常規(guī)粳稻浙粳78 優(yōu)質雙抗的分子特征分析

陳佑源 蔣寧飛 尚子帥 巫明明 葉 靖 葉勝海

（1.浙江勿忘農(nóng)種業(yè)股份有限公司 浙江 杭州 311215；2.建德市農(nóng)業(yè)技術推廣中心 浙江 建德 311600；3.浙江省農(nóng)業(yè)科學院作物與核技術利用研究所 浙江 杭州 310021）

21 世紀以來，浙江省水稻播種面積呈下降趨勢，2001 年全省稻谷種植面積134 萬hm2，2021 年約為63 萬hm2，僅為前者的47%。 盡管如此，水稻依舊是浙江省第一大糧食作物，年均產(chǎn)量498.78 萬t，占糧食總產(chǎn)的83.13%[1]。然而，浙江地處亞熱帶中部，屬季風性濕潤氣候， 氣溫適中， 光照充足， 雨量豐沛，不僅是適宜水稻種植的重要地區(qū)， 同時也是水稻病蟲害如稻瘟病、 白葉枯病的高發(fā)區(qū)。 因此， 稻瘟病和白葉枯病已成為該地限制水稻產(chǎn)量和品質的兩大重要病害。 其中， 稻瘟病分布遍及世界各稻區(qū)， 流行年份稻谷一般減產(chǎn)10%~20%， 嚴重時減產(chǎn)40%~50%，局部田塊甚至顆粒無收， 每年損失的稻谷足以養(yǎng)活6 000 萬人口。 目前我國稻瘟病的平均發(fā)生強度、 年發(fā)生面積及稻谷損失分別為25.21%、380 萬~600 萬hm2及15 億~30 億kg[2-4]。 盡管浙江省稻瘟病平均發(fā)生強度全國最低，僅為4.46%，但近年來浙江部分地區(qū)存在大范圍發(fā)生趨勢[5-6]。 而白葉枯病則主要流行于我國華東、華南和華中稻區(qū)，一般造成稻谷產(chǎn)量損失10%~30%，嚴重時達50%，甚至絕收。 在20 世紀80～90 年代，該病在浙江省發(fā)生較重，而后總體趨勢為輕發(fā)，但2015 年后又趨于加重，甚至在浙東南部分區(qū)域連片暴發(fā)， 嚴重影響糧食生產(chǎn)安全及農(nóng)藥減量增效工作成效[7-9]。 因此，面對“老問題新暴發(fā)”的水稻白葉枯病，2021 年浙江省將其列入首批二類農(nóng)作物病蟲害名錄，同時自2022 年開始，在水稻區(qū)試審定標準中將白葉枯病抗性與稻瘟病抗性列為同等重要位置，同時實施“一票否決”制。

在水稻生產(chǎn)上，為了防治上述病害，一般通過噴施農(nóng)藥或種植抗性水稻品種來控制， 但農(nóng)藥防治既污染環(huán)境也危害人類身體健康。 目前農(nóng)業(yè)供給側結構性改革正推動我國農(nóng)業(yè)向綠色化轉型發(fā)展[10]。培育并推廣應用多抗水稻品種及品種合理布局， 減少農(nóng)作物化學農(nóng)藥用量，是實現(xiàn)農(nóng)業(yè)綠色生態(tài)生產(chǎn)，保障農(nóng)業(yè)生產(chǎn)安全、 農(nóng)產(chǎn)品質量安全和生態(tài)環(huán)境安全的科學有效途徑。 為了適應新時代的生產(chǎn)要求，浙江省自2022 年開始實行水稻新品種審定標準，如多個優(yōu)異性狀累計標準， 即在優(yōu)質與抗性等方面優(yōu)異性狀越多，則對產(chǎn)量要求相對放寬。 本研究基于稻米食味關鍵基因、 稻瘟病和白葉枯病抗性基因功能型或緊密連鎖分子標記，對單季常規(guī)粳稻浙粳78 的優(yōu)質雙抗基因進行分子分析， 以期為該品種的推廣應用及進一步遺傳改良奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

