酒精依賴大鼠不同戒斷期血漿食欲素A 水平變化與戒斷癥狀程度的相關(guān)性研究*

李子童，劉旭，李斌，陳旭**

（1.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院精神衛(wèi)生學(xué)院，山東 濟(jì)寧 272067；2.山東省精神衛(wèi)生中心成癮醫(yī)學(xué)科，山東 濟(jì)南 250014）

酒精依賴（Alcohol dependence）是由于飲酒所致的對(duì)酒精渴求的一種心理狀態(tài)，可呈連續(xù)性或周期性出現(xiàn)，以體驗(yàn)飲酒的心理效應(yīng)，在美國(guó)所有疾病中死亡率占2.6%[1]。臨床上酒依賴患者在完全或部分停止飲酒后所出現(xiàn)的一組戒斷癥狀如震顫、幻覺及意識(shí)障礙等，稱為酒精戒斷綜合征（alcohol withdrawal syndrome，AWS）。AWS 期間，自主神經(jīng)功能亢進(jìn)可以出現(xiàn)惡心、嘔吐、心率和血壓變化等軀體癥狀和體征，嚴(yán)重者還可出現(xiàn)癲癇和水電解質(zhì)紊亂，最終導(dǎo)致死亡或腦損害[2，3]。食欲素A（orexin-A，OXA）是外側(cè)下丘腦神經(jīng)元中的一種神經(jīng)遞質(zhì)，其在飲酒、進(jìn)食、內(nèi)分泌功能和睡眠/覺醒的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[4]。近年來(lái)越來(lái)越多的國(guó)內(nèi)外研究表明，OXA 可能在物質(zhì)成癮方面發(fā)揮著重要作用。有動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)[5]，大鼠海馬區(qū)有著相當(dāng)豐富的OXA 受體，而使用orexin 受體拮抗劑SB-334867 可以通過(guò)作用于嗎啡依賴大鼠的海馬的背側(cè)區(qū)，來(lái)減少嗎啡戒斷癥狀中的牙齒打顫、身體發(fā)抖、腹瀉、上瞼下垂等一些軀體癥狀。同時(shí)臨床研究中顯示[6]，酒依賴患者的外周血中OXA 的蛋白表達(dá)和啟動(dòng)子的甲基化同戒斷反應(yīng)的嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)，即戒斷反應(yīng)越強(qiáng)，外周血OXA 的蛋白表達(dá)和啟動(dòng)子甲基化就越弱，這個(gè)結(jié)果可能提示外周OXA 的高水平抑制了其自身的合成。還有研究表明[7，8]，男性酒精依賴患者戒斷后的外周血漿OXA 水平顯著高于正常人，以及OXA 水平與患者的戒斷癥狀和心理渴求之間存在正相關(guān)性。故本研究將以建立酒精依賴大鼠模型為基礎(chǔ)，進(jìn)一步觀察并驗(yàn)證OXA 與AWS 的相關(guān)性，從而明確其對(duì)酒精依賴大鼠模型急性戒斷癥狀的影響及治療價(jià)值，為評(píng)估和治療AWS 提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取雄性SD 大鼠24 只[（250±10）g 左右，（6±1）周齡]，對(duì)其進(jìn)行編號(hào)、稱重并依照隨機(jī)數(shù)字表法分為A、B、C 三組（各組n=8），A 組為對(duì)照組，B 組和C 組為實(shí)驗(yàn)組。大鼠均由濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司提供。本研究經(jīng)山東省精神衛(wèi)生中心倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

使用75%醫(yī)用酒精配制成6%的酒精水溶液。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酒精依賴大鼠模型建立

每只大鼠單籠飼養(yǎng)，室溫控制在20～25 ℃，同時(shí)12 h 人工模擬晝夜交替，普通固體營(yíng)養(yǎng)顆粒飼料，24 h 自由飲食。參照李菁等[9]人的方法，將實(shí)驗(yàn)組飲水更換為含有6%的乙醇水溶液作為唯一引用水來(lái)源喂養(yǎng)28 d。對(duì)照組給予普通飲用水，自由進(jìn)食。所有大鼠水源每3～4 d 更換1 次，每2 周稱重1 次，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

