黃豆黃素純度標準物質研制

劉清毅，李全發(fā)，周劍，王敏，楊夢瑞，王彤彤，于寒松

（1.中國農業(yè)科學院農業(yè)質量標準與檢測技術研究所，農業(yè)農村部農產品質量安全重點實驗室，北京 100081；2.吉林農業(yè)大學食品科學與工程學院，長春 130118）

黃豆黃素是一種大豆異黃酮，具有雌性激素及抗雌激素性質。它對于降低前列腺癌、乳腺癌等疾病的發(fā)病率，減輕骨質疏松癥和其它因雌激素缺乏導致的綜合癥具有重要功效，而且它還可以預防心血管等疾病[1]。大豆異黃酮也可以用作動物生產的調節(jié)劑和促進劑，起到促進動物繁殖、泌乳和生長的作用[2]。鑒于其具有多種有益功效，黃豆黃素常被作為一種功能強化劑添加入食品、保健品或飼料產品中[3]，然而，經國家標準物質資源平臺查詢，目前還沒有黃豆黃素純度標準物質，市售標準品良莠不齊，存在量值偏差，制約了黃豆黃素的準確測量。

標準物質作為保證測量準確性的重要因素，在量值傳遞、評價方法和儀器校準中發(fā)揮著重要作用。筆者采用市售標準品，經過純化處理和定性確證后，采用兩種不同原理的高準確度純度定值方法定值，滿足JJF 1855—2020[4]對于純度標準物質研制的要求，對于保證黃豆黃素含量的準確測量提供了技術支撐。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

紅外光譜儀：IRT racer-100型，日本SHIMADZU公司。

質譜儀：(1)Triple Quad 3500 型；(2)TOF MS6600型。美國AB SCIEX公司。

核磁共振儀：AVANCE Ⅲ型，400 MHz，瑞士布魯克公司。

電子天平：(1)UMX2 型，感量為0.001 mg；(2)XS105 型，感量為0.01 mg。瑞士梅特勒-托利多公司。

水分滴定儀：DL32 型，瑞士梅特勒-托利多公司。

氣相色譜儀：7890型，配有7697 A頂空進樣器，美國安捷倫科技有限公司。

高效液相色譜儀：2695型，美國沃特世公司。電感耦合等離子體質譜儀：X series 2 型，美國賽默飛世爾科技公司。

真空冷凍干燥機：Genesis 25L 型，中國香港德祥公司。

電恒溫培養(yǎng)箱：DHP-600 s型，溫度范圍為25～65 ℃，上?？坪銓崢I(yè)發(fā)展有限公司。

黃豆黃素標準品：標稱純度(質量分數(shù))大于98%，四川格純生物醫(yī)藥有限公司。

苯甲酸標準物質：國家一級標準物質，標準物質編號為GBW 06117，純度(質量分數(shù))為99.993%，中國計量科學研究院。

氘代乙酸、氘代甲醇、氘代N，N-二甲基甲酰胺、氘水和氘代二甲基亞砜：分析純，北京百靈威科技有限公司。

甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、二氯甲烷、乙酸乙酯、異丙醇、二甲苯、正己烷：色譜純，德國默克公司。

磷酸、硝酸、雙氧水：優(yōu)級純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

鋁、鈣、銅等單元素溶液標準物質：標準物質編號、各元素質量濃度見表1，中國計量科學研究院。

表1 單元素溶液標準物質

1.2 實驗方法

1.2.1 原料純化

選用黃豆黃素標準品作為標準物質候選物，使用烘箱和真空冷凍干燥機對樣品進行加熱和冷凍干燥除水，使用卡爾費休庫倫滴定法確定樣品含水量為0.30%。初測液相純度大于99%。

