長(zhǎng)鏈非編碼RNA lncMD通過(guò)轉(zhuǎn)錄miR-1促進(jìn)牛肌細(xì)胞的分化研究

孫曉梅,王奕猛,徐 杰,毛秋彤,李明勛,藍(lán)賢勇

(1. 揚(yáng)州大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,江蘇 揚(yáng)州 225009;2. 西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,陜西 楊凌 712100)

牛骨骼肌的生長(zhǎng)發(fā)育及其遺傳特性直接決定了產(chǎn)肉率、肉品質(zhì)和肉牛產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。成肌細(xì)胞增殖分化是肌肉發(fā)育的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[1],研究牛成肌細(xì)胞分化的調(diào)控機(jī)制對(duì)理解肌肉生長(zhǎng)發(fā)育的生理基礎(chǔ)、肉牛的遺傳改良及進(jìn)行精準(zhǔn)的分子設(shè)計(jì)育種等具有重要的理論和實(shí)際意義。

肌細(xì)胞分化是由一系列轉(zhuǎn)錄因子參與的復(fù)雜而精細(xì)的程序化調(diào)控過(guò)程,受到眾多編碼基因、非編碼基因及其互作的調(diào)控[2-4]。研究顯示,長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,lncRNA)可在轉(zhuǎn)錄、翻譯和染色體水平等多層面調(diào)控基因表達(dá)[5-8],在骨骼肌發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要功能[9-13]。lncRNA可以通過(guò)順式作用或反式作用等方式作為支架分子、誘餌分子或指導(dǎo)分子靶向調(diào)控下游基因的表達(dá)[14-15]。前期研究鑒定到一個(gè)新的長(zhǎng)鏈非編碼RNA lncMD,過(guò)表達(dá)和干擾試驗(yàn)表明lncMD能夠顯著促進(jìn)肌細(xì)胞分化[16]。利用UCSC基因組瀏覽器比對(duì)發(fā)現(xiàn),lncMD是miR-1的宿主基因,miR-1位于lncMD的第三外顯子區(qū)域,是一種在進(jìn)化中高度保守的miRNA,在肌肉中特異性表達(dá)。據(jù)報(bào)道,配對(duì)盒基因7(paired box 7,Pax7)是miR-1的一個(gè)重要靶基因,miR-1可通過(guò)抑制Pax7的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)肌衛(wèi)星細(xì)胞的生成[17]。miR-1還可以通過(guò)靶向調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白D1(CyclinD1),進(jìn)而調(diào)控肌生成[18]。

lncMD與miR-1在基因組上的位置重疊會(huì)產(chǎn)生什么樣的調(diào)控關(guān)系以及l(fā)ncMD-miR-1下游的靶基因是什么等問(wèn)題還有待深入研究。因此,本研究利用過(guò)表達(dá)、RNAi、雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qRT-PCR)等方法解析lncMD和miR-1的調(diào)控關(guān)系,確定牛肌細(xì)胞分化過(guò)程中miR-1的下游靶基因,解析lncMD對(duì)肌生成的調(diào)控作用,以期在牛肌肉發(fā)育的分子調(diào)控理論及應(yīng)用方面取得重要進(jìn)展,為肉牛的快速生長(zhǎng)和優(yōu)質(zhì)高效生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)與誘導(dǎo)分化

采用膠原酶消化法培養(yǎng)牛原代肌細(xì)胞,具體步驟如下:無(wú)菌狀態(tài)下采集胎牛的背最長(zhǎng)肌組織,將其置于含1%雙抗的無(wú)菌PBS中迅速帶回實(shí)驗(yàn)室;用無(wú)菌剪刀剪成1 mm3小塊,放入50 mL離心管中;加入膠原酶Ⅰ消化,37 ℃水浴1.5 h,過(guò)濾并收集濾液; 1000 r/min離心5 min后去除上清液,收集沉淀;在DMEM完全培養(yǎng)基中重懸細(xì)胞,將細(xì)胞懸液接種到6 cm培養(yǎng)皿中;在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h,收集上層培養(yǎng)液于新的培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng);鑒定后凍存?zhèn)溆没蜻M(jìn)行細(xì)胞傳代。

