低聚木糖對低鹽脅迫下凡納濱對蝦生長、免疫及腸道菌落的影響

朱啟飛 賀瑩 李云 劉紅

摘要：【目的】探究低鹽脅迫下低聚木糖（XOS）對凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）生長性能、抗氧化能力、免疫相關(guān)基因表達(dá)及腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響，為凡納濱對蝦淡化養(yǎng)殖飼料的開發(fā)提供理論依據(jù)。【方法】將450尾凡納濱對蝦按照養(yǎng)殖水體鹽度和XOS添加量分為海水對照組HS0（鹽度30‰+0 mg/kg XOS）及低鹽對照組LS0（鹽度3‰+0 mg/kg XOS）、LS250（鹽度3‰+250 mg/kg XOS）、LS500（鹽度3‰+500 mg/kg XOS）和LS1000（鹽度3‰+1000 mg/kg XOS）。飼養(yǎng)8周后計算生長指標(biāo)，采用試劑盒測定消化酶活性和抗氧化指標(biāo)，并通過實(shí)時熒光定量PCR檢測免疫相關(guān)基因的表達(dá)情況?！窘Y(jié)果】與HS0組相比，LS0組凡納濱對蝦的生長指標(biāo)、消化酶活性、抗氧化能力及免疫相關(guān)基因相對表達(dá)量均有所下降。與LS0組相比，LS500和LS1000組凡納濱對蝦的增重率、特定生長率、存活率及淀粉酶（AMS）活性均呈顯著升高趨勢（P<0.05，下同），丙二醛（MDA）含量則呈顯著降低趨勢；脂肪酶（LPS）、胰蛋白酶（Trp）、超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）活性呈上升趨勢，但差異不顯著（P>0.05）。LS500和LS1000組凡納濱對蝦的酚氧化酶原（proPO）、抗脂多糖因子（ALF）、溶菌酶（LZM）、Toll樣受體1（TLR1）、Toll樣受體2（TLR2）和Toll樣受體3（TLR3）基因的相對表達(dá)量均顯著高于LS0組凡納濱對蝦。此外，LS1000組凡納濱對蝦的腸道菌群Shannon指數(shù)、Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)顯著高于LS0組凡納濱對蝦，Simpson指數(shù)顯著低于LS0組凡納濱對蝦；在門分類水平上，變形菌門和擬桿菌門相對豐度顯著降低，而藍(lán)細(xì)菌門、厚壁菌門和疣微菌門的相對豐度顯著增高；在屬分類水平上，弧菌屬、黃海綿菌屬、斯氏弓型菌屬和希瓦氏菌屬相對豐度顯著降低，而乳酸桿菌屬和不動桿菌屬相對豐度顯著增加?！窘Y(jié)論】在基礎(chǔ)飼料中添加500～1000 mg/kg XOS，可顯著提高凡納濱對蝦生長速率、抗氧化性能、免疫相關(guān)基因表達(dá)及改善腸道菌群組成結(jié)構(gòu)，有效提高對蝦在低鹽脅迫下的養(yǎng)殖效果，即XOS可作為凡納濱對蝦淡化養(yǎng)殖飼料添加劑進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：凡納濱對蝦；低鹽脅迫；低聚木糖（XOS）；生長；免疫；腸道菌群

中圖分類號：S968.229? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-1191（2023）02-0618-11

