ZIF-8 負(fù)載的吲哚菁綠光熱治療常見菌感染的研究

魯旭，杜亭亭，方遠(yuǎn)，王曉敏

（1.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院保健醫(yī)療部，天津300052；2.天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，食品營養(yǎng)與安全國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457；3.天津中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，天津 301617）

致病菌侵入宿主后，所產(chǎn)生的毒素和其他代謝產(chǎn)物能夠引起局部或全身性感染[1]，嚴(yán)重情況下可造成膿毒血癥、感染性休克等并發(fā)癥，是造成全球范圍內(nèi)人類死亡的主要原因之一。全球每年超200萬人因大腸桿菌（E.coli）感染死亡[2]，約20%的細(xì)菌性食物中毒由金黃色葡萄球菌（S.aureus）引起[3]?？股刈鳛槟壳爸委熂?xì)菌感染類疾病的首選藥物，因過度使用和濫用，導(dǎo)致抗生素耐藥菌株的出現(xiàn)，對人類健康造成了更大的威脅，敦促替代治療手段加速普及。近年來，光熱治療（PTT）為抗菌治療提供了新的途徑。PTT 是通過光熱試劑在近紅外激光照射下，有效地將光能轉(zhuǎn)化為熱能并造成局部過熱，從而殺死病原體，與傳統(tǒng)抗菌方法相比，有效規(guī)避了細(xì)菌耐藥性問題并能實(shí)現(xiàn)多策略協(xié)同治療[4]。光熱試劑吲哚菁綠（ICG）是一種具有較高的光熱轉(zhuǎn)換效率的兩親性碳菁染料，廣泛應(yīng)用于光熱治療[5]、光動(dòng)力治療[6]和熒光實(shí)時(shí)成像[7]等領(lǐng)域。然而ICG 極易受生理?xiàng)l件下分子自聚集和近紅外照射下光熱降解等因素干擾而大幅降低自身治療性能[8]，嚴(yán)重制約了其實(shí)際應(yīng)用前景，改良方案卻鮮有報(bào)道。類沸石咪唑酯骨架材料（ZIF）是一種具有四面體拓?fù)錁?gòu)型的類沸石結(jié)構(gòu)材料，由Zn 或Co 與咪唑類配體組成[9]，化學(xué)穩(wěn)定性高，在高溫及水環(huán)境下可以保持穩(wěn)定的框架結(jié)構(gòu)[10]。為此，本研究選擇具有良好穩(wěn)定性、生物相容性、低細(xì)胞毒性的金屬有機(jī)框架材料ZIF-8 負(fù)載ICG，通過便捷一步法構(gòu)建出PTT 性能穩(wěn)定優(yōu)良的ZIF-8@ICG 納米復(fù)合顆粒，在治療E.coli和S.aureus等常見菌感染的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中展現(xiàn)理想效果，為ICG 的臨床應(yīng)用提供了有效思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

ICG（純度為99%）購于西格瑪奧德里齊公司；無水乙醇、無水甲醇（天津化學(xué)試劑一廠）；金黃色葡萄球菌、大腸桿菌（北京鼎國生物技術(shù)公司）；六水合硝酸鋅（上海麥克林生化試劑有限公司）；二甲基咪唑（上海阿拉丁科技有限公司）；NaCl、KCl、Na2HPO4、KH2PO4（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；酵母提取物、胰蛋白胨（青島海博生物科技有限公司）。

1.1.2 主要儀器

紅外熱像儀（FLIR E50，東方嘉儀電子科技有限公司）；近紅外光熱轉(zhuǎn)換裝置（FC-808，上海熙隆光電科技有限公司）；集熱式恒溫加熱磁力攪拌（DF-101D，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；UV-vis 吸收光譜儀（UV-1800，島津公司）；恒溫震蕩箱（HAQ-F，哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)有限公司）；微量臺式高速離心機(jī)（H1650-W，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）；渦旋振蕩器（MX-S，Scilogex）；超聲波清洗機(jī)（SB-120DT，寧波新芝生物科技股份有限公司）；超純水系統(tǒng)（Millipore Milli-Q，Elix Technology Inside）；電子分析天平（BT25S，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）

1.2 方法

1.2.1 ZIF-8@ICG 納米復(fù)合顆粒的制備

用分析天平精確稱取0.05 g 的ICG 和0.148 g 的六水合硝酸鋅，加入10 ml 甲醇溶液。將其放到超聲處理裝置中使其充分溶解，得到溶液A。用分析天平精確稱取0.328 g 二甲基咪唑和0.05 g 的ICG，加入10 ml 甲醇溶液，將其放到超聲處理裝置中使其充分溶解，得到溶液B。然后將溶液B 在室溫條件下倒入溶液A 中，將其放置于攪拌速度為600 rpm 的磁力攪拌器上，在室溫下攪拌1.5 h 充分反應(yīng)。將產(chǎn)物放到離心機(jī)中，經(jīng)11 000 rpm 離心5 min 后，用無水甲醇洗滌數(shù)次，得到綠色ZIF-8@ICG 粉末（0.43 g；產(chǎn)率93.5%）。

