基于生物信息學(xué)分析喹啉酸磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶在惡性黑色素瘤中的表達及潛在生物學(xué)功能

曹靜，路鵬霏，萬學(xué)峰#

新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院1皮膚科，2腫瘤中心，烏魯木齊 830000

惡性黑色素瘤簡稱惡黑，是一種來源于黑色素細(xì)胞的惡性腫瘤，主要發(fā)生于皮膚，也見于皮膚-黏膜交界處、眼脈絡(luò)膜和軟腦膜等部位，具有惡性程度高、進展快、轉(zhuǎn)移早、預(yù)后差及病死率高等特點。皮膚惡性黑色素瘤約占皮膚惡性腫瘤的1%，病死例數(shù)占皮膚惡性腫瘤病死例數(shù)的80%以上[1]。近年來，惡性黑色素瘤的發(fā)病率在全世界呈上升趨勢，在西方國家中尤為顯著，目前已成為白種人最常見的惡性腫瘤之一[2]。近些年中國惡性黑色素瘤的發(fā)病率也逐漸上升，目前每年新發(fā)病例數(shù)2萬余例[3]。喹啉酸磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶（quinolinate phosphoribosyltransferase，QPRT）基因位于16 號染色體短臂，由35 421 個堿基對組成。QPRT 蛋白由297 個氨基酸組成，分子量為30 846 Da，是由3 個二聚體結(jié)合而成的六聚體，它是參與喹啉酸分解代謝的Ⅱ型磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶家族成員[4]。喹啉酸是色氨酸-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸途徑的中間產(chǎn)物，也是一種對神經(jīng)元作用很強的內(nèi)源性神經(jīng)毒素，QPRT 對維持喹啉酸在大腦中的穩(wěn)態(tài)必不可少[5]。有研究表明，QPRT 對神經(jīng)退行性改變的反應(yīng)增加，與癲癇、阿爾茨海默病和亨廷頓病等神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機制有關(guān)[6]。有文獻報道，QPRT基因在甲狀腺腫瘤、肝細(xì)胞腫瘤及血液系統(tǒng)腫瘤等腫瘤性疾病中發(fā)揮作用[7-9]。本研究通過生物信息學(xué)方法分析QPRT基因在惡性黑色素瘤中的表達及潛在生物學(xué)功能，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 資料收集

應(yīng)用癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）（http://cancergenome.nih.gov/）和基因表達綜合數(shù)據(jù)庫（Gene Expression Omnibus，GEO）（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/）檢索惡性黑色素瘤患者的臨床資料，如基本特征、治療過程、臨床分期、病理類型、生存情況以及組織標(biāo)本中QPRTmRNA 及蛋白表達情況等。

1.2 QPRT mRNA 表達水平分析

利用基因表達譜互動分析（Gene Expression Profiling Interactive Analysis，GEPIA）數(shù)據(jù)庫對TCGA 數(shù)據(jù)庫中惡性黑色素瘤組織和正常皮膚組織中QPRTmRNA 表達水平進行分析。利用UALCAN 數(shù)據(jù)庫（http://ualcan.path.uab.edu/）對TCGA數(shù)據(jù)庫中不同臨床分期惡性黑色素瘤患者惡性黑色素瘤組織中QPRTmRNA 的表達水平進行分析。

1.3 生存分析

應(yīng)用GEPIA 數(shù)據(jù)庫分析不同QPRTmRNA 表達情況惡性黑色素瘤患者的預(yù)后。

1.4 QPRT 蛋白表達情況分析

應(yīng)用人類蛋白質(zhì)參考數(shù)據(jù)庫（Human Protein Reference Database，HPRD）分析正常皮膚組織、原發(fā)性黑色素瘤組織及轉(zhuǎn)移性黑色素瘤組織中QPRT 蛋白的表達情況。

1.5 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)

應(yīng)用GeneMANIA 數(shù)據(jù)庫查找與QPRT 相互作用的蛋白。

1.6 基因功能分析

WebGestalt 是一個基因功能富集分析的在線網(wǎng)站，將與QPRT 相互作用的關(guān)鍵基因利用Web-Gestalt 進行基因本體（Gene Ontology，GO）分析，了解其參與的細(xì)胞組分、生物過程、生物功能。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，組間比較采用Logrank 檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 惡性黑色素瘤組織和正常皮膚組織中QPRT mRNA 表達水平的比較