1.2.2 定性分析

分別采用紅外光譜法、質譜法和核磁氫譜法，對純化后的黃豆黃素原料進行定性確認。

1.2.3 均勻性檢驗

根據(jù)JJF 1343—2012[5]的技術要求，對分裝好的黃豆黃素標準物質隨機抽樣，抽樣原則應盡量覆蓋分裝過程各個時間段，隨機抽取11個包裝單位進行均勻性檢驗，每個單元配制三個子樣，稱樣量均為5 mg，分別配制成質量濃度為500 mg/L 的甲醇溶液，對配制的溶液進行編號，從1到11。每個溶液進行3次測定，測定順序依次為1，2，3，…，11；11，10，9，…，1；1，2，3，…，11。

1.2.4 穩(wěn)定性檢驗

標準物質的穩(wěn)定性是其基本屬性，主要包括長期保存的穩(wěn)定性和運輸過程中的穩(wěn)定性。以JJF 1343—2012的基本要求為基礎，設計了長期穩(wěn)定性檢驗試驗和短期穩(wěn)定性檢驗試驗，均采用擬合直線對試驗結果進行統(tǒng)計分析。長期穩(wěn)定檢驗采用規(guī)范推薦的經典評估方式，時間點為0、1、3、6、12 個月；短期穩(wěn)定性檢驗采用規(guī)范推薦的同步檢驗方式，溫度分別設定為20、40、60 ℃，考察時間為0、1、3、5、7天。

1.2.5 純度定值

(1)質量平衡法純度定值。質量平衡法[6]也叫雜質扣除法，是一種對目標化合物主成分純度、各個雜質分別測量，并獲得目標物最終純度的方法。本實驗采用液相色譜主成分色譜峰面積歸一化法[7]測定黃豆黃素純度，采用卡爾費休庫倫法[8]測定水分含量，采用頂空氣相色譜法[9]測定揮發(fā)性雜質含量，采用電感耦合等離子體質譜法[10]測定不揮發(fā)性雜質含量。測量設備如天平、容量瓶、液相色譜等儀器均經過計量檢定，以保證測量結果的準確性、溯源性。

(2)定量核磁法純度定值。定量核磁法[11]是通過測量目標物和內標的不同原子核共振吸收峰的面積，并結合吸收峰對應的原子數(shù)計算目標物純度值，這種純度定值方法主要通過選擇國家一級純度標準物質作為內標物，采用內標法定值，通過優(yōu)化核磁條件，準確測量不同原子核吸收峰，進一步實現(xiàn)純度的準確測量，并將定量核磁測量結果通過有證純度標準物質直接溯源到SI單位。

1.2.6 不確定度評定

研制的純度標準物質的不確定度來源主要包括三個方面，分別是(1)定值過程引入的不確定度；(2)純度不均勻引入的不確定度[12]；(3)不穩(wěn)定性引入的不確定度[13]。其中定值過程引入的不確定度按照JJF 1855—2021 進行評定，主要包括質量平衡法定值引入的不確定度和定量核磁法定值引入的不確定度。

2 結果與討論

2.1 標準物質候選物選擇及純化

選用四川格純生物醫(yī)藥有限公司市售的黃豆黃素作為標準物質候選物，使用烘箱和真空冷凍干燥機對樣品進行加熱和冷凍干燥除水后，使用卡爾費休庫倫滴定法確定樣品含水量為0.30%。初測液相純度大于99%。使用1.5 mL 棕色進樣小瓶對充分混勻的樣品，在潔凈、干燥的環(huán)境下[溫度(20±5) ℃，濕度(40±10)%進行分裝。每瓶樣品包裝量為20 mg，共分裝113個單元，分裝好的樣品貯存于干燥器內，于(20±5) ℃下干燥避光保存。

2.2 定性分析

圖1 為黃豆黃素標準物質候選物紅外光譜圖，對特征峰進行歸屬分析，主要特征吸收峰跟黃豆黃素結構相符合。圖2為黃豆黃素標準物質候選物的質譜圖，主要碎片離子質荷比(m/z)分別為285.1、270.1、242.2，與文獻[14]記載的定性離子對相符合，經過分析可知，這些質譜峰分別屬于[M+H]+、[M+H-OH]+和[M+H-CHO]+。

