響應(yīng)面法優(yōu)化萱草花總生物堿的提取工藝*

李盈，楊新惠，王琪

（1.石河子大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，新疆 石河子 832002；2.新疆植物藥資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/石河子大學(xué)藥學(xué)院，新疆 石河子 832002）

百合科萱草屬植物萱草（Hemerocallis fulvaL.），是民間傳統(tǒng)常用的中草藥，在我國(guó)各地栽培，根、莖、葉、花，均可入藥[1]。在民間傳統(tǒng)藥品使用中，萱草常用于醒腦安神、養(yǎng)血美顏、清熱解毒、通乳等[2]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)[3，4]，萱草具有抗腫瘤、抗菌、抗吸血蟲(chóng)、鎮(zhèn)靜催眠、抗抑郁、護(hù)肝保肝等藥理作用。且萱草中生物堿成分豐富，藥理活性好[5]。另有研究表明，萱草中含有秋水仙堿等生物堿類成分，具有減輕炎性反應(yīng)而起止痛作用的生物活性[6]。本研究分別運(yùn)用加熱回流法和超聲輔助法提取總生物堿，在單因素的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法對(duì)萱草花總生物堿的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，為該種植物的合理利用提供實(shí)驗(yàn)理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥材

萱草干花2 kg，在新疆百草堂藥業(yè)集團(tuán)購(gòu)得。（R）-Jatropham （由本課題組前期實(shí)驗(yàn)中，在此植物中所分離的化合物，因該單體化合物所得含量可以滿足此實(shí)驗(yàn)需求，并且純度達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)品所需，故選用該化合物為標(biāo)準(zhǔn)品），見(jiàn)圖1。

圖1 （R）-Jatropham 結(jié)構(gòu)式

1.1.2 試劑

無(wú)水乙醇、二氯甲烷（天津市富宇精細(xì)化工有限公司）；濃鹽酸（四川西隴化工有限公司）；其余化學(xué)試劑均為國(guó)藥集團(tuán)的分析純。

1.1.3 儀器

FW-100 型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)、DZKW-0-2 型電熱恒溫水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）；V-2401PC 型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本島津）；N-1300 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛(ài)朗儀器有限公司，東京理化器械株獨(dú)資工廠）；KQ-500DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Sartorius BS110s 型萬(wàn)分之一電子天平（北京賽多利斯天平有限公司制造）。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

參考文獻(xiàn)[7-10]，精確稱取本實(shí)驗(yàn)室自提純（R）-Jatropham 標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品16.25 mg，用無(wú)水乙醇溶解定容至250 ml。精密吸取對(duì)照品溶液0.30、0.45、0.60、0.75、0.90、1.20 ml 添加至10 ml 容量瓶里面進(jìn)行定容處理。以0.90 ml 對(duì)照品溶液測(cè)最大吸收波長(zhǎng)，無(wú)水乙醇為空白，于206 nm 波長(zhǎng)處對(duì)吸光度A 進(jìn)行測(cè)定，對(duì)照品溶液濃度C、吸光度值A(chǔ) 分別為橫坐標(biāo)、縱坐標(biāo)，以此完成標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。得回歸方程為A=0.0879 C+0.0363，R2= 0.9993，線性范圍1.95～7.80 μg/ml。

1.2.2 萱草花總生物堿的提取工藝及提取量計(jì)算

萱草花經(jīng)陰干粉碎后，過(guò)60 目篩。稱量萱草花粉末2.0 g，根據(jù)條件加入乙醇溶劑進(jìn)行超聲，抽濾，濾液旋干，加入約20 ml 1% HCl 使其溶解，超聲1 min，加入2.0 mol/L NaOH 約4.0 ml，pH 值調(diào)到10～11，然后對(duì)其進(jìn)行過(guò)濾處理，30 ml 二氯甲烷對(duì)濾液進(jìn)行萃取，重復(fù)3 次，萃取液合并，旋干，浸膏用乙醇溶解，定容，即得萱草花總生物堿。按照繪制（R）-Jatropham 標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法，測(cè)定萱草花總生物堿的吸光度A 值，根據(jù)式1 得出萱草花總生物堿的提取量。