通過GEPIA 數(shù)據(jù)庫在線分析TCGA 數(shù)據(jù)庫中461 例惡性黑色素瘤組織和558 例正常皮膚組織中QPRTmRNA 表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，惡性黑色素瘤組織中QPRTmRNA 表達水平明顯高于正常皮膚組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。（圖1）

2.2 不同臨床分期惡性黑色素瘤患者惡性黑色素瘤組織中QPRT mRNA 表達水平的比較

基于UALCAN 數(shù)據(jù)庫分析不同臨床分期惡性黑色素瘤患者惡性黑色素瘤組織中QPRTmRNA表達水平，結(jié)果顯示，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期惡性黑色素瘤患者惡性黑色素瘤組織中QPRTmRNA 表達水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（圖2）

圖2 不同臨床分期惡性黑色素瘤患者惡性黑色素瘤組織中QPRT mRNA表達水平

2.3 不同QPRT mRNA 表達情況惡性黑色素瘤患者預(yù)后的比較

應(yīng)用GEPIA 數(shù)據(jù)庫分析不同QPRTmRNA 表達情況惡性黑色素瘤患者的預(yù)后，以QPRTmRNA表達水平的中位數(shù)為界將458 例惡性黑色素瘤患者分為QPRT 高表達組（n=229）和QPRT 低表達組（n=229），結(jié)果顯示，QPRT 低表達組患者的總生存情況和無病生存情況均優(yōu)于QPRT 高表達組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（HR=1.3、1.3，P＜0.05）。（圖3）

圖3 不同QPRT表達情況惡性黑色素瘤患者的無病生存曲線和總生存曲線

2.4 惡性黑色素瘤組織中QPRT 蛋白表達情況

免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果顯示，在正常皮膚組織中，QPRT 蛋白陰性表達（黑色素細(xì)胞中也為陰性），在惡性黑色素瘤組織中QPRT 蛋白呈強陽性表達，QPRT 蛋白主要在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)均勻分布，呈棕褐色。在原發(fā)性黑色素瘤組織與轉(zhuǎn)移性黑色素瘤組織中，QPRT 蛋白均為強陽性表達。（圖4）

圖4 正常皮膚組織和惡性黑色素瘤組織中QPRT蛋白表達情況（免疫組化染色，×400）

2.5 QPRT 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)預(yù)測及功能分析

GeneMANIA 數(shù)據(jù)庫共篩選出20 個與QPRT 相互作用的蛋白質(zhì)：AC009133.22、支鏈α-酮酸脫氫酶（branched chain alpha-keto acid dehydrogenase kinase，BCKDK）、丙酮酸脫氫酶激酶4（pyruvate dehydrogenase kinase 4，PDK4）、載脂蛋白C1（apolipoprotein C1，APOC1）、組織蛋白酶D（cathepsin D，CTSD）、PTB 結(jié)合核蛋白2（ribonucleoprotein,PTB binding 2，RAVER2）、加工前體4（processing of precursor 4，POP4）、ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白亞家族C 成員1（ATP binding cassette subfamily C member 1，ABCC1）、PAT1 同源物1（PAT1 homolog 1，PATL1）、神經(jīng)連接蛋白3（neuroligin 3，NLGN3）、抗氧化劑1 銅伴侶蛋白（antioxidant 1 copper chaperone，ATOX1）、TRAF3 結(jié)合蛋白2（TRAF3 interacting protein 2，TRAF3IP2）、甘氨酸脫氫酶（glycine decarboxylase，GLDC）、核蛋白1（nuclear protein 1，NUPR1）、紋蛋白4（striatin 4，STRN4）、核質(zhì)蛋白α6（karyopherin subunit alpha 6，KPNA6）、核質(zhì)蛋白β1（karyopherin subunit beta 1，KPNB1）、異檸檬酸脫氫酶1（isocitrate dehydrogenase 1，IDH1）、煙堿酸磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶（nicotinate phosphoribosyltransferase，NAPRT）、煙酰胺磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶（nicotinamide phosphoribosyltransferase，NAMPT），相互作用關(guān)系包括物理相互作用、共表達、共享蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域、共定位等。（圖5）

圖5 GeneMANIA數(shù)據(jù)庫分析QPRT相互作用蛋白

2.6 GO 功能分析

對上述基因參與的生物過程、細(xì)胞組分、分子功能進行分析發(fā)現(xiàn)，這些蛋白主要參與了代謝過程、生物調(diào)節(jié)、定位等生物過程；QPRT相關(guān)基因位于多種細(xì)胞組分中，包括細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜、細(xì)胞外間隙、內(nèi)膜系統(tǒng)等；分子功能包括蛋白結(jié)合、離子結(jié)合、核酸結(jié)合、參與轉(zhuǎn)運體活動等。（圖6）