Abstract：【Objective】This study investigated the effects of xylo-oligosaccharide （XOS） on the growth performance， antioxidant capacity， immune-related gene expression and intestinal flora structure of Litopenaeus vannamei under low salinity stress conditions， and provided theoretical basis for the development of desalination culture feeds for L. vannamei. 【Method】According to the salinity of the cultured water and XOS addition， the 450 L. vannamei were divided into seawater control group HS0 （salinity 30‰+0 mg/kg XOS）， low salinity control groups LS0 （salinity 3‰+0 mg/kg XOS）， LS250 （salinity 3‰+250 mg/kg XOS）， LS500 （salinity 3‰+500 mg/kg XOS） and LS1000 （salinity 3‰+1000 mg/kg XOS）. Growth indexes were calculated after 8 weeks of feeding， digestive enzyme activities and antioxidant indexes were measured by kits， meanwhile， immune-related gene expression was detected by real-time fluorescence quantitative PCR. 【Result】Compared with the HS0 group， the growth indexes， digestive enzyme activities， antioxidant capacity and the re-lative expression of immune-related genes of L. vannamei in the LS0 group were all decreased. Compared with the LS0 group， the weight gain rate， specific growth rate， survival rate and amylase（AMS） activity of L. vannamei in the LS500 and LS1000 groups showed significant increase trend （P<0.05， the same below）， while the malondialdehyde （MDA） content showed a significant decrease trend. Lipase （LPS）， trypsin （Trp）， superoxide dismutase （SOD） and catalase （CAT） activities also showed an increasing trend， but the difference was not significant （P>0.05）. In LS500 and LS1000 groups， the relative expression levels of prophenoloxidase （proPO）， anti-lipopolysaccharide factor （ALF）， lysozyme （LZM）， toll-like receptor 1（TLR1）， toll-like receptor 2（TLR2） and toll-like receptor 3（TLR3） genes in LS500 and LS1000 groups were significantly higher than LS0. The intestinal flora Shannon index， Chao1 index， ACE index of LS1000 group L. vannamei were significantly higher than LS0 group，and Simpson index was significantly lower than LS0 group. At the phylum level， the relative abundance of Proteobacteria and Bacteroidetes decreased significantly， while the relative abundance of Cyanobacteria_Chloroplast， Firmicutes and Verrucomicrobia increased significantly. At the genus level， the relative abundance of Vibrio， Spongiimonas， Arcobacter and Shewanella decreased significantly， while the relative abundance of Lactobacillus and Acinetobacter increased significantly. 【Conclusion】Under low salinity stress， the addition of 500-1000 mg/kg XOS to the feed in this study significantly increased the growth rate， antioxidant performance， immune-related gene expression and improved the composition structure of intestinal flora of L. vannamei， effectively improving the culture effect of shrimp under low salitiny stress， so that XOS can be further developed and applied as a feed additive for desalination culture of L. vannamei.

Key words： Litopenaeus vannamei； low salinity stress； xylo-oligosaccharide（XOS）； growth performance； immune； intestinal flora

Foundation items： Shanghai Agriculture Applied Technology Development Project（2019-02-08-00-10-F01111）