1.2.2 乙醇水溶液飲用量記錄

實(shí)驗(yàn)組每次更換乙醇水溶液時(shí)，均記錄大鼠酒精水溶液消耗量，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束匯總。

1.2.3 戒斷癥狀評(píng)分

參照李菁等[9]人的方法，使用《酒精依賴大鼠戒斷行為體征和聽源性癲癇發(fā)作評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)》（表1）進(jìn)行評(píng)估，三組大鼠喂養(yǎng)28 d 后，將實(shí)驗(yàn)組籠內(nèi)酒精水溶液更換為正常飲水，B 組和C 組分別于停酒后6 h、18 h，A 組于停水后6 h 進(jìn)行戒斷癥狀評(píng)分。

表1 酒精依賴大鼠戒斷行為體征和聽源性癲癇發(fā)作評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.2.4 樣本采集

取血方式采用腹主動(dòng)脈取血法，抓取大鼠后給予10%水合氯醛腹腔麻醉，待大鼠充分麻醉后將其固定于仰臥位實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，四肢用橡皮筋固定，切開腹部皮膚及筋膜，充分暴露大鼠腹腔尋找腹主動(dòng)脈。使用靜脈采血針進(jìn)行采血，EDTA 抗凝保存并離心處理（3000 r/min，10 min），取上層血漿500 μl 于離心管中-70 ℃凍存。

1.2.5 酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定（Elisa）樣本OXA 水平

使用雙抗體夾心法測(cè)定，恒溫箱孵育30 min 后再加入終止液15 min 內(nèi)，在450 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度并讀數(shù)，每樣本均采用雙測(cè)法，取2 次測(cè)定的算術(shù)平均值作為OXA 最終測(cè)定濃度。上述樣本均進(jìn)行雙測(cè)，取算術(shù)平均值作為最終測(cè)定結(jié)果。試劑盒購(gòu)買自江蘇酶免實(shí)驗(yàn)有限公司，按照說(shuō)明書操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，如符合正態(tài)分布，以（±s）描述，兩組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；如不符合正態(tài)分布，則以[M（QL，QU）]描述，組間比較用Kruskal-Wallis H 檢驗(yàn)，結(jié)果采用Bonferroni 法校正。OXA 濃度水平與戒斷癥狀評(píng)分相關(guān)性采用Spearman 相關(guān)分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 飲酒期間大鼠飲酒量和體重變化

B 組飲酒量與C 組比較[（958.75±89.83）ml vs（879.25±133.73）ml]，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；每只大鼠平均每天飲酒量為32.82 ml/d，相當(dāng)于攝入酒精1.58 g/d，見圖1。實(shí)驗(yàn)前A 組體重為（247.41±7.67）g，與B 組 的（248.09±3.52）g 和C 組的（249.14±4.49）g 比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；實(shí)驗(yàn)結(jié)束A 組體重為（413.83±15.49）g，與B 組的（408.38±31.14）g、C 組的（427.35±17.22）g 比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖2。

圖1 不同戒斷組大鼠飲酒量比較

圖2 三組大鼠體重變化比較

2.2 酒精戒斷后的酒依賴大鼠戒斷反應(yīng)評(píng)分

在建模期間，大鼠性格溫順，不易激惹，體征正常。自撤除酒精后2 h 開始，大鼠開始出現(xiàn)較多的戒斷癥狀，如易激惹、具有攻擊性、打噴嚏等。將戒斷評(píng)分進(jìn)行總體與分類比較，結(jié)果顯示B 組戒斷總分、分項(xiàng)評(píng)分與A 組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；C 組戒斷總分與A 組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但在分項(xiàng)比較中大鼠激惹性和尾巴強(qiáng)直兩項(xiàng)評(píng)分與A 組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其余三項(xiàng)評(píng)分比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2、圖3。