誘導(dǎo)分化步驟:當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到約80%時(shí),將生長(zhǎng)培養(yǎng)基(DMEM高糖培養(yǎng)基、10% FBS)換為分化培養(yǎng)基(DMEM高糖培養(yǎng)基、2%馬血清),每天換一次細(xì)胞培養(yǎng)液。

1.2 雙熒光素酶活性檢測(cè)

1.3 載體構(gòu)建

以骨骼肌的cDNA為模板,在lncMD序列的兩端分別引入Hind III和EcoR I酶切位點(diǎn),擴(kuò)增lncMD的全長(zhǎng),連接至pcDNA3.1+載體(Invitrogen, 上海),構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體pcDNA-lncMD。miR-1 mimics、miR-1 inhibitor、lncMD siRNA購(gòu)自吉瑪生物(Genepharma,蘇州)。

1.4 RNA提取、cDNA合成及實(shí)時(shí)熒光定量PCR

根據(jù)操作說(shuō)明,利用RNAiso Plus(TaKaRa,大連)提取細(xì)胞總RNA,NanoDrop 1000分光光度計(jì)檢測(cè)RNA質(zhì)量。利用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser (TaKaRa,大連)進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄。在Bio-Rad CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系25 μL,包括12.5 μL SYBR Premix Ex Taq II,10 μM正向和反向引物,10 ng cDNA。反應(yīng)程序:95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s 40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參,采用2-ΔΔCT方法計(jì)算基因表達(dá)水平[19]。利用Beacon Designer 8.12設(shè)計(jì)定量引物,引物序列見(jiàn)表1。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物Table 1 Primers used for qRT-PCR

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

利用GraphPad Prism 6進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及Student's t檢驗(yàn),數(shù)據(jù)表示方式為平均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)誤,P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 長(zhǎng)鏈非編碼RNA lncMD促進(jìn)miR-1的表達(dá)

序列分析顯示lncMD第三外顯子與miR-1在基因組上位置重疊(圖1A)。采集牛腎臟、小腸、肺、肝臟、脾臟、骨骼肌、脂肪和心臟等組織進(jìn)行定量分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-1與lncMD的組織表達(dá)譜相似,都僅在牛肌肉組織中表達(dá),且均是骨骼肌中高表達(dá),心肌中少量表達(dá)(圖1B)。

在牛原代肌細(xì)胞中分別過(guò)表達(dá)和干擾lncMD,收集細(xì)胞,qRT-PCR檢測(cè)miR-1的表達(dá)量,結(jié)果如圖1C、1D所示。過(guò)表達(dá)lncMD極顯著增加lncMD的表達(dá)量,而干擾載體可以極顯著降低lncMD的表達(dá)量,說(shuō)明lncMD的過(guò)表達(dá)和干擾成功,可用于后續(xù)研究。由圖1C可知,過(guò)表達(dá)lncMD后,miR-1的表達(dá)量極顯著上升(P<0.001);而干擾lncMD導(dǎo)致miR-1表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05,圖1D),提示lncMD可以促進(jìn)miR-1的表達(dá)。

圖1 lncMD調(diào)控miR-1的表達(dá)A.生物信息學(xué)分析lncMD和miR-1的基因組位置特征;B. lncMD和miR-1的組織表達(dá)譜;C. 過(guò)表達(dá)lncMD檢測(cè)對(duì)miR-1表達(dá)量的影響;D. 干擾lncMD的表達(dá)檢測(cè)對(duì)miR-1的影響。 *表示P<0.05,**表示P<0.01,***表示P<0.001。下同。Fig.1 lncMD regulates the expression of miR-1A. Bioinformatics analysis of the genomic location of lncMD and miR-1; B. The tissue expression profiles of lncMD and miR-1;C. The effect of overexpression of lncMD on the expression levels of miR-1;D. The effect of interference with lncMD expression on miR-1 expression. *means P<0.05, ** means P<0.01, *** means P<0.001. The same below.