水稻品種浙粳78 （浙江勿忘農(nóng)種業(yè)股份有限公司）種子發(fā)芽后，用Yoshida 營養(yǎng)液于組織培養(yǎng)室恒溫培養(yǎng)至3 葉1 心， 而后剪取完全展開葉用于基因組DNA 提取。

1.2 稻米品質、稻瘟病及白葉枯病抗性評價

評價數(shù)據(jù)均來源于國家水稻數(shù)據(jù)中心（http://www. ricedata.cn/variety/index.htm）。 稻瘟病及白葉枯病的相關數(shù)據(jù)均為2 年平均值。

1.3 基因組DNA 提取與抗性基因分子檢測

取0.1 g 水稻葉片， 用水稻基因組DNA 提取試劑盒（易思得生物科技有限公司）提取基因組DNA。

常規(guī)PCR 反應總體系20 μL，內含1× BlueStarTMPCR Master Mix（北京擎科生物科技有限公司）、上下游引物各1.5 μmol/L 及基因組DNA 50 ng。 PCR 反應程序： 95℃預變性5 min；94℃變性30 s，退火時間30 s，72℃延伸30~60 s，共35 個循環(huán)；72℃再次延伸5 min，最后保持在16℃。 PCR 產(chǎn)物采用2.5%瓊脂糖凝膠進行電泳，用紫外凝膠成像儀拍照。 而需要測序或用CAPS/dCAPS 標記驗證的部分基因，PCR 反應總體系50 μL， 內含1× Phanta Max 緩沖液、dNTP 0.2 mmol/L、Phanta Max 高保真DNA 聚合酶 （南京諾唯贊生物科技股份有限公司）、 上下游引物各1.5 μmol/L 及基因組DNA 50 ng。 PCR 反應 程序：98℃預變性3 min；98℃變性10 s，退火時間15 s，72℃延伸30~60 s，共35 個循環(huán)；72℃再次延伸5 min，最后保持在16℃。 PCR 產(chǎn)物經(jīng)2.5%瓊脂糖凝膠電泳后切膠純化DNA 片段，而后送北京擎科生物科技有限公司測序。 酶切反應體系：總體積30 μL，內含3 μL PCR 產(chǎn)物、1 μL 限制性內切酶及1× 反應緩沖液。 所有基因分析的相關引物序列見表1。

表1 抗病基因的分子標記和基因克隆的引物

2 結果與分析

2.1 稻米食味品質相關基因的分子特征

除Wx 基因外，Tian 等[11]和謝米雪等[12]根據(jù)關鍵核苷酸多態(tài)性均將水稻淀粉合成途徑中的其他重要基因分成2 種單倍型， 其中SBE3 基因的3’UTR 第63 個堿基的變異將導致SpeI 限制性內切位點的改變，缺失的為Ⅰ型，反之則為Ⅱ型；AGPiso 基因的終止密碼子下游第532 個堿基G 的變異導致EcoRI 限制性內切位點的改變，缺失的為Ⅰ型，反之則為Ⅱ型；AGPlar 基因的起始密碼子上游第1 633 個堿基存在C/T 的變異，含C 的為Ⅰ型，含T 的為Ⅱ型；ISA 基因的起始密碼子上游第1 499 個堿基存在C/G 的變異，含C 的為Ⅰ型，含G 的為Ⅱ型；SSII-3 基因的起始密碼子后的第4 329 個及第4 330 個堿基存在GC/TT的變異，含TT 的為Ⅰ型，含GC 的為Ⅱ型；SSI 基因的起始密碼子后的第3 216 個堿基存在A/T 的變異，含T 的為Ⅰ型，含A 的為Ⅱ型；SSIV-2 基因的起始密碼子后的第437 個堿基存在InDel 差異，擴增片段大小為210 bp 的為Ⅰ型，而片段大小為198 bp 的為Ⅱ型。 同時研究發(fā)現(xiàn)， 含有Ⅱ型SSI 和AGPlar 及Ⅰ型SSII-3 的稻米直鏈淀粉含量相對更低； 含Ⅰ型AGPiso、SBE3 和ISA 基因的稻米糊化溫度相對更低；含有Ⅱ型SBE3、ISA 和SSIV-2 及Ⅰ型SSII-3 的稻米堿消值相對更低。分析浙粳78 中的上述基因特性，結果發(fā)現(xiàn)SSII-3和SBE3 為I 型， 其他5 個基因為Ⅱ型（圖1）。