1.2.2 ZIF-8@ICG 納米復(fù)合顆粒的表征

使用濃度為10 mmol/L 的甲醇溶液作為緩沖液，分別配制ICG 溶液、ZIF-8 溶液、ZIF-8@ICG 溶液，使用紫外可見吸收光譜儀檢測樣品的吸光度，檢測波長范圍為400～900 nm。

1.2.3 光熱轉(zhuǎn)化性能測定

配制不同濃度的ZIF-8@ICG 溶液（0.05、0.1、0.2、0.5 和1 mg/ml）。取樣后經(jīng)808 nm，1.5 W/cm2的近紅外光分別照射5 min。用紅外熱像儀記錄不同溶液的溫度隨時(shí)間變化的關(guān)系，并每隔30 s 拍攝對應(yīng)圖片記錄不同樣品的升溫情況。

1.2.4 光熱循環(huán)穩(wěn)定性測試

分別取ZIF-8@ICG 溶液和ICG 溶液接受808 nm，1.5 W/cm2的近紅外光照射5 min，每隔30s 用熱成像儀拍照，記錄對應(yīng)的溫度變化。待樣品慢慢冷卻恢復(fù)室溫后再用相同功率激光照射5 min，每30 s 記錄一次溫度變化，共往復(fù)3 次升降溫循環(huán)。通過ZIF-8@ICG 與ICG 的熱循環(huán)穩(wěn)定性的對比，來研究ZIF-8@ICG 和ICG 的光熱穩(wěn)定性。

1.2.5 光熱殺菌性能測試

將PBS 緩沖液、ZIF-8 溶液、ICG 溶液、ZIF-8@ICG 溶液分別與1×106CFU/ml 金黃色葡萄球菌和大腸桿菌懸浮菌液混合，每個(gè)菌種抗菌實(shí)驗(yàn)各分為8 組：PBS 對照組、PBS 實(shí)驗(yàn)組、ZIF-8 對照組、ZIF-8 實(shí)驗(yàn)組、ICG 對照組、ICG 實(shí)驗(yàn)組、ZIF-8@ICG 對照組、ZIF-8@ICG 實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組均接受808 nm，1.5 W/cm2的近紅外光照處理20 min，對照組無光照處理。隨后取樣涂布于LB 固體培養(yǎng)基中37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h，分別記錄各組金黃色葡萄球菌/大腸桿菌的菌落數(shù)量，并比較實(shí)驗(yàn)組樣品和對照組樣品的滅菌效果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)以（±s）表示，多組間比較采用方差分析，組間多重比較用LSD-t 檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ZIF-8@ICG 納米復(fù)合顆粒的表征

由圖1 可知，ZIF-8@ICG 納米復(fù)合顆粒在660～860 nm 之間有吸收，其中在782 nm 處有特征峰，與ICG 的吸收峰型（在780nm 處有特征峰）相似，同時(shí)因與此范圍內(nèi)無特征性吸收峰的ZIF-8 負(fù)載稀釋了單位濃度的絕對含量，納米復(fù)合顆粒的吸收強(qiáng)度弱于相同濃度的ICG 對照組，上述數(shù)據(jù)均證明ICG已與ZIF-8 形成穩(wěn)定的ZIF-8@ICG 納米負(fù)載結(jié)構(gòu)。

圖1 ICG、ZIF-8@ICG 和ZIF-8 的紫外可見吸收光譜

2.2 ZIF-8@ICG 的光熱性能測試

ZIF-8@ICG 溶液（0.2 mg/ml）經(jīng)過5min 的近紅外光照射（808nm，1.5 W/cm2）溫度可升高30.4℃，濃度升高至1 mg/ml 的溶液最高溫度可達(dá)到72.3℃，而對照組純水僅升高了2.4℃。同時(shí)拍攝的熱值圖亦顯示了相同的結(jié)果，ZIF-8 的包裹負(fù)載作用對ICG 結(jié)構(gòu)將近紅外光能轉(zhuǎn)化為熱能的過程無不良影響，ZIF-8@ICG 整體結(jié)構(gòu)具有良好的光熱轉(zhuǎn)化性能，見圖2A、2B。

圖2 ZIF-8@ICG 的光熱性能測試

2.3 ZIF-8@ICG 與ICG 光熱循環(huán)穩(wěn)定性對比實(shí)驗(yàn)

經(jīng)過近紅外激光（5 min ，808 nm，1.5 W/cm2）第1 個(gè)照射周期后，ZIF-8@ICG 納米復(fù)合顆粒和未經(jīng)負(fù)載的ICG 的溫度分別升至56.3 ℃和55.7 ℃。經(jīng)第2 個(gè)激光照射周期后，未經(jīng)負(fù)載的ICG 最高溫度僅為37.2℃，且還在持續(xù)減弱，說明其受自聚集和光熱降解等因素影響光熱轉(zhuǎn)化性能已大幅降低。與之相比，在經(jīng)歷了第2、3、4 個(gè)激光照射周期后，ZIF-8@ICG 納米復(fù)合顆粒的最高溫度仍舊升高至50 ℃、47.1 ℃、43.6℃，表明ZIF-8@ICG 納米復(fù)合顆粒有效增強(qiáng)了光熱穩(wěn)定性，改善了ICG 分子溶液中自聚集的問題，具有更加理想的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，見圖3。