2.2 牛miR-1和Pax7基因的靶向關(guān)系驗(yàn)證

利用TargetScan在線預(yù)測(cè)miRNA靶基因,結(jié)果如圖2A所示,牛Pax7基因3'UTR區(qū)共存在4個(gè)miR-1的結(jié)合位點(diǎn)。利用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)和定點(diǎn)突變技術(shù),驗(yàn)證牛miR-1與Pax7的靶向關(guān)系。由圖2B-E可知,和對(duì)照組相比,試驗(yàn)組熒光素酶活性顯著下降,說(shuō)明miR-1結(jié)合到Pax7上,導(dǎo)致螢火蟲(chóng)熒光素酶基因表達(dá)受阻,螢火蟲(chóng)熒光素酶與海參熒光素酶活性比值下調(diào);分別突變Pax7基因3'UTR區(qū)4個(gè)miR-1結(jié)合位點(diǎn)(M1-M4),轉(zhuǎn)染突變型Pax7-MT雙熒光素載體后,熒光素酶活性與對(duì)照組無(wú)顯著區(qū)別。這是由于突變miR-1結(jié)合位點(diǎn),解除了miR-1對(duì)靶基因Pax7的抑制,進(jìn)一步證明Pax7 3'UTR區(qū)存在4個(gè)miR-1的結(jié)合位點(diǎn),其是miR-1的靶基因。

2.3 lncMD可通過(guò)miR-1-Pax7途徑促進(jìn)肌分化

為進(jìn)一步驗(yàn)證miR-1和Pax7的靶向關(guān)系,在牛骨骼肌細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染miR-1 mimics、miR-1 inhibitor,檢測(cè)Pax7基因的表達(dá)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn),miR-1表達(dá)量增加可以降低Pax7的表達(dá)量,而miR-1表達(dá)量降低能夠提高Pax7表達(dá)量,說(shuō)明miR-1可以負(fù)調(diào)控Pax7表達(dá)(圖3)。綜合雙熒光素酶試驗(yàn)結(jié)果,表明lncMD可以通過(guò)自身編碼miR-1,抑制靶基因Pax7的表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)成肌細(xì)胞分化(圖4)。

3 討 論

牛肉的產(chǎn)量和質(zhì)量與肌纖維的數(shù)量和體積緊密相關(guān),肌纖維數(shù)量和體積的變化即肌細(xì)胞的增殖分化過(guò)程。細(xì)胞的增殖分化能力直接決定了組織器官的形成及動(dòng)物個(gè)體的生長(zhǎng)發(fā)育狀況。長(zhǎng)鏈非編碼RNA在細(xì)胞分化、個(gè)體發(fā)育、干細(xì)胞維持、能量代謝等生命活動(dòng)中發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)控功能[20-21],它能在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后等水平調(diào)控基因表達(dá),參與染色質(zhì)重塑、X染色體失活、基因組印記、核內(nèi)運(yùn)輸、細(xì)胞周期調(diào)控、選擇性剪接調(diào)控和mRNA穩(wěn)定性調(diào)控等多種重要的生命過(guò)程[5-6,22-23]。當(dāng)前,已明確鑒定的lncRNA數(shù)目還在繼續(xù)增長(zhǎng),但大多數(shù)lncRNA的功能和作用機(jī)制尚未闡明。

成肌細(xì)胞分化的相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及分子調(diào)控機(jī)制是畜牧學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)問(wèn)題之一,lncRNA對(duì)成肌細(xì)胞的增殖至關(guān)重要[24]。牛基因組結(jié)構(gòu)被逐步解析,一些與肌肉發(fā)育調(diào)控相關(guān)的重要非編碼RNA相繼被發(fā)現(xiàn)。雖然牛上關(guān)于lncRNA已有很多研究,然而功能清晰的lncRNA數(shù)量還有限[25-27]。前期研究報(bào)道lncMD在牛的肌肉組織中特異性表達(dá),并且在肌細(xì)胞分化過(guò)程表達(dá)量逐步升高,能夠顯著促進(jìn)牛成肌細(xì)胞的分化[16]。本研究通過(guò)組織表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn),miR-1與lncMD都僅在牛的骨骼肌和心肌中表達(dá),這和已有報(bào)道m(xù)iR-1僅在牛肌肉組織中表達(dá)相一致[28]。

