苯二氮 類藥物檢測提取技術(shù)的研究進展*

陳曉兵，李慧文，戴欣成，周 全，沙 鷗，吳赟帆，王滋文

（1.江蘇海洋大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 連云港 222005；2.連云港市第一人民醫(yī)院，江蘇 連云港 222061；3.江蘇海洋大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，江蘇 連云港 222005；）

在我國，每年約有480 萬重癥醫(yī)學(xué)科（Intensive Care Unit，ICU）患者，其中接受鎮(zhèn)靜治療的患者占64%。為了幫助和改善患者睡眠、減輕和消除患者焦慮以及減輕患者器官應(yīng)激負(fù)荷，保護器官儲備功能，維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，研究者們一直在尋找一種能快速起效、有效鎮(zhèn)靜、安全指數(shù)高且副作用小的理想鎮(zhèn)靜藥。苯二氮 類藥物（Benzodiazepines，BZDs）是目前ICU 應(yīng)用廣泛的鎮(zhèn)靜治療基本藥物，屬于第二代鎮(zhèn)靜催眠藥。該類藥物主要通過與腦內(nèi)苯二氮 受體結(jié)合，促進γ 氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）與γ 氨基丁酸A 型受體結(jié)合，增加氯離子通道的開放頻率，從而增強GABA 能神經(jīng)的抑制效應(yīng)，導(dǎo)致GABA 水平降低，去甲腎上腺素和多巴胺脫抑制性釋放，機體即產(chǎn)生鎮(zhèn)靜作用[1]。

自1961 年首個苯二氮 類藥物利眠寧誕生以來，已有近40 種結(jié)構(gòu)相近、藥理作用相似的該類藥物相繼應(yīng)用于臨床[2]，其中常見的主要有三唑侖（Triazolam）、地西泮（Diazepam）、咪達唑侖（Midazolam）、氯硝西泮（Clonazepam）、艾司唑侖（Estazdam）、瑞馬唑侖（Remimazolam）等。這些藥物的基本母核結(jié)構(gòu)為含氮的稠環(huán)1，4 苯并二氮雜 ，因結(jié)構(gòu)中都含有胺基，所以大多呈弱堿性，在強酸或強堿條件下易分解；另因具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)，所以熔點、沸點較高且難揮發(fā)[3]。此類藥物大多在肝藥酶作用下代謝，代謝產(chǎn)物最終與葡萄糖醛酸結(jié)合而失活，經(jīng)過腎臟排出。多數(shù)藥物的代謝產(chǎn)物具有與母體藥物相似的活性，而其半衰期（t1/2）則比母體藥物更長，因此在體內(nèi)易發(fā)生蓄積，產(chǎn)生不良反應(yīng)[4]。為了彌補此類藥物依賴肝腎代謝、易發(fā)生蓄積、半衰期延長等不足，專家學(xué)者們研制出了依賴血漿酯酶代謝的一類鎮(zhèn)靜新藥—瑞馬唑侖，并廣泛應(yīng)用于臨床。由于BZDs 原料藥物經(jīng)體內(nèi)代謝的代謝程度不同，所產(chǎn)生的后遺效應(yīng)亦不同，因此對不同來源樣品中苯二氮 類原料藥物的分析監(jiān)測在藥物分析、食品安全及法醫(yī)學(xué)鑒定中具有重要意義。

目前常用的有關(guān)BZDs 原料藥的分析檢測手段有免疫測定法、色譜法、光譜法等，常用的樣品前處理方法有液-液萃取法、固相萃取法、固相微萃取法等。本文整理了近年來國內(nèi)外發(fā)表的相關(guān)文獻，對不同來源樣品中苯二氮 類藥物的檢測手段和樣品前處理方法進行了全面的分析，以期為研究機構(gòu)和科研人員提供相關(guān)信息，并為BZDs 的科學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

1 苯二氮 類藥物的檢測技術(shù)