0 引言

【研究意義】凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）原產(chǎn)于墨西哥南部至秘魯?shù)奶窖笱匕?，具有適應(yīng)性廣、生長速度快及肉質(zhì)鮮美等優(yōu)點(diǎn)，是目前全球最主要的水產(chǎn)養(yǎng)殖品種之一（王興強(qiáng)等，2004）。為滿足日趨增加的市場需求，以及避免沿岸水質(zhì)惡化導(dǎo)致新的疾病，凡納濱對蝦養(yǎng)殖范圍已由沿岸水域逐漸擴(kuò)展到內(nèi)陸低鹽度水域（Li et al.，2017），但在長期低鹽脅迫下凡納濱對蝦免疫力低下（Xu et al.，2017）、存活率下降（Pinheiro et al.，2019）、生長緩慢（湯上上等，2022）等系列問題已成為制約其淡化養(yǎng)殖發(fā)展的重要因素。因此，亟待尋找一種科學(xué)有效的方法以緩解這些不良反應(yīng)，確保凡納濱對蝦淡化養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展。【前人研究進(jìn)展】低聚木糖（Xylo-oligosaccharides，XOS）是由2～7個木糖分子以β-1，4糖苷鍵結(jié)合而成的功能性聚合糖，其有效成分以木二糖和木三糖為主。XOS作為新型的動物飼料添加劑具有一些獨(dú)特性能，包括耐酸耐熱、有效攝入劑量低、不易被腸道消化酶分解、具有良好配伍性等優(yōu)點(diǎn)，且能在玉米芯、甘蔗渣等纖維原料中提取獲得（袁鐘宇等，2008）。此外，XOS能通過改善宿主腸道菌群結(jié)構(gòu)，刺激腸道消化酶活性，增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化性能、免疫力和抗逆性，進(jìn)而維持其健康水平（胡毅，2007；胡曉偉等，2018；Zhang et al.，2020）。至今，有關(guān)XOS對魚類影響的研究已有較多報道。熊沈?qū)W（2005）以含XOS的飼料飼喂異育銀鯽（Carassius auratus gibelio）45 d，結(jié)果發(fā)現(xiàn)添加0.01% XOS能顯著提高增重率及其腸道和肝胰腺的消化酶活性，但超過該水平后各項(xiàng)指標(biāo)呈下降趨勢。強(qiáng)俊等（2009）研究表明，在飼料中添加0.03% XOS能顯著提高奧尼羅非魚（Oreochromis niloticus×O. aureus）的特定生長率，肝胰臟蛋白酶和腸蛋白酶活力則呈先上升后下降的變化趨勢。龐麗姣（2011）研究證實(shí)，以含XOS（添加量在2～4 g/kg）的飼料飼喂草魚（Ctenopharyngodon idellus）56 d后，IL-1β、IFN、TNFα等免疫相關(guān)基因在草魚肝臟、腎臟和脾臟中的相對表達(dá)量顯著上調(diào)。齊志濤等（2011）以含XOS的飼料飼喂斑點(diǎn)叉尾鮰（Ictalurus punctatus）50 d，結(jié)果發(fā)現(xiàn)添加量在0.05%～0.10%時斑點(diǎn)叉尾鮰血清中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）活力顯著提高。張榮斌等（2011）研究報道，飼喂奧尼羅非魚含XOS的飼料56 d后，添加量在600～710 mg/kg的奧尼羅非魚血清超氧化物歧化酶（SOD）活力顯著升高，且隨養(yǎng)殖時間的推移，SOD活力呈先升高后降低的變化趨勢。但近10年來有關(guān)XOS對甲殼類動物影響的研究報道較少。王國霞等（2010）研究發(fā)現(xiàn)添加400 mg/kg XOS能顯著提高凡納濱對蝦幼蝦肝胰腺脂肪酶（LPS）和胃蛋白酶活力，且腸道絨毛的長度和厚度顯著增加，腸道雙歧桿菌數(shù)量顯著增加，而弧菌數(shù)量顯著下降。陳曉瑛等（2014，2018）研究發(fā)現(xiàn)，在基礎(chǔ)飼料中添加200 mg/kg XOS能顯著提高凡納濱對蝦特定生長率、增重率和肝體脂數(shù)等各項(xiàng)生長指標(biāo)，飼料系數(shù)顯著降低；添加400 mg/kg XOS能顯著提高凡納濱對蝦血清溶菌酶（LZM）和酚氧化酶活力，有效降低肝胰腺丙二醛（MDA）含量，且腸道中的雙歧桿菌、乳酸菌等益生菌相對豐度顯著增加，弧菌和葡萄球菌相對豐度顯著下降?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】腸道既是甲殼類動物主要的消化器官，在面對環(huán)境脅迫時也是重要的能量來源場所。XOS作為飼料添加劑有利于腸道益生菌生長增殖，提高機(jī)體對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收能力，進(jìn)而提高其應(yīng)對環(huán)境脅迫的能力，因此探究XOS是否能有效提高凡納濱對蝦在低鹽環(huán)境中的適應(yīng)能力，對確保對蝦養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展具有重要意義?！緮M解決的關(guān)鍵問題】在低鹽脅迫條件下，探究基礎(chǔ)飼料中添加XOS對凡納濱對蝦生長性能、抗氧化能力、免疫相關(guān)基因表達(dá)及腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響，為凡納濱對蝦淡化養(yǎng)殖飼料的研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)飼料制備

以魚粉、豆粕、花生粕、小麥粉、烏賊膏、蝦殼粉、大豆卵磷脂、魚油及預(yù)混料配制的基礎(chǔ)飼料購自廣東恒興飼料科技有限公司，飼料具體配方見表1。XOS（純度99%，浙江一諾生物科技有限公司）先溶于水，再加入基礎(chǔ)飼料攪拌均勻，制成含25、500和1000 mg/kg XOS的3種試驗(yàn)飼料，置于烘箱中55 ℃烘干24 h后過篩制成1.5～1.8 mm顆粒飼料。試驗(yàn)飼料含水率低于10%，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2 凡納濱對蝦飼養(yǎng)管理