式中：C、V、M 是萱草花總生物堿質(zhì)量濃度（μg/ml）、萱草花總生物堿定容后體積（ml）用萱草花粉末質(zhì)量（g）。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

通過(guò)Box-Behnken 中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)不斷優(yōu)化萱草花總生物堿提取工藝，以萱草花總生物堿提取含量為響應(yīng)值，Design-Expert10 軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析，建立回歸模型。

2 結(jié)果

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

本研究首先通過(guò)超聲時(shí)間、超聲溫度、乙醇濃度及物料比等因素進(jìn)行分析，確定實(shí)驗(yàn)因素與水平，然后進(jìn)行響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。

2.1.1 不同超聲時(shí)間對(duì)萱草花總生物堿提取量的影響

精密稱量萱草花粉末5 份，每份1.0 g，分別加入75%乙醇，物料比1∶10（g/ml），溫度為40℃，采用“1.2.2”的方法提取萱草花總生物堿，對(duì)不同超聲時(shí)間（10、15、20、25、30 min）帶給萱草花總生物堿提取量相應(yīng)影響情況加以評(píng)價(jià)。如圖2 所示，隨著超聲時(shí)間的逐漸增大，提取出的總生物堿含量先增加，在15 min 時(shí)出現(xiàn)最大值，后又減小，后又轉(zhuǎn)折增大，按照線性趨勢(shì)，后面時(shí)間有可能繼續(xù)增大超過(guò)15 min 的最大值，但是因時(shí)間因素以及儀器成本、損耗因素，超聲時(shí)間初步選為15 min。

圖2 超聲時(shí)間對(duì)萱草花中總生物堿提取量的影響

2.1.2 不同超聲溫度對(duì)萱草花總生物堿提取量的影響

精密稱量萱草花粉末5 份，每份1.0 g，分別加入75%乙醇，物料比1：10（g/ml），時(shí)間為25 min，采用“1.2.2”的方法提取萱草花總生物堿，評(píng)價(jià)不同超聲溫度（25、30、35、40、45℃）對(duì)萱草花總生物堿提取量的影響。如圖3 所示，超聲溫度慢慢升高，提取出總生物堿含量先增后減，超聲溫度達(dá)35℃，所提取總生物堿含量居于最高水平，主要與超聲溫度升高過(guò)程中，一些雜質(zhì)析出影響了生物堿的提取[11]，因此超聲溫度設(shè)為35 ℃。

圖3 超聲溫度對(duì)萱草花中總生物堿提取量的影響

2.1.3 不同乙醇濃度對(duì)萱草花總生物堿提取量的影響

精密稱量萱草花粉末5 份，每份1.0 g，物料比1：10（g/ml），時(shí)間為25 min，溫度為40 ℃，采用“1.2.2”的方法提取萱草花總生物堿，對(duì)不同濃度溶劑（55%、65%、75%、85%、95%）帶給萱草花總生物堿提取量相應(yīng)影響情況加以評(píng)價(jià)。如圖4 所示，乙醇濃度慢慢升高，萱草花總生物堿提取量不斷升高。乙醇濃度達(dá)75%，萱草花總生物堿提取量峰值也將出現(xiàn)。隨著乙醇濃度繼續(xù)增加總生物堿提取量下降，這可能是因?yàn)橐掖紳舛壤^續(xù)增加時(shí)一些揮發(fā)油或糖類等極性較低的物質(zhì)被提取出來(lái)，從而影響了生物堿溶出，降低生堿的提取量[12]，因此選75%乙醇為提取溶劑的濃度。

圖4 乙醇濃度對(duì)萱草花中總生物堿提取量的影響

2.1.4 不同物料比對(duì)萱草花總生物堿提取量的影響

精密稱量萱草花粉末5 份，每份1.0 g，分別加入75%乙醇，時(shí)間為25 min，溫度為40 ℃，采用“1.2.2”的方法提取萱草花總生物堿，評(píng)價(jià)不同物料比（1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16 g/ml）對(duì)萱草花總生物堿提取量的影響。如圖5 所示，隨著提取溶劑量的增加萱草花總生物堿的提取量隨之增加。固定乙醇濃度為75%，當(dāng)料液比為1∶10 時(shí)，總生物堿提取量出現(xiàn)峰值。繼續(xù)增加料液比，總生物堿提取量開(kāi)始下降。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是隨著溶劑體積的增大導(dǎo)致對(duì)萱草花的超聲不充分[13]，因此選1∶10（g/ml）為提取物料比。