1.1 免疫測定法

免疫測定法是指利用免疫學(xué)原理，以待測物作為抗原或抗體從而測定樣品中待測物質(zhì)含量的方法。免疫化學(xué)技術(shù)通常作為篩選試驗，可確定微克級苯二氮 類藥物的存在。Rossi B 等[5]使用了兩種特異性較高的免疫測定法檢測了人體尿液中的部分苯二氮 類物質(zhì)，結(jié)果表明兩種方法檢測的物質(zhì)結(jié)果均為陽性，是可靠的篩查方法。Huang W 等[6]用4 種免疫測定法檢測血中去甲安定、三唑侖、洛拉西泮和阿普唑侖，結(jié)果表明檢出限為3.0ng/ml，當(dāng)濃度等于和低于1.0ng/ml 時，靈敏度受到限制。

1.2 聯(lián)用技術(shù)

聯(lián)用技術(shù)是指將色譜法、質(zhì)譜法、光譜法等分析方法聯(lián)合使用，以提高檢測的準(zhǔn)確度和精密度。

1.2.1 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（Gas Chromatographic-Mass Spectrometer，GC-MS）是將氣相色譜法與質(zhì)譜法結(jié)合，既彌補了GC 難以對復(fù)雜化合物中未知組分做出可靠的定性鑒定的缺點，又利用了鑒別能力很強且靈敏度極高的MS 作為檢測器，在環(huán)保、醫(yī)藥、農(nóng)藥和興奮劑等領(lǐng)域起著越來越重要的作用，是分離和檢測復(fù)雜化合物的最有力工具之一。

Papoutsis II 等[7]在pH 為9 的條件下，用氯仿對人體血漿樣品中地西泮等23 中常見的苯二氮 類藥物進行液-液萃取，建立GC-MS 分析方法并進行優(yōu)化，所有物質(zhì)的提取回收率均高于74.00%。Qriouet Z 等[8]通過固相萃取法對血漿樣品中的地西泮、阿普唑侖和氯硝西泮進行萃取，采用GC-MS 進行分析，該法測得地西泮、阿普唑侖和氯硝西泮的檢測限分別為0.09 μg/ml、0.20 μg/ml 和0.77 μg/ml。Drummer OH[9]采用簡單的液-液萃取法，通過GC-MS/MS 分析檢測全血樣品中的10 種苯二氮 類藥物，測得10種該類藥物的檢測限和定量限分別在0.02～0.53 ng/ml 和1.0～2.0 ng/ml 范圍內(nèi)。Liu JL 等[10]用四氫呋喃和正己醇組成的超分子溶劑對尿液中的9 種苯二氮類藥物進行分離富集，并采用GC-MS/MS 技術(shù)對該類藥物進行含量測定，結(jié)果表明GC-MS/MS 法測定的定量下限為0.2～5.0 ng/ml，提取回收率均大于81.12%。

1.2.2 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)

液-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，LC-MS）又叫液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，它以液相色譜作為分離系統(tǒng)，質(zhì)譜為檢測系統(tǒng)。樣品在質(zhì)譜部分和流動相分離，被離子化后，經(jīng)質(zhì)譜的質(zhì)量分析器將離子碎片按質(zhì)量數(shù)分開，經(jīng)檢測器得到質(zhì)譜圖。液質(zhì)聯(lián)用體現(xiàn)了色譜和質(zhì)譜優(yōu)勢的互補，將色譜對復(fù)雜樣品的高分離能力，與MS 具有高選擇性、高靈敏度及能夠提供相對分子質(zhì)量與結(jié)構(gòu)信息的優(yōu)點結(jié)合起來，在藥物分析、食品分析和環(huán)境分析等許多領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。