供試凡納濱對蝦由上海海洋大學(xué)洋山港良種選育基地提供，共設(shè)5個處理，每處理設(shè)3個平行，每個平行為1個350 L的養(yǎng)殖桶。按照養(yǎng)殖水體鹽度和飼料中的XOS含量，分為海水對照組HS0（鹽度30‰+0 mg/kg XOS）及低鹽脅迫組LS0（鹽度3‰+0 mg/kg XOS）、LS250（鹽度3‰+250 mg/kg XOS）、LS500（鹽度3‰+500 mg/kg XOS）和LS1000（鹽度3‰+1000 mg/kg XOS）。挑選450尾規(guī)格均勻、活力強(qiáng)、體重相近（0.30±0.01 g）的幼蝦隨機(jī)分到養(yǎng)殖桶中，每桶30尾，飼養(yǎng)8周。每天投喂4次（8：00、12：00、18：00和23：00），飽食投喂，1 h后收集殘餌和糞便。日換水量為總水體的30%，水溫維持在26～28 ℃，pH 7.5～8.0，溶解氧≥5 mg/L，總氨<0.05 mg/L。每天觀察凡納濱對蝦的健康狀況并記錄死亡情況。

1. 3 樣品采集及生長指標(biāo)計算

提前24 h禁食再取樣，記錄各養(yǎng)殖桶中的凡納濱對蝦數(shù)量及測量每尾對蝦的體長和體重。每個平行選取15尾對蝦并在冰盤上快速解剖，采集肝胰腺、腸道和鰓組織放入無菌凍存管中。所有組織樣品采集后立即置于液氮中速凍，再轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。生長指標(biāo)計算參照陳儉等（2022）的方法：

增重率（WGR，%）=（終末體重-初始體重）/初始體重×100

特定生長率（SGR，%/d）=（ln終末體重-ln初始體重）/試驗(yàn)天數(shù)×100

肥滿度（CF，%）=終末體重/終末體長3×100

肝體指數(shù)（HSI，%）=終末肝胰腺重/終末體重×100

存活率（SR，%）=終末尾數(shù)/初始尾數(shù)×100

1. 4 指標(biāo)測定

1. 4. 1 消化酶活性和抗氧化指標(biāo)測定 每個重復(fù)選取6尾凡納濱對蝦的肝胰腺和腸道組織樣品，按照南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒說明制備10%組織勻漿液，取出上清液分裝后置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。腸道上清液用于測定消化酶［淀粉酶（AMS）、胰蛋白酶（Trp）和LPS］活性，肝胰腺上清液用于測定抗氧化指標(biāo)［SOD、過氧化氫酶（CAT）和丙二醛（MDA）］。所有樣品測定總蛋白濃度，具體步驟按試劑盒說明進(jìn)行操作。

1. 4. 2 免疫相關(guān)基因表達(dá)量測定 每個重復(fù)選取6尾凡納濱對蝦的鰓組織樣品，按照TaKaRa RNAiso Plus試劑盒說明提取總RNA。根據(jù)FastQuant RT Kit試劑盒說明將總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，設(shè)計特異性引物（表2），以18S為內(nèi)參基因，通過TaKaRa相對熒光定量試劑盒檢測免疫相關(guān)基因表達(dá)情況，每個樣品3次重復(fù)，并以2-ΔΔCt法換算且的基因相對表達(dá)量。