圖3 ZIF-8@ICG 與ICG 光熱循環(huán)穩(wěn)定性對比實(shí)驗(yàn)

2.4 ZIF-8@ICG 納米復(fù)合顆粒的光熱殺菌實(shí)驗(yàn)

經(jīng)近紅外光（808 nm，1.5 W/cm2）照射后，ZIF-8@ICG 納米復(fù)合顆粒對S.aureus和E.coli的殺菌率分別為99.97%和99.91%，優(yōu)于未經(jīng)負(fù)載的ICG對照組（80%和85%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），見圖4～圖6。

圖5 ZIF-8@ICG 和ICG 光熱處理后金黃色葡萄球菌的存活菌落圖

圖6 ZIF-8@ICG 和ICG 光熱處理后大腸桿菌的存活菌落圖

3 討論

3.1 ZIF-8@ICG 納米復(fù)合顆粒的光熱性能及其循環(huán)穩(wěn)定性研究

ICG 因其良好的組織滲透性、生物安全性及光熱轉(zhuǎn)換效率等特性[13，14]，是被美國藥物管理局（FDA）批準(zhǔn)的應(yīng)用于臨床研究的唯一一種近紅外光熱試劑[15]，在PTT 抗癌[16]、抗菌[17]等領(lǐng)域得到廣泛研究，然而ICG 穩(wěn)定性較差且在人體內(nèi)的半衰期短，嚴(yán)重影響其光熱治療效果，因此，通過提高ICG 穩(wěn)定性以加強(qiáng)其光熱殺菌效果具有重要意義。本研究通過ZIF-8 中Zn2+與ICG 磺酸基的配位作用制備出ZIF-8@ICG 納米復(fù)合顆粒，并通過紫外可見吸收光譜表征驗(yàn)證其負(fù)載結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。通過光熱轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在808 nm 近紅外光照射下，ZIF-8@ICG 溶液的升溫曲線與濃度呈正相關(guān)，且在1 mg/ml 濃度下最高溫度可達(dá)到72.3℃，ZIF-8@ICG 整體結(jié)構(gòu)具有良好的光熱轉(zhuǎn)化性能，可用于進(jìn)行細(xì)菌的光熱滅活。通過熱循環(huán)穩(wěn)定性對比還發(fā)現(xiàn)，ZIF-8 的包覆作用顯著增強(qiáng)了ICG 的光熱穩(wěn)定性，避免了溶液中ICG 分子自聚集現(xiàn)象，歷經(jīng)4 次循環(huán)利用后仍產(chǎn)生20℃以上的升溫效果，保持了良好穩(wěn)定的光熱轉(zhuǎn)化性能，具有更加理想的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

3.2 ZIF-8@ICG 納米復(fù)合顆粒的光熱殺菌性能研究

世界衛(wèi)生組織（WHO）于2017 年提出亟須研發(fā)針對S.aureus和E.coli等具有高感染性和高致死率的多發(fā)耐藥菌的治療新方案[11]。與傳統(tǒng)抗生素療法相比，PTT 回避了耐藥性問題。作為PTT 的治療核心，光熱轉(zhuǎn)換劑能夠通過近紅外激光照射有效地將光能轉(zhuǎn)化為熱能，從而直接殺死病原體[12]。本研究通過光熱殺菌實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在近紅外光照射后，ZIF-8@ICG納米復(fù)合顆粒對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的殺菌率均接近100%，明顯優(yōu)于未經(jīng)負(fù)載的ICG 對照組。以上結(jié)果均證實(shí)ZIF-8@ICG 溶液吸收近紅外激光的能量后將光能轉(zhuǎn)化為熱能，升高的溶液溫度殺滅了金黃色葡萄球菌和大腸桿菌，且滅菌效果顯著，達(dá)到了基于ZIF-8@ICG 納米顆粒光熱殺菌的目的。

3.3 總結(jié)與展望

利用ZIF-8@ICG 納米復(fù)合顆粒構(gòu)建的新型光熱殺菌療法，操作簡便，可重復(fù)利用，光熱穩(wěn)定性好，具有高效的光熱轉(zhuǎn)化性能，經(jīng)近紅外激光照射后對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌等常見菌感染展現(xiàn)出理想的光熱殺菌效果。由于PPT 療法物理特性的治療機(jī)制，在治療細(xì)菌感染（特別是耐藥菌感染）中具有極強(qiáng)的廣譜性并避免新的耐藥菌產(chǎn)生，ZIF-8@ICG 療法有望產(chǎn)生臨床轉(zhuǎn)化及應(yīng)用價(jià)值。