高效液相色譜法測(cè)定雀辣中辣椒素及類似物的含量

白銘松，何佳艷，熊彩云，袁 潘，李成功，潘文麗

（祥云縣綜合檢驗(yàn)檢測(cè)院，云南大理 671000）

雀辣資源主要分布于云南普洱地區(qū)、西雙版納地區(qū)和德宏地區(qū)。雀辣在普洱地區(qū)主要分布于寧洱縣黎明鄉(xiāng)、磨黑鎮(zhèn)把邊江流域和勐野江流域，當(dāng)?shù)厝朔Q其為雀屎辣。顧曉振等[1]研究證實(shí)了雀辣更傾向于灌木辣椒（Capsicum frutescens）。辣椒素和二氫辣椒素是辣椒中的主要生物活性成分，已有研究證實(shí)辣椒素具有抗氧化、預(yù)防心血管疾病、保護(hù)胃腸黏膜和抗腫瘤等多種功效[2-10]，今后可從提取辣椒素及類似物的途徑發(fā)展到醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用和研究。

辣椒素的含量可使用液相色譜法[11-12]、氣相色譜法[13]、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法[14-15]等方法進(jìn)行測(cè)定，但目前鮮有雀辣中辣椒素及二氫辣椒素分析檢測(cè)的報(bào)道。本文建立和優(yōu)化了雀辣中辣椒素和二氫辣椒素的含量測(cè)定方法，并對(duì)普洱雀辣和西雙版納雀辣中辣椒素及二氫辣椒素的含量進(jìn)行分析比較，為雀辣產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

普洱雀辣采購(gòu)于云南寧洱縣黎明鄉(xiāng)，西雙版納雀辣購(gòu)于云南西雙版納（所有樣品經(jīng)烘干后備用）；辣椒素（成都曼思特生物科技有限公司，純度為98.61%）；二氫辣椒素（Stanford Chemicals，純度為99.11%）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司，GZX-GF-101）；分析天平（梅特勒，ME204T）；高效液相色譜儀（賽默飛，UItimate 3000）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理

方法一：取樣品約0.5 g，分別加入10 mL、5 mL、5 mL 70%乙醇溶液超聲提取3次，每次提取20 min，合并提取液，混勻后直接過0.45 μm濾膜，待測(cè)定。方法二：稱取樣品約1 g，分別加入20 mL、15 mL、15 mL 50%乙醇溶液超聲提取3次，每次提取20 min，合并提取液，精確量取20 mL于蒸發(fā)皿中蒸至近干，加甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，混勻后過0.22 μm濾膜，待測(cè)定。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別稱取辣椒素、二氫辣椒素0.019 45 g、0.015 89 g（精密稱定），用甲醇溶解并稀釋定容至10 mL，得到濃度為1.92 mg·mL-1的辣椒素和濃度為1.57 mg·mL-1的二氫辣椒素儲(chǔ)備溶液。分別準(zhǔn)確吸取辣椒素、二氫辣椒素儲(chǔ)備溶液0.01 mL、0.02 mL、0.04 mL、0.05 mL和0.10 mL于10 mL容量瓶中并用甲醇定容至刻度，配成辣椒素濃度為0.019 2 mg·mL-1、0.038 4 mg·mL-1、0.076 7 mg·mL-1、0.095 9 mg·mL-1和0.191 8 mg·mL-1，二氫辣椒素濃度為0.015 7 mg·mL-1、0.031 5 mg·mL-1、0.063 0 mg·mL-1、0.0787 4 mg·mL-1和0.157 5 mg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)使用液。

1.2.3 色譜條件

Acclaim? 120 C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：35 ℃；流速：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量：10 μL；流動(dòng)相：甲醇+1%磷酸水（80+20），等度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理的優(yōu)化結(jié)果

對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)使用液及不同前處理方法得到的樣品提取液進(jìn)行檢測(cè)分析。用辣椒素和二氫辣椒素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的保留時(shí)間進(jìn)行定性；使用外標(biāo)多點(diǎn)校準(zhǔn)法，以峰面積進(jìn)行定量。辣椒素和二氫辣椒素的測(cè)定結(jié)果見表1。兩種前處理方法檢測(cè)結(jié)果無(wú)顯著差異（P＞0.05），即不同的樣品處理方法對(duì)雀辣辣椒素和二氫辣椒素含量的檢測(cè)結(jié)果沒有太大的影響。但第一種方法操作簡(jiǎn)便，所用試劑較少，故采用方法一進(jìn)行方法確認(rèn)并對(duì)不同產(chǎn)地雀辣中二氫辣椒素和辣椒素的含量進(jìn)行測(cè)定。

表1 不同提取方法的辣椒素、二氫辣椒素含量（單位：mg·g-1）

2.2 方法的確認(rèn)

2.2.1 線性及相關(guān)系數(shù)

將配制的混合標(biāo)準(zhǔn)使用液上機(jī)分析，以濃度為橫坐標(biāo)，目標(biāo)峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。辣椒素標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=71.856X+0.356 4，相關(guān)系數(shù)大于0.999 9，表明辣椒素在0.019 2～0.191 8 mg·mL-1線性良好。二氫辣椒素標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=101.2X+0.557 6，相關(guān)系數(shù)為0.999 8，表明二氫辣椒素在0.015 7～0.157 5 mg·mL-1線性良好。