1. 5 消化道細(xì)菌高通量測序分析

凡納濱對蝦腸道樣品送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行腸道微生物分析。提取腸道細(xì)菌總DNA，并針對細(xì)菌16S rRNA序列V3～V4區(qū)設(shè)計含Barcode的特異性引物515F（5'-GTGCCAGCMG CCGCGGTAA-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTW TCTAAT-3'），進(jìn)行PCR擴(kuò)增。通過Illumina Miseq?/HiseqTM測序得到的原始圖像數(shù)據(jù)文件經(jīng)堿基識別（Base calling）分析轉(zhuǎn)化為原始序列（Raw date），結(jié)果以FASTQ文件格式存儲（舒迎霜等，2020；郝賀等，2021）。Raw date經(jīng)質(zhì)量分析，去除測序接頭、低質(zhì)量讀段及N比例大于10%的序列及長度過短序列后得到有效序列（Clean date），再利用Uparse v7.0.1001（http：//www.drive5.com/uparse/）對Clean date進(jìn)行OTUs聚類分析；同時選取OTUs代表序列進(jìn)行物種注釋，通過BLASTn比對篩選出最佳比對結(jié)果并過濾（閾值范圍0.9～1.0），不滿足條件的序列則歸為Unclassified。利用QIIME v1.9.1計算凡納濱對蝦腸道菌群Alpha多樣性指數(shù)（ACE、Chao1、Simpson和Shannon）（陳儉等，2022），使用GraphPad Prism 8.0對比多個樣本在不同分類水平上的群落結(jié)構(gòu)，并將相對豐度大于1%的物種歸為優(yōu)勢物種。

1. 6 統(tǒng)計分析

利用SPSS 20.0對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)、單因素方差分析（One-way ANOVA）及Duncans多重比較。

2 結(jié)果與分析

2. 1 XOS對凡納濱對蝦生長性能的影響

在不同XOS添加量和低鹽脅迫條件下，凡納濱對蝦的生長性能指標(biāo)見圖1。其中，HS0組凡納濱對蝦的各項(xiàng)指標(biāo)均顯著高于LS0組（P<0.05，下同），各低鹽脅迫組凡納濱對蝦的增重率、特定生長率、肥滿度、肝體指數(shù)和存活率均隨飼料中XOS添加量的增加呈上升趨勢。相對于LS0組，LS1000組凡納濱對蝦的各項(xiàng)生長指標(biāo)均顯著升高，LS500組凡納濱對蝦的增重率、特定生長率和存活率呈顯著升高趨勢，而LS250組凡納濱對蝦的各項(xiàng)指標(biāo)無顯著變化（P>0.05，下同）。

2. 2 XOS對凡納濱對蝦消化酶和抗氧化指標(biāo)的影響

在不同XOS添加量和低鹽脅迫條件下，凡納濱對蝦的腸道消化酶活性和肝胰腺抗氧化指標(biāo)見圖2。與HS0組相比，LS0組凡納濱對蝦的AMS活性和MDA含量顯著升高，而Trp和LPS活性顯著降低。各低鹽脅迫組凡納濱對蝦的消化酶活性及抗氧化性能均隨飼料中XOS添加量的增加而逐漸提高，其中，LS500和LS1000組凡納濱對蝦的AMS活性顯著高于LS0組，LS500組凡納濱對蝦的CAT活性顯著高于LS0組，MDA含量則表現(xiàn)為LS500和LS1000組凡納濱對蝦顯著低于LS0組。

2. 3 XOS對凡納濱對蝦免疫相關(guān)基因表達(dá)量的影響

在不同XOS添加量和低鹽脅迫條件下，凡納濱對蝦鰓組織中免疫相關(guān)基因的表達(dá)情況見圖3。與HS0組相比，LS0組凡納濱對蝦鰓組織中的酚氧化酶原（proPO）、抗脂多糖因子（ALF）、溶菌酶（LZM）、Toll樣受體1（TLR1）、Toll樣受體2（TLR2）和Toll樣受體3（TLR3）基因的相對表達(dá)量均有所下降，但差異不顯著。各低鹽脅迫組凡納濱對蝦鰓組織中免疫相關(guān)基因相對表達(dá)量均隨飼料中XOS添加量的增加呈上升趨勢，其中，LS500和LS1000組凡納濱對蝦免疫相關(guān)基因的相對表達(dá)量均顯著高于LS0組，而LS250組凡納濱對蝦的ALF、LZM、TLR1、TLR2和TLR3基因相對表達(dá)量與LS0組無顯著差異。