lncRNA與基因組位置鄰近的miRNA可能具有兩種作用機(jī)制,lncRNA可以通過(guò)調(diào)控鄰近miRNA發(fā)揮功能,如miR-15a/16-1簇的表達(dá)受宿主基因lncRNA DLEU2啟動(dòng)子的調(diào)控[29];在人和小鼠的成肌細(xì)胞中,沉默lncRNA H19導(dǎo)致其自身編碼的miR-675-3p和miR-675-5p表達(dá)量相應(yīng)降低,H19通過(guò)miR-675-3p和miR-675-5p促進(jìn)骨骼肌的分化和再生[30]。該作用機(jī)制與本研究中l(wèi)ncMD與miR-1的作用機(jī)制一致。lncRNA還可能與miRNA獨(dú)立轉(zhuǎn)錄,分別行使功能:如lncRNA MIR100HG是miR-100的宿主基因,在人的U2OS細(xì)胞系中,敲除MIR100HG導(dǎo)致細(xì)胞周期異常,但卻不改變miR-100表達(dá)[31];lncRNA lnc-31的第三外顯子與miR-31在基因組上位置重疊,lnc-31調(diào)控肌細(xì)胞增殖并不依賴(lài)于miR-31[32],兩者并無(wú)調(diào)控關(guān)系。本文進(jìn)一步結(jié)合過(guò)表達(dá)、干擾試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),lncMD可以通過(guò)自身編碼miR-1促進(jìn)牛成肌細(xì)胞分化。

圖2 雙熒光報(bào)告載體驗(yàn)證miR-1和Pax7的靶向關(guān)系A(chǔ). 在線預(yù)測(cè)miR-1和Pax7的結(jié)合位點(diǎn)。M1-M4分別代表Pax7基因的3' UTR區(qū)4個(gè)的miR-1結(jié)合位點(diǎn)的突變序列;B-E. HEK293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-1 mimics和雙熒光素報(bào)告載體,48 h后檢測(cè)熒光活性Fig.2 The relationship between miR-1 and Pax7 verified by dual fluorescent reporter systemA. Online prediction of the binding sites of miR-1 and Pax7. M1-M4 respectively represent the mutated sequences of four miR-1 binding sites in the 3' UTR region of the Pax7 gene; B-E. HEK293T cells were transfected with miR-1 mimics and dual fluorescein reporter vectors, and after 48 hours, the fluorescence activity was detected

圖3 牛miR-1顯著抑制靶基因Pax7的表達(dá) 牛骨骼肌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-1 mimics(A)、miR-1 inhibitor(B) 后檢測(cè)靶基因Pax7表達(dá)量Fig.3 Bovine miR-1 significantly inhibits the expression of its target gene Pax7 After transfection of miR-1 mimics (A) or miR-1 inhibitor (B) into primary cultured bovine skeletal muscle cells, the expression level of the target gene Pax7 was detected, respectively

圖4 lncMD-miR-1-Pax7調(diào)控通路在促進(jìn) 牛成肌細(xì)胞分化中的作用模式Fig.4 Model of the lncMD-miR-1-Pax7 pathway in promoting bovine muscle differentiation

此外,通過(guò)在線預(yù)測(cè)、雙熒光素報(bào)告系統(tǒng)結(jié)合定點(diǎn)突變技術(shù)發(fā)現(xiàn),牛Pax7基因是lncMD-miR-1促進(jìn)肌分化過(guò)程的下游靶基因,與已有報(bào)道牛Pax7和HDAC4基因是miR-1的靶基因一致[33],而且Pax7基因在肌細(xì)胞增殖、分化及肌營(yíng)養(yǎng)不良等方面發(fā)揮重要功能[34-35],這進(jìn)一步證明本研究結(jié)果的可信性。本文以lncMD為研究對(duì)象全面開(kāi)展分子機(jī)制研究,從lncMD-miR-1-靶基因互作的角度,解析lncMD調(diào)控牛肌肉生成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

4 結(jié) 論

本研究明確了lncMD對(duì)miR-1轉(zhuǎn)錄的調(diào)控作用,揭示lncMD通過(guò)正調(diào)控miR-1的表達(dá),抑制其靶基因Pax7的功能,進(jìn)而促進(jìn)肌分化。