有機(jī)酸分析柱在飼料酸化劑質(zhì)量檢測(cè)中的應(yīng)用研究

張?zhí)戽? 楊希國(guó) 陳玉艷 李麗 劉石鑫

【摘要】建立一種采用Aminex？HPX-87H有機(jī)酸分析柱分離，高效液相色譜法同步檢測(cè)飼料酸化劑中甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、乳酸、檸檬酸、蘋(píng)果酸含量的方法。樣品采用水超聲提取，應(yīng)用Aminex？HPX-87H有機(jī)酸分析柱，以0.01 mol/L硫酸溶液為流動(dòng)相，二極管陣列檢測(cè)器在210 nm進(jìn)行定量檢測(cè)。結(jié)果表明：有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)溶液線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.995，回收率均大于90.0%，變異系數(shù)小于10%。該方法具有專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高的特點(diǎn)。

【關(guān)鍵詞】高效液相色譜法；酸化劑；有機(jī)酸

【DOI編碼】10.3969/j.issn.1674-4977.2023.02.029 Study on the Application of Organic Acid Analysis Column in the Quality Detection of Feed Acidifier

ZHANG Tianshu1，YANG Xiguo2，CHEN Yuyan1，LI Li2，LIU Shixin2

（1.Liaoning Inspection，Examination & Certification Centre，Shenyang 110036，China；2.Liaoning General Fair Testing Co.，Ltd.，Shenyang 110026，China）

Abstract：To establish an Aminex？HEPX-87H organic acid analytical column for the simultaneous determination of formic acid，acetic acid， propionic acid，butyric acid，lactic acid，citric acid and malic acid in feed acidifiers by HPLC. The samples were extracted by ultrasonic water. Aminex？HEPX-87H organic acid analysis column was used for the quantitative detection at 210 nm with 0.01 mol/L sulfuric acid solution as the mobile phase and a diode array detector. The results showed that the linear relationship of organic acid standard solution was good，the correlation coefficients were all greater than 0.995，the recoveries were all greater than 90.0%，and the coefficient of variation was less than 10%. The method has the characteristics of strong specificity and high accuracy.

Key words：high-performance liquid chromatography；feed acidifier；organic acid

飼料酸化劑是指能提高飼料酸度（降低pH值）的一類(lèi)物質(zhì)。它能改變飼料的適口性，降低腸道pH值，提高消化酶活性，影響胃腸道微生物組成，并且可以直接參與體內(nèi)代謝、增強(qiáng)免疫功能，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收[1-3]。近年來(lái)，抗生素禁止用在動(dòng)物飼料上，酸化劑被視為在豬飼料中能夠有效替代抗生素的產(chǎn)品之一，在動(dòng)物飼養(yǎng)中得到廣泛應(yīng)用[4]。

飼料酸化劑一般分為無(wú)機(jī)酸和有機(jī)酸，其中有機(jī)酸在飼料工業(yè)中作為飼料酸化劑被廣泛應(yīng)用。為了更好地掌握酸化劑產(chǎn)品質(zhì)量，規(guī)范產(chǎn)品生產(chǎn)和使用，檢測(cè)機(jī)構(gòu)需要建立一種高效、便捷、快速、準(zhǔn)確的有機(jī)酸檢測(cè)方法。目前飼料中有機(jī)酸的分析方法有比色法和色譜法，比色法只能測(cè)定單一的有機(jī)酸，色譜法可以同時(shí)測(cè)定多種有機(jī)酸。應(yīng)用比色法復(fù)雜而且誤差大，很難滿足常規(guī)測(cè)定要求。食品加工業(yè)中多采用反相色譜柱分離測(cè)定有機(jī)酸[5-7]，其準(zhǔn)確性高、特異性強(qiáng)，可以同時(shí)測(cè)定多種有機(jī)酸。但同時(shí)測(cè)定甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、乳酸、檸檬酸、蘋(píng)果酸含量的檢測(cè)方法未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)建立了采用Aminex？HPX-87H有機(jī)酸專用分析柱分離，高效液相色譜法同步檢測(cè)飼料酸化劑中7種酸含量的方法。

1材料與方法

1.1儀器和試劑

電子天平（梅特勒）；Waters 2695型高效液相色譜儀，配二極管陣列檢測(cè)器（Waters公司）；超聲波水浴器；美國(guó)伯樂(lè)Bio-Rad Aminex？HPX-87H色譜分析柱：300 mm×7.8 mm；甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、乳酸、檸檬酸、蘋(píng)果酸標(biāo)準(zhǔn)品：含量大于98.0%，購(gòu)置于德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司；硫酸為優(yōu)級(jí)純?cè)噭?；?shí)驗(yàn)用水為二級(jí)水；二氧化硅由市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)而得。

1.2標(biāo)準(zhǔn)溶液配置

0.01 mol/L硫酸溶液：準(zhǔn)確量取0.3 mL硫酸，緩緩注入1 L水中，冷卻搖勻。標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：精密稱取0.1 g（精確到0.00001 g）甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、乳酸、檸檬酸、蘋(píng)果酸標(biāo)準(zhǔn)品，用水溶解并定容至10 mL容量瓶。該標(biāo)準(zhǔn)貯備液每毫升含甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、乳酸、檸檬酸、蘋(píng)果酸均為10 mg。