圖1 浙粳78 中與稻米食味及蒸煮品質相關基因的分子分型

2.2 稻瘟病抗性基因的鑒定

浙江省單季粳稻2 年區(qū)試結果顯示，浙粳78 的苗葉瘟均值及其最高級均值、穗瘟發(fā)病率均值及其最高級均值、穗瘟損失率均值及其最高級均值、稻瘟病綜合指數(shù)均值分別為1.5 級和3.0 級、5.5 級和7.0 級、1.5 級和2.0 級、2.9， 最終該品種的稻瘟病抗性定為中抗。 為了明確該品種中是否攜帶白葉枯病抗性基因， 利用已克隆抗性基因的功能型或緊密連鎖分子標記進行鑒定， 結果表明， 該品種中含有抗病基因Pish、Pib、Pi36、Pi-co39、Pita、Pikm2、Pik（圖2）。

圖2 稻瘟病抗性基因的PCR 鑒定

2.3 白葉枯病抗性基因的鑒定

2018 年和2019 年浙江省單季常規(guī)粳稻區(qū)試結果顯示，浙粳78 的白葉枯病均值及其最高級均值分別為2.0 級和3.0 級，該品種白葉枯病抗性綜合評定為中抗。 為了明確該品種中是否攜帶白葉枯病抗性基因， 利用已克隆抗性基因的功能型或緊密連鎖分子標記進行鑒定，結果表明，該品種中含有抗病基因Xa21（圖3）。 同時進一步對Xa25/xa25 基因測序并與已知抗性基因序列[13]比對分析，證實浙粳78 中含有抗病基因xa25（圖3、圖4）。

圖3 白葉枯病抗性基因的PCR 鑒定

圖4 xa25 基因的測序分析

3 討論與結論

優(yōu)質稻米，不僅需要漂亮的外觀品質，更在于優(yōu)異的內在蒸煮食味品質。 而后者是由糊化溫度、直鏈淀粉含量、膠稠度等理化指標間接決定，一般來說，優(yōu)質稻米具有較低直鏈淀粉含量、 較高膠稠度和較低糊化溫度等優(yōu)點。 研究顯示，含有Ⅰ型SSⅡ-3，Ⅱ型AGPlar 和SSⅠ稻米種質的直鏈淀粉含量相對更低； 含有Ⅱ型AGPsio、SBE3 和ISA 的膠稠度相對較高；而糊化溫度與堿消值反相關，含有Ⅱ型ISA 稻米種質的堿消值相對更低[11,14-15]。本研究結果顯示，浙粳78 中含有Ⅰ型SSⅡ-3 和SBE3， Ⅱ型ISA、AGPsio、SSIV-2、AGPlar 和SSⅠ。 因此，從直鏈淀粉及膠稠度的角度來看，該品種攜帶的基因均為優(yōu)良基因，而從堿消值的角度來看，ISA 則不是優(yōu)良基因。

要實現(xiàn)水稻生產(chǎn)的綠色生態(tài)發(fā)展， 培育多抗水稻新品種是最重要且經(jīng)濟有效的途徑。 根據(jù)寄主與病原物互作的性質， 可以把植物抗病性區(qū)分為垂直抗病性（vertical resistance）和水平抗病性（horizontal resistance）兩類[16-17]。 其中前者是通過植物病害抗性基因識別和它對應的病原物Avr 基因， 并產(chǎn)生高效?；钥剐悦庖叻磻淇剐猿潭雀?、有效性強被廣泛用于現(xiàn)代抗病育種和生產(chǎn)上[18]。本研究利用多種病害抗性基因的功能型或緊密連鎖分子標記， 并結合部分基因的PCR 克隆及測序分析，結果證實浙粳78攜帶有Pish、Pib、Pi36、Pi-co39、Pita 和Pikm2 等稻瘟病抗性基因， 以及白葉枯病抗性基因xa25 和Xa21，從而賦予該品種稻瘟病及白葉枯病雙中抗抗性。