圖5 物料比對(duì)萱草花中總生物堿提取量的影響

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化萱草花總生物堿提取結(jié)果

2.2.1 中心組合因素設(shè)計(jì)及結(jié)果分析

進(jìn)一步結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果顯示，選取乙醇濃度（A），超聲時(shí)間（B），物料比（C）和超聲溫度（D）為自變量，萱草花總生物堿提取含量（Y）為響應(yīng)值，通過(guò)Design-Expert 10 軟件的Box-Behnken 完成響應(yīng)面中心組合設(shè)計(jì)，對(duì)萱草花藥材總生物堿提取工藝加以優(yōu)化。因素水平及編碼見(jiàn)表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3。把表2 中數(shù)據(jù)通過(guò)Design-Expert 10 軟件完成多元模擬擬合分析，即可獲得以萱草花藥材中總生物堿提取量為目標(biāo)函數(shù)二次回歸方程：Y=2.54+0.1A-0.041B+0.026C-（3.333E-003）D-0.075AB+0.017AC+0.027AD-0.033BC+0.065BD+0.017CD-0.58A2-0.082B2-0.12C2-0.12D2。表3 結(jié)果顯示，模型的擬合度值為P＜0.0001，證明模型擬合度極顯著，可以理想的擬合各因素對(duì)萱草花總生物堿提取量的影響結(jié)果，模型的失擬項(xiàng)為0.4670，P＞0.05，代表失擬項(xiàng)不顯著，說(shuō)明此模型的實(shí)驗(yàn)誤差相對(duì)較小。根據(jù)響應(yīng)面結(jié)果可對(duì)相關(guān)因素對(duì)總生物堿提取含量帶來(lái)影響大小排序是：乙醇濃度（A）＞超聲時(shí)間（B）＞物料比（C）＞超聲溫度（D）。

