胞聚集和增殖，從而增強(qiáng)細(xì)胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答。最后，在油乳佐劑的作用下，抗原可經(jīng)淋巴管被運(yùn)送至整個(gè)淋巴結(jié)和脾臟處，從而進(jìn)一步產(chǎn)生新的刺激，誘導(dǎo)抗體生成。油乳佐劑還可通過刺激各種細(xì)胞因子如IL-2、IL-6等的分泌，在免疫反應(yīng)中發(fā)揮作用。油乳佐劑最主要的成分是油料，根據(jù)油料的不同，分為礦物油佐劑和非礦物油佐劑兩種。

2.1 礦物油佐劑

礦物油佐劑所用的油料通常稱為柏油，主要成分是液體石蠟，以弗氏佐劑最為經(jīng)典，分為弗氏不完全佐劑（Freund incomplete adjuvant，F(xiàn)IA）和弗氏完全佐劑（Freunds complete adjuvant，F(xiàn)CA）兩種，雖能刺激動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生很強(qiáng)的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，但毒性大、穩(wěn)定性差，難以長期保存，常常引起局部肉芽腫和無菌性膿腫，目前這兩種佐劑已不用于疫苗的生產(chǎn)。白油佐劑，是一種液體類烴類的混合物，別名液體石蠟，是目前獸用疫苗佐劑使用最為廣泛的佐劑，由石油經(jīng)深度脫蠟、化學(xué)精制等工藝處理后獲得，例如Specol劑、Montanide ISA50、Montanide ISA206、Montanide ISA15VG、IMS1315VG，由礦物油和乳化劑組成。與抗原乳化后，疫苗呈乳狀液，注入動(dòng)物機(jī)體，可持續(xù)緩慢釋放，延緩抗原在體內(nèi)的存留時(shí)間，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的殺菌和吞噬能力。

2.2 非礦物油佐劑

非礦物油佐劑的油料成分主要指角鯊烯、角鯊?fù)橐约爸参镉偷取Ｅc礦物油的不可代謝相反，非礦物油佐劑在動(dòng)物體內(nèi)可被代謝，副作用小。植物油佐劑主要有花生油，如佐劑65是在花生油和表面活性劑Arlacel A中加入硬脂酸鋁制成的油包水型佐劑；角鯊烯和角鯊?fù)橹饕獊碜陨詈ｕ忯~魚肝，主要有MF-59、SAF等。

SAF系列佐劑由蘇氨?；邗６模╩uramyl dipeptide，MDP）、Tween-80以及非離子表面活性劑等組成，因此具有表面活性劑和雙親性的作用，能夠有效地靶向呈遞抗原到淋巴細(xì)胞，進(jìn)而誘導(dǎo)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生各類細(xì)胞因子，提高體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，并且對(duì)動(dòng)物和人都沒有明顯的副作用。最初，角鯊烯是分離于鯊魚的肝臟，從植物中獲取角鯊烯雖是一種可持續(xù)的替代方法，但產(chǎn)量低。隨著合成生物學(xué)的進(jìn)步，為藥用級(jí)角鯊烯提供了創(chuàng)新生物合成方法，使角鯊烯生產(chǎn)更靈活、更便宜。

根據(jù)油乳劑疫苗的分散狀態(tài)，可以將其分為油包水型（W/O）、水包油型（O/W）、水包油包水型（W/O/W）三種類型。W/O型油乳劑疫苗的乳狀液黏度較高，可注射性差，但能在注射部位長時(shí)間貯存，緩釋作用強(qiáng)，佐劑活性高，能長時(shí)間地為抗原提供免疫增強(qiáng)作用；O/W型油乳劑疫苗的乳狀液黏度低，通針性強(qiáng)，安全性較高，接種后疫苗擴(kuò)散快，抗體水平上升迅速，但佐劑活性低，不能產(chǎn)生長效機(jī)制；雙相型（W/O/W）乳劑疫苗的黏度、通針性、在體內(nèi)作用時(shí)間和活性的發(fā)揮均介于O/W型和W/O型之間。注射后疫苗吸收良好，接種部位的炎癥反應(yīng)小，同時(shí)既可激發(fā)體液免疫，也可誘導(dǎo)細(xì)胞免疫。

3 ?小結(jié)

由于各種復(fù)雜的病原微生物常常呈現(xiàn)混合感染，慢性病導(dǎo)致的動(dòng)物機(jī)體出現(xiàn)免疫功能低下或免疫抑制，有效疫苗的研發(fā)面臨著越來越嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。根據(jù)佐劑的作用機(jī)制，在佐劑的優(yōu)點(diǎn)和其產(chǎn)生的不利反應(yīng)之間選取一個(gè)平衡點(diǎn)。正確地選擇和應(yīng)用佐劑可以充分發(fā)揮抗原的自身優(yōu)勢，有效地激發(fā)動(dòng)物機(jī)體免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)免疫應(yīng)答，特別是對(duì)免疫力低下的動(dòng)物意義重大。理想的獸用疫苗佐劑應(yīng)具備的特征：安全性好，要確保免疫動(dòng)物后產(chǎn)生的毒副作用小；良好的耐受性，可在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)長時(shí)間存在，持久穩(wěn)定地發(fā)揮佐劑作用；與抗原具有相容性，吸附抗原后可增加抗原的表面積，增強(qiáng)抗原的免疫原性，提高抗體產(chǎn)量；易于規(guī)?；a(chǎn)，生產(chǎn)成本低；能有效地激發(fā)細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答；與抗原混合制成的疫苗成品在安全有效的前提下，應(yīng)具備黏度較低、通針性強(qiáng)、顆粒粒徑小、顆粒均一、穩(wěn)定性良好等特點(diǎn)，可提高動(dòng)物機(jī)體中的抗體水平，且無明顯不良反應(yīng)等。隨著研究的深入，佐劑的應(yīng)用范圍也逐漸擴(kuò)大，不再局限于增強(qiáng)疫苗的免疫應(yīng)答，還包括增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體對(duì)細(xì)菌、病毒、真菌、寄生蟲的抵抗力。相信對(duì)佐劑的有效應(yīng)用會(huì)在人類和動(dòng)物的疾病預(yù)防等領(lǐng)域發(fā)揮更大的作用。