2.2.2 方法檢出限和定量限

使用同一濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)儀器多次測(cè)定，選取目標(biāo)峰后較為平直的一段（9～10 min）作為噪音基線，得到化合物的信噪比（S/N）。根據(jù)GB/T 27417—2017中5.4.2.2信噪比法評(píng)估檢出限（LOD），并默認(rèn)信噪比與濃度呈正比，計(jì)算化合物的儀器檢出濃度（信噪比為3）和儀器定量濃度（信噪比為10），得到樣品中化合物的實(shí)際檢出限與定量限。

由表2可知，辣椒素的檢出限為5.84 mg·kg-1，定量限為19.46 mg·kg-1，二氫辣椒素檢出限為4.68 mg·kg-1，定量限為15.61 mg·kg-1。從已知的資料可知[11-12,16-17]，辣椒中辣椒素和二氫辣椒素的含量遠(yuǎn)高于所建立方法的檢出限和定量限，因此可以推廣應(yīng)用于其他品種辣椒中辣椒素及二氫辣椒素的含量測(cè)定。

表2 辣椒素和二氫辣椒素的檢出限和定量限

2.2.3 方法準(zhǔn)確度

按照定量限、2倍定量限、10倍定量限加入對(duì)照品，按照方法一進(jìn)行前處理，上機(jī)分析，扣除樣品本底值后得到回收率。辣椒中辣椒素及二氫辣椒素在低加標(biāo)濃度時(shí)的回收率分別為91.23%、91.06%，在中加標(biāo)濃度時(shí)的回收率分別為94.85%、93.33%，在高加標(biāo)濃度時(shí)的回收率分別為101.22%、99.58%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確度高，準(zhǔn)確度滿足相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)回收率的要求。

2.2.4 方法精密度

稱取約0.5 g的試樣6份，按照方法一進(jìn)行前處理，分別進(jìn)樣測(cè)定。辣椒素測(cè)定結(jié)果為3.221 mg·g-1、3.215 mg·g-1、3.173 mg·g-1、3.177 mg·g-1、3.217 mg·g-1和3.171 mg·g-1，精密度為0.8%。二氫辣椒素測(cè)定結(jié)果為0.848 mg·g-1、0.886 mg·g-1、0.851 mg·g-1、0.854 mg·g-1、0.889 mg·g-1和0.869 mg·g-1，精密度為2.1%。該方法精密度良好，滿足相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)方法精密度的要求。

2.3 不同產(chǎn)地雀辣中辣椒素和二氫辣椒素含量

使用方法一對(duì)成熟度一致的2份西雙版納雀辣、2份普洱雀辣進(jìn)行處理，上機(jī)檢測(cè)分析。根據(jù)辣椒素和二氫辣椒素的峰面積求出樣品中辣椒素、二氫辣椒素的含量，結(jié)果見表3。普洱雀辣的辣椒素及二氫辣椒素的含量均明顯高于西雙版納雀辣。有研究表明辣椒中辣椒素及二氫辣椒素的含量與辣椒的品種、成熟度、地理環(huán)境等因素有關(guān)，成善漢等[18]的研究結(jié)果表明，印度超級(jí)辣椒的辣椒素含量最高達(dá)59.86 mg·g-1；吳奕敏等[17]研究了小米辣的辣椒素含量為（0.050±0.004）～（8.966±0.306）mg·g-1，二氫辣椒素含量為（0.003±0.002）～（1.311±0.055）mg·g-1；MENICHINI等[13]研究了辣椒未成熟階段辣椒素含量為（1 071±16.7）μg·g-1，成熟階段辣椒素含量為（4 363±23.1）μg·g-1。有研究發(fā)現(xiàn)雀辣中還含有維生素C等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，較其他品種的辣椒含量更高[16]，故雀辣具有明顯的研究開發(fā)價(jià)值。

表3 不同產(chǎn)地雀辣的辣椒素和二氫辣椒素含量（單位：mg·g-1）

3 結(jié)論

使用該方法測(cè)定雀辣中辣椒素及二氫辣椒素，辣椒素在0.019 2～0.191 8 mg·mL-1線性良好，相關(guān)系數(shù)大于0.999 9，二氫辣椒素在0.015 7～0.157 5 mg·mL-1線性良好，相關(guān)系數(shù)為0.999 8；方法回收率為91.06%～101.22%，RSD為0.8%～2.1%。優(yōu)化后的提取方法快速、穩(wěn)定、準(zhǔn)確、節(jié)省溶劑，方法適用于測(cè)定雀辣中辣椒素和二氫辣椒素的含量。雀辣中辣椒素含量為（3.190±0.025）～（5.308±0.022）mg·g-1，二氫辣椒素含量為（0.868±0.021）～（1.082±0.018）mg·g-1，普洱雀辣中辣椒素及二氫辣椒素的含量高于西雙版納雀辣。