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案與結(jié)果

表3 回歸方程方差分析

2.2.2 響應(yīng)面分析

響應(yīng)面法在對(duì)自變量最優(yōu)值進(jìn)行實(shí)際確定過(guò)程速度快、效率高的優(yōu)勢(shì)較為突出，為得響應(yīng)值最大化提供重要保障[14]。相關(guān)因素間兩兩交互也會(huì)影響萱草花中總生物堿提取含量結(jié)果，根據(jù)響應(yīng)面圖與等高線圖將其直觀反映出來(lái)，曲面坡度與等高線形狀對(duì)交互作用強(qiáng)弱具有直接決定影響，曲面坡度陡峭，等高線呈橢圓形代表兩個(gè)因素交互作用極強(qiáng)，反之較弱。本實(shí)驗(yàn)響應(yīng)面圖和等高線圖見(jiàn)圖6～圖11。可知，隨著各因素的增加，總生物堿提取含量是呈先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)溶劑濃度為75%，提取時(shí)間為15 min，物料比為1∶10（g/ml），超聲溫度為35 ℃時(shí)達(dá)到最大值。圖6 響應(yīng)面的坡度趨勢(shì)較陡，等高線為橢圓形，說(shuō)明乙醇濃度與超聲時(shí)間交互作用較強(qiáng)，對(duì)萱草花總生物堿的提取有顯著影響，乙醇濃度曲線比提取時(shí)間曲線陡峭，說(shuō)明乙醇濃度對(duì)總生物堿提取的影響大于超聲時(shí)間（A＞B）；圖7響應(yīng)面斜率較陡，等高線為橢圓形，表示乙醇濃度與物料比的交互作用較強(qiáng)，對(duì)總生物堿提取量有顯著影響，乙醇濃度對(duì)生物堿提取量的影響曲線相對(duì)物料比的曲線趨勢(shì)較陡，表明乙醇濃度對(duì)生物堿提取量的影響較大（A＞C）；圖8 響應(yīng)面斜率較陡，等高線呈橢圓形，說(shuō)明乙醇濃度與超聲溫度的相互作用較強(qiáng)，對(duì)萱草花中總生物堿的提取量影響也較大。乙醇濃度的響應(yīng)曲面比超聲溫度的曲面陡峭，說(shuō)明乙醇濃度對(duì)總生物堿的提取量的影響比溫度的影響大（A＞D）；圖9 響應(yīng)面的坡度較前面三個(gè)緩和，等高線較前三個(gè)偏圓，說(shuō)明超聲時(shí)間與物料比也有交互作用，對(duì)提取物中總生物堿提取量也有影響，超聲時(shí)間的曲面相對(duì)于物料比趨勢(shì)較陡，說(shuō)明超聲時(shí)間對(duì)提取物中總生物堿提取量的影響比物料比顯著（B＞C）；圖10 響應(yīng)面坡度相對(duì)緩和，等高線呈圓形，由此能夠看出超聲時(shí)間和超聲溫度交互作用并不強(qiáng)，對(duì)給萱草花中總生物堿提取量的影響也十分有限，超聲時(shí)間相對(duì)于超聲溫度趨勢(shì)較陡，說(shuō)明超聲時(shí)間對(duì)提取物中總生物堿提取量的影響比超聲溫度顯著（B＞D）；圖11 響應(yīng)面的坡度較緩和，等高線近似圓形，說(shuō)明物料比與超聲溫度交互作用很弱，對(duì)萱草花中總生物堿提取量影響較弱，物料比的曲面相對(duì)于提取溫度趨勢(shì)較陡，說(shuō)明物料比對(duì)提取物中總生物堿提取量的影響比超聲溫度顯著（C＞D）。因此從響應(yīng)面的陡峭程度可以看出，乙醇濃度對(duì)萱草花中總生物堿提取量的影響最顯著，其次是提取時(shí)間，接著是物料比，最后是超聲溫度（A＞B＞C＞D），與方差分析結(jié)果一致。

圖6 乙醇濃度與超聲時(shí)間對(duì)萱草花總生物堿提取含量的響應(yīng)曲面及等高線圖

圖7 乙醇濃度與物料比對(duì)萱草花總生物堿提取含量的響應(yīng)曲面及等高線圖

圖8 乙醇濃度與超聲溫度對(duì)萱草花總生物堿提取含量的響應(yīng)曲面及等高線圖

圖9 超聲時(shí)間與物料比對(duì)萱草花總生物堿提取含量的響應(yīng)曲面及等高線圖

圖10 超聲時(shí)間與超聲溫度對(duì)萱草花總生物堿提取含量的響應(yīng)曲面及等高線圖

圖11 物料比與超聲溫度對(duì)萱草花總生物堿提取含量的響應(yīng)曲面及等高線圖

2.2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

軟件Design-Expert10 分析計(jì)算最佳提取條件：超聲時(shí)間15 min，乙醇濃度75%，物料比1∶10（g/ml），超聲溫度35 ℃；選擇上述提取工藝，采用相同方法提取3 批樣品進(jìn)行驗(yàn)證，測(cè)定萱草花總生物堿提取含量為2.58 mg/g，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，優(yōu)選的提取工藝是穩(wěn)定可控的。

3 總結(jié)

此實(shí)驗(yàn)利用紫外-分光光度法完成萱草花總生物堿提取量測(cè)定方法的構(gòu)建。首先采用單因素實(shí)驗(yàn)篩選影響萱草花中總生物堿提取量的各種因素，在此基礎(chǔ)上，再利用中心組和響應(yīng)面法試驗(yàn)對(duì)其提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，進(jìn)而所得總生物堿最佳提取工藝條件：超聲時(shí)間15 min、乙醇濃度75%、物料比1∶10（g/ml）、超聲溫度35℃；在此條件下，總生物堿提取量為2.58 mg/g，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與理論預(yù)測(cè)值相符較好。本研究確定了萱草花總生物堿的提取工藝，為進(jìn)一步有效開(kāi)發(fā)萱草及企業(yè)提取利用，提高效率奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。