葉璞等[11]利用固相萃取結(jié)合HPLC-MS/MS 提取分析了醫(yī)院污水處理系統(tǒng)中的17 種苯二氮 類物質(zhì)，結(jié)果表明該類物質(zhì)的排放均達標(biāo)。Martin D 等[12]從犯罪現(xiàn)場的物品中用一次性拭子提取了表面苯二氮 類藥物的殘留，采用液-液微萃取結(jié)合HPLCHRMS/MS 系統(tǒng)進行定性和半定量分析，檢測限在1～14 pg/ml，提 取 回 收 率 在77%～107%。Garcia L等[13]采用LC-MS/MS 開發(fā)了人體尿液和血漿樣品中苯二氮 類藥物的分析方法，并討論了基于免疫分析的篩查方法的可行性，實驗結(jié)果表明所檢測的苯二氮 類藥物的檢測限均低于0.1 ng/ml。Mei V等[14]采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對于某死亡患者血液中的3-羥基苯那西泮、氯巴扎姆、氯硝唑侖等進行分析，血液樣品體積為0.5ml，采用固相萃取技術(shù)對上述分析物進行萃取分離，所得分析物的檢測限和定量限分別為0.5 ng/ml（信噪比＞3）和1 ng/ml，回收率在35%～90%。López-Rabu?al A 等[15]利用固相萃取技術(shù)與LC-MS/MS 聯(lián)用提取分析了胎糞樣品中的14 種苯二氮 類物質(zhì)，得到的檢測限為1～20 ng/g，提取回收率在35.9%～91.2%。

2 苯二氮 類藥物的提取技術(shù)進展

由于苯二氮 類藥物吸收快、代謝迅速且半衰期短[16]，所以在生物體液內(nèi)的濃度很低，如唑侖類藥物在血漿中的最大治療濃度僅為0.02～0.25 μg/ml[17]，這就為實驗室的檢驗工作帶來了一些難度。因此，選擇合適樣品前處理方法，富集目標(biāo)物并去除雜質(zhì)很重要。目前所使用的提取方法有以下幾種。

2.1 液-液萃取

液- 液 萃 取 法（Liquid-liquid extraction，LLE）是利用物質(zhì)在兩種互不相溶的溶劑中的溶解度或分配系數(shù)的不同，使物質(zhì)從一種溶劑內(nèi)轉(zhuǎn)移到另外一種溶劑中，經(jīng)過反復(fù)多次萃取，將待分析物提取出來。

Vogliardi S 等[18]以乙腈為萃取劑，采用低溫分配快速液-液萃取法提取分析了人體尿液中的地西泮、勞拉西泮等藥物，檢測限均低于5.0 μg/L，提取回收率在72.4%～100.4%，且線性良好。易小翠[19]考察了大鼠血漿和尿液中的氯硝西泮等藥物并優(yōu)化了萃取溶劑的類型、萃取時間、萃取次數(shù)等萃取條件，實驗結(jié)果表明在血漿樣品中加入5 倍體積的乙酸丁酯振蕩10 min 并提取一次得到的提取回收率較高，均大于90%；在尿液樣品中加入10 倍體積的乙酸乙酯振蕩10 min 并提取兩次得到的提取回收率較高，均大于80%。de Paula C 等[20]為了識別毒品犯罪，采用低溫分配液液萃取聯(lián)合紙噴霧質(zhì)譜法提取分析了飲料中的地西泮、氯硝西泮等物質(zhì)，結(jié)果表明檢測限為0.05 mg/L，提取回收率在90%～100%，在毒品犯罪領(lǐng)域有較好的研究前景。