圖6 與QPRT相互作用關(guān)鍵基因的GO功能富集分析

3 討論

隨著高通量測序技術(shù)及微陣列雜交技術(shù)的迅速發(fā)展，產(chǎn)生了大量基因數(shù)據(jù)，包含腫瘤表觀組、基因組及轉(zhuǎn)錄組等信息。為了滿足研究人員信息共享的需求，多個基因數(shù)據(jù)庫應(yīng)運而生，目前已廣泛應(yīng)用于基因表達定量分析，為腫瘤研究提供了良好的平臺。本研究分析TCGA 數(shù)據(jù)庫中的芯片數(shù)據(jù)，探索惡性黑色素瘤中QPRT的表達水平。高通量測序技術(shù)具有自動化、低成本等特點，研究結(jié)果可靠，可用于發(fā)現(xiàn)新的具有較大意義的基因。近年來，RNA、蛋白質(zhì)等在腫瘤中異常表達的研究較多，然而QPRT 在惡性黑色素瘤中的作用尚不清楚。

煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD，又稱NAD+），曾稱為二磷酸吡啶核苷酸或輔脫氫酶Ⅰ或氧化型輔酶Ⅰ，可傳遞電子，是體內(nèi)很多脫氫酶的輔酶，連接三羧酸循環(huán)和呼吸鏈，其功能是將代謝過程中脫下來的氫傳遞給黃素蛋白，參與多種代謝活動[10]。QPRT 可催化喹啉酸生成煙酸單核苷酸，是輔酶NAD 從頭合成的前體，故QPRT 是調(diào)控三羧酸循環(huán)及呼吸鏈的重要酶。喹啉酸具有內(nèi)源性神經(jīng)毒性，既往研究已明確QPRT 在神經(jīng)退行性疾病，如阿爾茨海默病、亨廷頓病等疾病中發(fā)揮重要作用。又有學(xué)者在孤獨癥譜系障礙（autism spectrum disorder，ASD）患者中發(fā)現(xiàn)QPRT基因變異，通過觀察抑制QPRT功能后神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的變化得出，QPRT 對SH-SY5Y 神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞分化具有很強的調(diào)控作用，且存在因果關(guān)系，提示QPRT 在ASD 的發(fā)病機制中起重要作用[11]。

近年來，除神經(jīng)系統(tǒng)疾病外，QPRT 在腫瘤相關(guān)疾病中的作用也逐漸被發(fā)現(xiàn)。Hinsch 等[7]對甲狀腺腫瘤患者的基因表達情況進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，QPRT在濾泡性甲狀腺腺瘤和濾泡性甲狀腺癌中表達不同，并通過免疫組化法進行驗證，得出65%的濾泡性甲狀腺癌表達QPRT 蛋白，僅22%的濾泡性甲狀腺腺瘤表達QPRT 蛋白，提示QPRT 參與甲狀腺腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程，可能成為免疫組織化學(xué)篩查濾泡性甲狀腺結(jié)節(jié)的潛在標(biāo)志物。Sahm 等[12]對腦膠質(zhì)瘤的研究發(fā)現(xiàn)，QPRT 不僅在神經(jīng)退行性疾病中發(fā)揮作用，也參與膠質(zhì)瘤的進展，腫瘤惡性程度越高，QPRT 的表達水平也越高，并且在放化療后復(fù)發(fā)的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中，QPRT 表達升高與預(yù)后不良有關(guān)。進一步研究發(fā)現(xiàn)，QPRT 高表達可增強腫瘤細(xì)胞對放化療誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激的抵抗力，發(fā)揮抗凋亡作用，從而導(dǎo)致預(yù)后較差，提示QPRT 可能成為腦膠質(zhì)瘤的潛在治療靶點[13]。Wilms 腫瘤基因1（Wilms tumor gene 1，WT1）是一種轉(zhuǎn)錄因子，被認(rèn)為是白血病的癌基因，QPRT是與WT1相關(guān)性最高的基因之一。Ullmark 等[8]研究QPRT 是否在白血病的發(fā)病中發(fā)揮作用，通過在白血病K562 細(xì)胞中過表達QPRT，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞對抗白血病藥物伊馬替尼產(chǎn)生部分耐藥性，也提示QPRT可能具有抗凋亡功能，這與上述關(guān)于膠質(zhì)瘤細(xì)胞的報道一致。有研究發(fā)現(xiàn)，QPRT可能是乳腺癌的促癌基因，可通過影響肌球蛋白輕鏈磷酸化促進乳腺癌侵襲[14]。另有研究發(fā)現(xiàn)，QPRT 在乳腺癌中表達上調(diào)，尤其是在人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）陽性乳腺癌中，明確了QPRT 是浸潤性乳腺癌的獨立預(yù)后因素，并且與免疫細(xì)胞浸潤息息相關(guān)[15-16]。在結(jié)腸癌中同樣發(fā)現(xiàn)QPRT 高表達與預(yù)后不良相關(guān)[17]。有研究發(fā)現(xiàn)，QPRT 蛋白在肝細(xì)胞癌患者組織間隙液中的表達水平明顯低于健康者，提示該蛋白參與了肝細(xì)胞癌的發(fā)生過程，但具體作用機制尚需研究[9]。此外，也有基因表達分析的研究顯示，QPRT基因在子宮平滑肌瘤中高表達，是正常子宮平滑肌的3.6倍[18]。