1.3樣品提取

準(zhǔn)確稱取樣品1 g（精確至0.0001 g），置于100 mL容量瓶中，加入70 mL去離子水，在40℃下超聲提取30 min，放至室溫，用去離子水定容至刻度，搖勻，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾后用高效液相色譜儀測(cè)定。

1.4色譜條件

色譜柱：Aminex？HPX-87H色譜柱（300 mm×7.8 mm）。柱溫：30℃。流動(dòng)相：0.01 mol/L硫酸溶液。流速：1.0 mL/ min。檢測(cè)器：二極管陣列檢測(cè)器。波長(zhǎng)：210 nm。進(jìn)樣體積：20.00μL。

2結(jié)果與分析

2.1色譜柱的選擇

有機(jī)酸為弱酸，易在水系流動(dòng)相中發(fā)生解離而不被非極性鍵合相保留，通常采用酸性磷酸氫鹽溶液抑制解離，改善有機(jī)酸的保留和分離。所以文獻(xiàn)中大部分選擇C18色譜柱，磷酸氫鹽溶液作為流動(dòng)相，但是磷酸氫鹽溶液會(huì)對(duì)色譜柱造成損害。

Aminex HPX-87H是BioRad的離子交換色譜柱（H+型），pH范圍在1～3之間，用于對(duì)含有羧酸、揮發(fā)性脂肪酸、短鏈脂肪酸、醇類(lèi)、酮類(lèi)以及許多中性新陳代謝副產(chǎn)物的溶液中的碳水化合物進(jìn)行分析，而且該色譜柱的典型流動(dòng)相是低濃度的硫酸。故本實(shí)驗(yàn)選用該色譜柱進(jìn)行飼料酸化劑中有機(jī)酸的研究，其特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高。

2.2流動(dòng)相的選擇

Aminex？HPX-87H色譜柱的典型流動(dòng)相為硫酸溶液。本實(shí)驗(yàn)研究了0.001 mol/L、0.005 mol/L和0.01 mol/L硫酸溶液作為流動(dòng)相時(shí)的出峰情況。結(jié)果表明：3種不同濃度的硫酸溶液作為流動(dòng)相時(shí)，目標(biāo)峰均可以得到很好的分離，但0.001 mol/L、0.005 mol/L硫酸溶液作為流動(dòng)相時(shí)，出峰時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，故本研究采用0.01 mol/L硫酸溶液作為流動(dòng)相為最佳?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)溶液圖譜見(jiàn)圖1。

2.3提取液的選擇

甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、乳酸、檸檬酸、蘋(píng)果酸均易溶于水，并且酸化劑的成分也比較簡(jiǎn)單，大部分是有機(jī)酸與無(wú)機(jī)載體混合物，所以不需要進(jìn)一步凈化，水提取后過(guò)濾膜直接上機(jī)測(cè)定即可。

2.4色譜柱溫度的選擇

Aminex？HPX-87H色譜柱的適宜溫度應(yīng)不超過(guò)65℃?？疾?0℃、35℃、40℃、50℃不同溫度下各種酸的出峰情況。結(jié)果表明：隨著溫度的升高，各種有機(jī)酸的分離度降低，峰型不佳，經(jīng)過(guò)試驗(yàn)研究，確定本試驗(yàn)的色譜柱溫度為30℃。

2.5標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定

準(zhǔn)確移取合適濃度的甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、乳酸、檸檬酸、蘋(píng)果酸混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量，用水配制成濃度為5μg/mL、20μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、500μg/mL、1000μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，上機(jī)測(cè)定。以目標(biāo)化合物峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明：甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、乳酸、檸檬酸、蘋(píng)果酸在5μg/mL至1000μg/mL范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)均大于0.995，線性關(guān)系良好。在本實(shí)驗(yàn)條件下，將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液連續(xù)稀釋后添加到空白試樣中，進(jìn)行添加回收，根據(jù)信噪比大于10、稱樣量和進(jìn)樣量計(jì)算，得出方法定量限。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.6準(zhǔn)確度和精密度試驗(yàn)

采用二氧化硅為載體，準(zhǔn)確稱取空白載體1 g（精確至0.0001 g）至100 mL容量瓶中，添加不同濃度的甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、乳酸、檸檬酸、蘋(píng)果酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，密封放置24小時(shí)后按上述確定的樣品提取和色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，以回收率衡量準(zhǔn)確度，以回收率的精密度衡量方法的精密度。七種有機(jī)酸的添加回收率在92.6%～102.4%之間，精密度在0.6%～ 3.5%之間，詳見(jiàn)表2。

2.7實(shí)際樣品檢測(cè)

應(yīng)用建立的檢測(cè)方法，選取市售4種有機(jī)酸飼料添加劑進(jìn)行檢測(cè)，樣品檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3，色譜圖見(jiàn)圖2-圖5。

對(duì)實(shí)際樣品的測(cè)定結(jié)果表明：利用有機(jī)酸分析柱可同時(shí)測(cè)定飼料酸化劑中甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、乳酸、檸檬酸、蘋(píng)果酸的含量。此方法操作簡(jiǎn)單，效率高，可以滿足日常檢測(cè)需求。

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【作者簡(jiǎn)介】

張?zhí)戽?985年出生，高級(jí)畜牧師，碩士，研究方向?yàn)閯?dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料安全。

（編輯：李加鵬）