2. 4 XOS對凡納濱對蝦腸道菌群結(jié)構(gòu)組成及多樣性的影響

高通量測序分析結(jié)果顯示，每個樣本序列平均長度為420.66 bp。由表3可知，LS1000組凡納濱對蝦腸道菌群的Shannon指數(shù)、Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)均顯著高于LS0組凡納濱對蝦，Simpson指數(shù)顯著低于LS0組凡納濱對蝦，而LS250和LS500組凡納濱對蝦的腸道菌群物種多樣性及豐富度與LS0組凡納濱對蝦無顯著差異。對比各低鹽脅迫組的凡納濱對蝦腸道樣品發(fā)現(xiàn)，在門分類水平下凡納濱對蝦腸道中的優(yōu)勢菌群依次為變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidota）、藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobacteria_Chloroplast）、厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteriota）、疣微菌門（Verrucomicrobia）和浮霉菌門（Planctomycetes）。與LS0組相比，LS500和LS1000組凡納濱對蝦腸道變形菌門和擬桿菌門的相對豐度顯著降低，LS1000組凡納濱對蝦腸道藍(lán)細(xì)菌門、厚壁菌門和疣微菌門的相對豐度顯著增高，LS500組凡納濱對蝦腸道藍(lán)細(xì)菌門和放線菌門的相對豐度也顯著增高（圖4）。在屬分類水平上，凡納濱對蝦腸道菌群中排名前10的優(yōu)勢菌群分別為弧菌屬（Vibrio，占30.92%）、黃海綿菌屬（Spongiimonas，占6.04%）、斯氏弓型菌屬（Arcobacter，占5.23%）、希瓦氏菌屬（Shewanella，占5.21%）、葡萄球狀菌屬（Staphylococcus，占2.14%）、腸球菌屬（Enterococcus，占1.87%）、鏈霉菌屬（Streptophyta，占1.69%）、節(jié)桿菌屬（Arthrobacter，占0.65%）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus，占0.17%）和不動桿菌屬（Acinetobacter，占0.17%）。與LS0組相比，LS1000組凡納濱對蝦腸道弧菌屬、黃海綿菌屬、斯氏弓型菌屬、希瓦氏菌屬的相對豐度顯著降低，乳酸桿菌屬和不動桿菌屬的相對豐度則顯著增加（圖5）。

3 討論

3. 1 XOS對凡納濱對蝦生長性能和消化酶的影響

甲殼動物通過食物獲取的能量主要用于自身生長、繁殖和基礎(chǔ)代謝。據(jù)報道，淡化養(yǎng)殖的凡納濱對蝦增重率和存活率較低（Li et al.，2007），可能是由于機(jī)體需要更多能量用于調(diào)節(jié)自身滲透壓平衡，而導(dǎo)致其生長速率降低。腸道作為機(jī)體的重要消化器官，其分泌的消化酶對各種營養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收和轉(zhuǎn)化起決定性作用，即消化酶活性反映著機(jī)體的消化水平，與機(jī)體的生長指數(shù)呈正相關(guān)（Ziaei-Nejad et al.，2006）。已有研究表明，在飼料中添加XOS，異育銀鯽（熊沈?qū)W，2005）、凡納濱對蝦（陳曉瑛等，2014）、刺參（Apostichopus japonicas Selenka）（梁超，2011）、草魚（Zhang et al.，2020）和奧尼羅非魚（Poolsawat et al.，2021）等生物的生長性能及消化酶活性均有所提高。本研究通過在基礎(chǔ)飼料中添加XOS，經(jīng)過56 d的飼養(yǎng)試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)凡納濱對蝦的生長性能指標(biāo)隨著XOS添加量的增加而逐漸提高，其中LS1000組凡納濱對蝦的增重率、特定生長率、肥滿度、肝體指數(shù)及存活率均顯著高于LS0組凡納濱對蝦，接近于海水對照組（HS0）凡納濱對蝦。此外，LS1000組凡納濱對蝦腸道AMS活性顯著高于LS0組凡納濱對蝦，Trp和LPS活性也隨XOS添加量的增加呈上升趨勢，說明XOS能有效提高低鹽脅迫下凡納濱對蝦的生長性能。