圖3 各組大鼠戒斷評(píng)分比較

表2 撤除酒精后各組大鼠戒斷癥狀評(píng)分（n=8）

2.3 OXA 水平結(jié)果分析

將三組血漿OXA 測(cè)定結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果顯示B 組血漿OXA 濃度水平高于A 組和C 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），C 組OXA 水平也高于A 組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖4。

圖4 各組大鼠OXA 濃度水平比較

2.4 OXA 水平與戒斷癥狀評(píng)分、飲酒量及體重變化相關(guān)性

將B 組和C 組的OXA 水平與戒斷癥狀評(píng)分進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示OXA 水平與戒斷反應(yīng)評(píng)分呈正相關(guān)性（r=0.70，P＜0.05），而與飲酒期間大鼠的體重變化、飲酒量無(wú)相關(guān)性（P＞0.05）。

3 討論

酒精戒斷綜合征是酒依賴患者的飲酒中斷，進(jìn)而出現(xiàn)一系列精神及軀體癥狀，嚴(yán)重影響患者身心健康，也是戒除酒依賴的關(guān)鍵。目前，F(xiàn)DA 已批準(zhǔn)了Orexin 受體拮抗劑用于治療失眠[10]，以及其他Orexin 受體拮抗劑在臨床應(yīng)用研究，為治療AWS 提供了一個(gè)新思路。本研究通過(guò)建立酒精依賴大鼠模型，探討OXA 水平與酒精戒斷癥狀嚴(yán)重性的相關(guān)性，從而為防治AWS 探尋新的臨床線索。

3.1 飲酒期間大鼠飲酒量及體重變化

目前，酒依賴大鼠模型的建立多采用模擬酗酒者的方法，給予大鼠短期大量的酒精以達(dá)到酒依賴程度[11]。本研究采用長(zhǎng)期給予大鼠低濃度酒精水溶液的方法建模，并同時(shí)設(shè)立同等健康對(duì)照大鼠，記錄大鼠的飲酒量與體重變化，結(jié)果顯示在僅改變飲水而其他喂養(yǎng)條件一致時(shí)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組大鼠的體重變化之間無(wú)明顯差異，這表明長(zhǎng)期飲用6%的低濃度酒精并不會(huì)影響大鼠的進(jìn)食。因此，本研究分析實(shí)驗(yàn)組大鼠出現(xiàn)的戒斷體征與OXA 濃度的差異，僅僅是由于長(zhǎng)期飲酒所造成的。同時(shí)本研究對(duì)比了兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組的飲酒量，發(fā)現(xiàn)并無(wú)明顯差異，從而排除了實(shí)驗(yàn)組之間的結(jié)果差異并非是由于酒精消耗量的不同引起的。

3.2 戒酒后大鼠的行為體征變化

既往曾有文獻(xiàn)報(bào)道[12，13]，酒依賴大鼠的戒斷癥狀在停酒后的24 h 內(nèi)最嚴(yán)重，故本研究分別在實(shí)驗(yàn)組停酒后的6 h、18 h 進(jìn)行戒斷癥狀的評(píng)分。本研究采用改良后的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)估，將每只大鼠放置于單獨(dú)安靜的場(chǎng)地中，每只評(píng)估時(shí)間不少于5 min。結(jié)果顯示，大鼠在停酒后6 h 時(shí)戒斷癥狀表現(xiàn)極為嚴(yán)重，戒斷行為體征明顯，如情緒燥鬧，易激惹，對(duì)外界刺激具有攻擊性，以及大部分大鼠聽源性癲癇發(fā)作持續(xù)時(shí)間大于90 s，而其中一只大鼠更是因癲癇發(fā)作導(dǎo)致死亡。至戒斷18 h 時(shí)，大鼠戒斷體征雖有緩解，但仍存在較為嚴(yán)重的聽源性癲癇發(fā)作。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)組的戒斷評(píng)分與對(duì)照組相比存在差異，說(shuō)明了此方法建立酒精依賴大鼠模型是可靠的。