圖1 黃豆黃素標準物質候選物的紅外光譜圖

圖2 黃豆黃素標準物質候選物的質譜圖

圖3 為黃豆黃素標準物質候選物的核磁氫譜圖，典型的化學位移值均與黃豆黃素結構相對應，分別為3.86×10-6對應于21 號C 上所連的氫；6.79×10-6～6.83×10-6對應于14、16 號碳上所連的氫；6.94×10-6對應于6 號碳上所連的氫；7.37×10-6～7.39×10-6對應于13、17 號碳上所連的氫；7.43×10-6對應于3 號碳上所連的氫；8.26×10-6對應于22 號C上所連的氫；9.50×10-6對應于18 號C 上所連的氫。經紅外、質譜和核磁多種定性手段分析，可以確認標準物質候選物為黃豆黃素。

圖3 黃豆黃素標準物質候選物的核磁氫譜圖

2.3 均勻性檢驗

按照1.2.3 方法進行黃豆黃素純度標準物質均勻性檢驗，測量結果見表2。由表2數(shù)據(jù)計算得總標準偏差s=0.02，總平均值為99.19%，組間方差和為0.000 58，組內方差和為0.000 35，F(xiàn)=1.64。查表知F0.05(10，22)=2.30，F(xiàn)＜F0.05(10，22)，表明當取樣量為5 mg時，樣品均勻性良好，因此，在本標準物質研制項目中，黃豆黃素純度標準物質以5 mg 作為最小取樣量。

表2 黃豆黃素純度標準物質量值均勻性評定結果

2.4 穩(wěn)定性檢驗

按照1.2.4方法，按照先密后疏的原則對黃豆黃素純度標準物質穩(wěn)定性進行檢驗，表3和表4分別為長期穩(wěn)定性檢測結果和統(tǒng)計結果，表5和表6分別是短期穩(wěn)定性檢驗結果和統(tǒng)計結果。斜率β1和截距β0是對各個時間點檢測結果平均值擬合直線獲得，統(tǒng)計結果均顯示|β1|＜t0.95，3?s(β1)。所以判斷本標準物質在設定的保存溫度下，12個月內量值沒有趨勢性變化。在低于60 ℃的運輸條件下，7天內可保證純度量值穩(wěn)定。

表3 黃豆黃素純度標準物質長期穩(wěn)定性檢測結果

表4 黃豆黃素純度標準物質長期穩(wěn)定性統(tǒng)計結果

表5 黃豆黃素純度標準物質量值短期穩(wěn)定性檢驗結果

表6 黃豆黃素純度標準物質量值短期穩(wěn)定性檢驗結果

2.5 純度定值

2.5.1 質量平衡法純度定值

質量平衡法按照式(1)對黃豆黃素純度標準物質定值：

式中：PMB——樣品質量分數(shù)；

P0——主成分質量分數(shù)；

XW——水分質量分數(shù)；

Xn——非揮發(fā)性雜質質量分數(shù)；

Xv——揮發(fā)性雜質質量分數(shù)[15]。

通過比較不同色譜柱、不同流動相、不同分析波長，確定最優(yōu)的檢測條件，主要包括采用Agilent Plus -C18(250 mm×4.6 mm，5.0 μm)液相色譜柱，采用乙腈和0.15%磷酸水溶液作為流動相，流動相體積比為25：75，流量為1.0 mL/min，檢測波長選擇261 nm。將目標標準物質樣品配制成500 mg/L 的甲醇溶液，在上述色譜條件下平行測定6次，得到主成分的質量分數(shù)。

采用卡爾費休法進行水分測定，測定前采用固體水分標準物質校準測量方法，對黃豆黃素水分含量進行6 次平行測定，每次取樣質量為5～7 mg，因為是固體進樣，測量過程中開蓋容易引入空氣中的水分，造成測量不準確[16]，因此水分測定結果應扣除試驗過程中開蓋引入的空氣中水分值，該水分值采用模擬加樣過程測定獲得。