學(xué)者們逐漸開始關(guān)注QPRT基因在腫瘤相關(guān)疾病，尤其是惡性腫瘤相關(guān)疾病中的作用，但是在惡性黑色素瘤中的作用尚未有相關(guān)報道。本文通過整合公共數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)QPRT 在惡性黑色素瘤組織中高表達，且QPRT 高表達與預(yù)后不良相關(guān)，雖然QPRT基因表達水平在不同臨床分期惡性黑色素瘤組織中未見明顯差異，但仍可能是區(qū)分腫瘤良惡性的重要標(biāo)志物。雖然目前現(xiàn)有數(shù)據(jù)提示QPRT基因與腫瘤臨床分期、惡性程度無明確相關(guān)性，但其可對惡性黑色素瘤的診斷及預(yù)后評估提供參考，對腫瘤療效評價的作用仍需進一步探討。以上結(jié)果均提示QPRT基因參與惡性黑色素瘤的發(fā)生并發(fā)揮重要作用，猜測其可能的機制如下：①惡性黑色素瘤的惡性程度高，易發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為，這正是腫瘤細(xì)胞增殖活躍的表現(xiàn)，該基因參與調(diào)控三羧酸循環(huán)及呼吸鏈反應(yīng)，為機體提供能量，參與機體新陳代謝，因此有可能通過QPRT基因表達上調(diào)為腫瘤細(xì)胞提供更多能量，使腫瘤細(xì)胞增殖活躍，促進其快速進展、轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致預(yù)后不良。②結(jié)合既往學(xué)者研究，QPRT 高表達可增加腫瘤細(xì)胞對放療、化療的抵抗力，發(fā)揮抗凋亡作用，但其具體作用機制仍需進一步研究。

目前惡性黑色素瘤的治療仍以手術(shù)為主，同時積極探索新的治療方法，如免疫治療和靶向治療等。中國惡性黑色素瘤患者對靶向治療的反應(yīng)與西方人群類似，但對免疫治療的反應(yīng)不如西方人群[3]，因此國內(nèi)也在積極開展惡性黑色素瘤方面的研究，以打破傳統(tǒng)治療的束縛。本文通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，QPRT基因在惡性黑色素瘤中明顯高表達，可能成為潛在的治療靶點；免疫組化法檢測顯示，QPRT在惡性黑色素瘤組織中呈強陽性表達，提示該蛋白有望成為篩查惡性黑色素瘤的生物標(biāo)志物；同時QPRT基因高表達與預(yù)后不良相關(guān)，可為惡性黑色素瘤的預(yù)后判斷提供新的參考依據(jù)。

綜上所述，QPRT基因在惡性黑色素瘤中高表達，其高表達與惡性黑色素瘤患者的預(yù)后不良相關(guān)，可能成為篩查惡性黑色素瘤的標(biāo)志物及治療靶點。QPRT 可為惡性黑色素瘤的篩查診斷、靶向治療及預(yù)后評估提供新的探索方向。由于本研究參考的數(shù)據(jù)庫源于國外，而惡性黑色素瘤在不同人種、地區(qū)的發(fā)病率及類型差異較大，本課題組后續(xù)將進一步研究及驗證QPRT基因在中國惡性黑色素瘤患者中的表達情況。