2.2 固相萃取

固 相 萃 取 技 術(shù)（Solid Phase Extraction，SPE）是基于固-液相色譜理論發(fā)展而來的一項技術(shù)，通過選擇性吸附和選擇性洗脫對樣品進行富集分離凈化。由于固相萃取技術(shù)可提取微量待測物且避免液-液萃取的乳化現(xiàn)象，已成功應(yīng)用于苯二氮 類藥物的提取中。Stamper B 等[21]采用C18 柱快速提取人體尿液中的地西泮等21 中苯二氮 類藥物，過柱后用乙腈和甲醇按比例洗脫，并結(jié)合LC-MS/MS 進行檢測，檢測限為0.5ng/ml，平均回收率為91%。Anderson RA 等[22]對尸檢頭發(fā)樣本中的奧沙西泮等物質(zhì)利用ZSDAU 020 柱進行提取，并用乙酸乙酯進行洗脫，檢測限均低于0.6 ng/mg。楊霄等[23]利用C18 和N-丙基乙二胺作為吸附劑對水產(chǎn)品中的6 種苯二氮 類藥物進行提取凈化，并結(jié)合UPLC-MS進行檢測，檢測限為0.2～0.5 μg/kg，平均回收率為73.2%～110.6%。于峰等[24]同樣使用C18 和N-丙基乙二胺作為吸附劑對干血斑樣品中的奧沙西泮等物質(zhì)進行富集純化，實驗結(jié)果表明該固相萃取方法簡單、快速且靈敏度高。

2.3 固相微萃取

固相微萃取技術(shù)（Solid-Phase Microextraction，SPME）是在固相萃取技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種萃取手段，因其操作簡便、回收率高而被廣泛應(yīng)用。Abr?o LCC 等[25]以地西泮為模板，甲基丙烯酸為功能單體合成了分子印記聚合物，對血漿樣品中的苯二氮 類藥物直接進行萃取，并用HPLC-DAD 進行檢測，得到的檢測限為15 μg/L。Asgharinezhad AA等[26]合成了聚苯胺磁性納米復(fù)合物用于萃取人體血漿樣品中的勞拉西泮和硝西泮，并優(yōu)化了萃取條件，用HPLC-UV 進行檢測，得到的檢測限分別為0.2～2.0 μg/L、0.5～1.8 μg/L，提取回收率分別為84%～99%、90%～99%。Jinno K 等[27]利 用SPME 聯(lián) 合 半 微 柱高效液相色譜法提取分析了人體尿液樣品中的地西泮等物質(zhì)，實驗證明該方法簡便、快速、使用溶劑量少。

2.4 磁固相萃取

近年來，基于固相萃取技術(shù)發(fā)展而來的新技術(shù)—磁固相萃取技術(shù)（Micro-Solid Phase Extraction，MSPE）在食品、環(huán)境、醫(yī)藥等領(lǐng)域發(fā)揮著巨大的應(yīng)用潛力。MSPE 主要利用磁性或可磁化材料作為萃取劑對待測組分進行分離，通過外加磁鐵將吸附劑與樣品溶液分離。隨后通過合適的洗脫液對吸附在萃取劑上的待測物進行洗脫，進而進入儀器檢測。MSPE 因其操作簡便、萃取劑可重復(fù)使用、可避免基質(zhì)的干擾以及對痕量組分富集倍數(shù)高等優(yōu)點，在分離分析領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。

Plastiras OE 等[28]通過合成磁性納米復(fù)合物（氧化石墨烯-磁性殼聚糖）選擇性萃取地表水樣中的阿替唑侖及氟硝西泮，然后使用HPLC-PDA 進行檢測，得到的檢測限分別為3 ng/ml 及10 ng/ml，提取回收率在93.6%～112.9%，且線性良好。杜梨[29]以硅藻土（Dt）為固相支撐材料，用原位生長法制備了ZIF-8@Dt-COOH 固相吸附萃取劑，結(jié)合高效液相色譜-二極管陣列檢測，建立了人體尿液中三種苯二氮類藥物（三唑侖、咪達唑侖和地西泮）的分析方法，得到的提取回收率在80.0%～98.7%。

3 總結(jié)與展望

苯二氮 類藥物種類繁多，具有催眠、鎮(zhèn)靜、抗驚厥等藥理作用，臨床應(yīng)用廣泛，因此亟待開發(fā)更加靈敏、高通量、自動化的提取分析手段。本文旨在對不同來源樣品中的苯二氮 類藥物的檢測方法和提取手段進行綜述，為建立兼顧精準(zhǔn)度和推廣性的苯二氮 類藥物檢測的前處理和儀器檢測技術(shù)提供意見和發(fā)展方向。