采用基于氫火焰檢測器的頂空氣相色譜法對揮發(fā)性雜質進行測定，稱取20 mg 黃豆黃素于20 mL頂空瓶中，加入2 mL 二甲亞砜溶解，采用甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、二氯甲烷、乙酸乙酯、異丙醇、二甲苯、正己烷9種有機溶劑為揮發(fā)性雜質的對照，用單點法定量。

采用電感耦合等離子體質譜法分析黃豆黃素中23種常見元素含量，以元素含量之和作為不揮發(fā)性雜質含量。

黃豆黃素純度標準物質主成分、水分、有機揮發(fā)性雜質、無機非揮發(fā)性雜質含量測定及標準物質定值結果列于表7。

表7 黃豆黃素純度標準物質質量平衡法純度(質量分數(shù))定值結果%

2.5.2 定量核磁法純度定值

定量核磁法按照式(2)對黃豆黃素純度標準物質定值[17]：

式中：PNMR——黃豆黃素質量分數(shù)；

Ix——黃豆黃素定量峰的積分面積；

Istd——內標物苯甲酸定量峰的積分面積；

nstd——內標物苯甲酸化學式中定量峰對應的H原子數(shù)量；

nx——黃豆黃素在化學式中定量峰對應的H原子數(shù)量；

Mx——黃豆黃素的相對分子質量；

Mstd——內標物苯甲酸的相對分子質量；

mstd——添加的內標物苯甲酸的質量，g；

mx——黃豆黃素的稱樣質量，g；

Pstd——內標物苯甲酸的純度(質量分數(shù))。

為保證定量核磁法定值的準確性，針對氘代溶劑、內標物、定量峰位置、激發(fā)脈沖角度、弛豫時間以及累計采樣次數(shù)進行了試驗，經優(yōu)化確定定值用核磁條件：激發(fā)脈沖角度為30°，采樣時間為4.823 5 s，時間域數(shù)據(jù)點為64 K，掃描譜寬(SWH)為17.0×10-6，激發(fā)中心(O1P)為8.15×10-6，掃描寬度為6 793.478 Hz，弛豫延遲(D1)為13.99 s，偏置頻率為3 253.22 Hz，接收增益為322，探頭溫度為293.8 K，脈沖序列為zg30，累計采樣次數(shù)為128次，定量峰為8.36×10-6(Hz)和8.02×10-6(dt，J = 8.0，2.0 Hz)。定量核磁法對黃豆黃素純度標準物質6 次定值結果均值為99.13%，標準偏差為0.023%。

按照JJF 1855—2020 要求，對不同的定值結果應采用F檢驗進行等精度檢驗，然后再采用t檢驗進行平均值一致性檢驗，本研究中，兩種定值方法的結果均通過了F和t檢驗，說明兩種方法等精度且平均值一致，因此，黃豆黃素純度標準物質的量值以兩種定值結果的平均值表示，最終定值結果為99.1%。

2.6 定值不確定度

黃豆黃素純度標準物質的定值不確定度主要來源于：(1)樣品均勻性；(2)樣品穩(wěn)定性；(3)定值方法。表8列出了各不確定度分量，將表8數(shù)據(jù)合成，得到定值結果的相對標準不確定度urel=0.15%，取包含因子k=2，則相對擴展不確定度Urel=k·urel=0.3%，擴展不確定度為0.3%，定值結果為(99.1±0.3)%。

表8 黃豆黃素標準物質不確定度評定結果

3 結語

采用三種方法對經純化處理后的黃豆黃素標準物質進行定性分析，并確證樣品。采用兩種不同原理的方法對標準物質進行純度定值，采用質量平衡法進行均勻性檢驗和穩(wěn)定性檢驗，并對定值結果的不確定度進行了系統(tǒng)評定。研制的黃豆黃素純度標準物質已經成功申報國家一級標準物質。