3. 2 XOS對凡納濱對蝦抗氧化性能和免疫相關(guān)基因表達(dá)量的影響

低鹽脅迫可誘導(dǎo)對蝦機(jī)體氧化應(yīng)激而產(chǎn)生過量活性氧（ROS）及免疫力下降等問題（Claus et al.，2016），過量的ROS易導(dǎo)致細(xì)胞遺傳物質(zhì)和機(jī)體功能損傷（Soleimani et al.，2012）。SOD是生物體內(nèi)的一種抗氧化金屬酶，能分解ROS生成O2和H2O2，避免ROS對機(jī)體造成損傷（Fletcher，1986）；CAT能促進(jìn)H2O2分解成H2和自由氧，維持體內(nèi)活性氧的動態(tài)平衡（Viarengo et al.，1991）；H2O2易導(dǎo)致機(jī)體形成脂質(zhì)過氧化物而進(jìn)一步分解生成MDA，因此MDA含量可反映細(xì)胞受損及脂質(zhì)過氧化程度（Zheng et al.，2020）。本研究結(jié)果表明，低鹽脅迫顯著降低了凡納濱對蝦的抗氧化性能，通過在飼料中添加XOS，凡納濱對蝦的抗氧化性能逐漸升高，其中LS500和LS1000組凡納濱對蝦的CAT活性顯著高于LS0組凡納濱對蝦，而MDA含量顯著低于LS0組凡納濱對蝦。陳曉瑛等（2014）研究發(fā)現(xiàn)，在正常鹽度條件下，飼料中添加400或600 mg/kg XOS可顯著降低凡納濱幼蝦血清MDA含量，有效提高肝胰腺中的抗超氧陰離子自由基（Anti-O2-·）活力。在類似結(jié)論還有報道，飼料中添加XOS同樣能有效提高異育銀鯽（熊沈?qū)W，2005）和奧尼羅非魚（張榮斌等，2011）的抗氧化能力。可見，飼料中添加500或1000 mg/kg XOS能有效提高凡納濱幼蝦在低鹽脅迫中應(yīng)對氧化應(yīng)激的能力，緩解低鹽脅迫導(dǎo)致肝胰腺脂質(zhì)過氧化造成的機(jī)體細(xì)胞損傷。

無脊椎動物無特異性免疫系統(tǒng)，先天免疫系統(tǒng)是其防止外源致病菌入侵的重要防線（Li and Xiang，2013）。酚氧化酶系統(tǒng)是無脊椎動物先天免疫防御中的重要組成部分，而proPO基因是酚氧化酶系統(tǒng)中的上游關(guān)鍵基因，活化的proPO最終導(dǎo)致黑色素及有毒活性中間體產(chǎn)生，其中中間體參與無脊椎動物的先天免疫防御（Cerenius et al.，2008；Amparyup et al.，2013；Charoensapsri et al.，2014）。ALF作為抗菌肽在凡納濱對蝦的先天免疫中發(fā)揮重要作用，不僅可抵御外來病原體的入侵，還能排解自身的代謝產(chǎn)物（Nam et al.，2018；Zhou et al.，2019）。LZM同樣在無脊椎動物免疫防御系統(tǒng)中扮演著重要角色，通過溶解致病菌細(xì)胞壁的不溶性黏多糖而促進(jìn)致病菌分解（Sotelo-mundo et al.，2003）。Toll樣受體（TLR）是先天免疫系統(tǒng)中主要的模式識別受體（PRR）之一（Akira et al.，2006），可幫助細(xì)胞識別外源或內(nèi)源遺傳物質(zhì)，從而啟動機(jī)體的免疫反應(yīng)，調(diào)控下游干擾素分泌，促進(jìn)促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生，抵抗細(xì)菌或病毒的侵染（Takeshita and Ishii，2008）。本研究結(jié)果表明，低鹽脅迫降低了凡納濱對蝦的免疫能力，通過在飼料中添加XOS，其免疫相關(guān)基因的相對表達(dá)量逐漸提高，其中LS1000組凡納濱對蝦鰓組織proPO、ALF、LZM、TLR1、TLR2和TLR3基因的相對表達(dá)量顯著高于海水對照組（HS0）。有研究表明，飼料中添加8.0或10.0 mg/g低聚果糖（Fructo oligosaccharide，F(xiàn)OS）可提高克氏原鰲蝦（Procambarus clarkii）的proPO基因相對表達(dá)量（Dong and Wang，2013）；飼料中添加5 mg/g菊粉和甘露寡糖（Mannan oligosaccharide，MOS）可顯著提高凡納濱對蝦的proPO、ALF和Toll基因相對表達(dá)量（Li et al.，2018）。此外，Cabrera-Stevens等（2022）通過高通量測序發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加0.02 g/kg姜黃和瑪咖也可提高凡納濱對蝦Toll基因相對表達(dá)量。可見，在飼料中添加1000 mg/kg XOS能有效提高凡納濱對蝦在低鹽脅迫下的免疫能力，降低病原體侵染風(fēng)險，最終維持對蝦在低鹽脅迫下的健康狀態(tài)。