3.3 OXA 水平結(jié)果分析

研究表明，OXA 的水平濃度與酒精攝入量呈正相關(guān)，通過(guò)測(cè)定接受住院的AUD 患者外周血液中的OXA 濃度發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于健康被試來(lái)說(shuō)，患者的血液OXA 濃度水平有明顯增高，同時(shí)納入研究中的重度酒精依賴患者的血液OXA 濃度也高于中輕度成癮的個(gè)體[14]。本研究結(jié)果顯示，長(zhǎng)期飲酒的大鼠體內(nèi)擁有較高的OXA 水平，尤其是在停酒后6 h 大鼠血漿OXA 濃度水平與對(duì)照組存在差異。而隨著戒斷時(shí)間至18 h 左右，實(shí)驗(yàn)組OXA 水平雖與對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但總體水平仍高于對(duì)照組。此結(jié)果說(shuō)明，隨著戒斷時(shí)間延長(zhǎng)，OXA 水平呈下降趨勢(shì)，這與國(guó)外動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中觀察結(jié)果相一致[15，16]。于是可以提出猜測(cè)，長(zhǎng)期的酒精攝入可能促進(jìn)了食欲素mRNA 的表達(dá)，而高水平的OXA 因其在飲食方面的作用，又反過(guò)來(lái)促進(jìn)酒精消耗，從而形成一種正反饋循環(huán)?？傊?，長(zhǎng)期酒精在某種程度上促進(jìn)了食欲素水平的上升。

3.4 OXA 與戒斷癥狀的關(guān)系

目前，臨床上對(duì)于AWS 的治療主要是通過(guò)苯二氮 類藥物（benzodiazepines，BZD）的替代治療，雖然也有人曾嘗試其他藥物治療AWS，如抗精神病藥物、抗驚厥藥及抗抑郁藥物等，但效果均不及BZD 明顯。本研究將實(shí)驗(yàn)組的OXA 水平與戒斷評(píng)分進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果表明二者之間存在正相關(guān)性。既往有研究表明[8，14]，酒精依賴男性患者戒斷癥狀重度的個(gè)體比起癥狀中度的個(gè)體有著更高的血液Orexin 水平，據(jù)此可以提出大膽推測(cè)，在酒依賴患者血中OXA 水平越高，戒斷癥狀可能就越嚴(yán)重，而通過(guò)應(yīng)用Orexin 受體拮抗劑可能會(huì)減輕停酒后引起的戒斷體征，這仍需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。

本研究亦存在部分不足之處：首先，大鼠模型樣本量較少，可能對(duì)結(jié)果造成一定的局限性；其次，血漿中OXA 濃度水平含量較低，測(cè)定結(jié)果可能會(huì)有偏倚，較好的方法是采集大鼠腦脊液測(cè)定，但存在一定的技術(shù)困難；另外，腹主動(dòng)脈采血法雖然簡(jiǎn)便易行，但也同時(shí)令大鼠迅速失血死亡，進(jìn)而導(dǎo)致本研究缺乏對(duì)同一大鼠的動(dòng)態(tài)性評(píng)估。因此，未來(lái)仍需規(guī)劃更加嚴(yán)謹(jǐn)科學(xué)的方案進(jìn)一步對(duì)本研究進(jìn)行補(bǔ)充。

綜上所述，Orexin 系統(tǒng)可能在急性酒精戒斷反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，并可能是治療AWS 的潛在靶點(diǎn)。對(duì)于將來(lái)該方面的研究，可以考慮在大鼠戒斷時(shí)期利用Orexin 受體拮抗劑，觀察在阻斷食欲素受體作用后能否明顯緩解AWS 癥狀，從而進(jìn)一步探討OXA 與AWS 癥狀的關(guān)系。