3. 3 XOS對凡納濱對蝦腸道菌群多樣性及組成結(jié)構(gòu)的影響

宿主腸道菌群多樣性易受周圍環(huán)境條件、健康狀況及食物種類等因素的影響，而腸道菌群結(jié)構(gòu)又影響宿主的能量代謝和免疫應(yīng)答等功能（Claus et al.，2016；Hou et al.，2018；王飛飛等，2022）。由于凡納濱對蝦缺乏特異性免疫，擁有較高的Alpha多樣性說明機(jī)體具有對外界病原菌的高免疫能力及環(huán)境變化的高適應(yīng)性（Xiong et al.，2018）。在本研究中，LS1000組凡納濱對蝦腸道菌群Alpha多樣性顯著高于LS0組凡納濱對蝦，即在飼料中添加1000 mg/kg XOS能有效提高凡納濱對蝦腸道菌群物種多樣性及豐富度，在異育銀鯽（謝芳等，2020）的相關(guān)研究中也得出相似結(jié)論。低鹽脅迫后凡納濱對蝦腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化，LS500和LS1000組凡納濱對蝦腸道中的變形菌門相對豐度顯著低于LS0組凡納濱對蝦，而厚壁菌門和疣微菌門相對豐度顯著高于LS0組凡納濱對蝦。已有研究表明，變形菌門相對豐度的增加通常出現(xiàn)在生長緩慢和染病的凡納濱對蝦腸道中，而疣微菌門和厚壁菌門能降解腸道中不易消化的多糖并提高腸道結(jié)合力（黃曉飛和陸穎理，2014）。在水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)中，弧菌屬的部分細(xì)菌是造成疾病的致病菌，而乳酸桿菌屬可促進(jìn)蝦蟹新陳代謝，為機(jī)體提供必需氨基酸及各種維生素，改善消化酶活性，進(jìn)而促進(jìn)其生長（王國霞等，2010）；乳酸桿菌還具有免疫調(diào)節(jié)作用，包括促進(jìn)細(xì)胞分裂、促進(jìn)抗體產(chǎn)生及活化巨噬細(xì)胞等功能（章文明等，2012）。本研究結(jié)果顯示，隨著XOS添加量的增加，凡納濱對蝦腸道益生菌的相對豐度逐漸升高，而致病菌相對豐度顯著降低，其中LS1000組凡納濱對蝦腸道的乳酸桿菌屬相對豐度顯著升高、弧菌屬相對豐度顯著下降，與胡曉偉等（2018）的研究結(jié)果相似。陳曉瑛（2012）研究發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加600 mg/kg XOS，凡納濱對蝦腸道細(xì)菌種類總數(shù)和雙歧桿菌數(shù)量顯著高于對照組，弧菌數(shù)量則顯著降低。綜上所述，XOS可抑制凡納濱對蝦淡化養(yǎng)殖過程中致病菌的生長，同時刺激益生菌生長，進(jìn)而提高宿主免疫能力。

4 結(jié)論

低鹽脅迫下在基礎(chǔ)飼料中添加500～1000 mg/kg XOS，可顯著提高凡納濱對蝦生長速率、抗氧化性能、免疫相關(guān)基因表達(dá)及改善腸道菌群組成結(jié)構(gòu)，有效提高對蝦在低鹽脅迫下的養(yǎng)殖效果，即XOS可作為凡納濱對蝦淡化養(yǎng)殖飼料添加劑進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）