咪達(dá)唑侖抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移并誘導(dǎo)其凋亡

季英龍,周全軍,冀國力（濰坊市中醫(yī)院麻醉二科，山東 濰坊 261041）

骨肉瘤是一種常見于兒童和青少年的骨惡性腫瘤，病死率和致殘率高。盡管在接受手術(shù)和輔助化療后，非轉(zhuǎn)移性患者的5年生存率可達(dá)60%，但轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)患者長期生存率較低[1]。因此，有必要開發(fā)一種新藥來改善不良的臨床結(jié)局。近年來，麻醉藥被報道可影響腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，參與癌癥轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)，從而影響患者預(yù)后[2]。咪達(dá)唑侖作為術(shù)前用藥，具有抗焦慮和鎮(zhèn)靜作用，有利于緩解患者術(shù)前焦慮[3-4]，可誘導(dǎo)肺癌和胃癌細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖，并抑制肺癌裸鼠移植瘤形成[5-6]。此外，咪達(dá)唑侖還可通過ERK 通路影響肝癌細(xì)胞周期和增殖[7]。然而，咪達(dá)唑侖對骨肉瘤細(xì)胞惡性潛能的影響尚未見報道。環(huán)狀RNA（circRNA）是具有閉環(huán)結(jié)構(gòu)的非編碼RNA，其在骨肉瘤進(jìn)展中具有重要作用[8]。以往研究表明，circ-NOL10 在肺癌和結(jié)直腸癌中低表達(dá)，上調(diào)circNOL10表達(dá)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞惡性潛能[9-10]。然而，circNOL10在骨肉瘤進(jìn)展中的作用尚不清楚。因此，本研究探討咪達(dá)唑侖和circNOL10 在骨肉瘤細(xì)胞增殖、凋亡和遷移中的作用，并探討咪達(dá)唑侖是否可通過調(diào)控circ-NOL10發(fā)揮抗腫瘤活性，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 組織樣本與細(xì)胞

收集2020年1月至2021年12月于濰坊市中醫(yī)院接受完全切除的38例骨肉瘤患者的骨肉瘤組織和鄰近的非腫瘤骨組織（距匹配的骨肉瘤標(biāo)本超過3 cm）。組織立即儲存在-80 ℃冰箱中。患者術(shù)前均未進(jìn)行抗癌治療。本研究經(jīng)濰坊市中醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（20190607024），所有患者均簽署對本研究的知情同意書。人骨肉瘤細(xì)胞系MG63、U2OS、SAOS2、HOS、143B和正常成骨細(xì)胞系hFOB1.19購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心。所有細(xì)胞系均培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2及含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。

1.2 主要試劑

咪達(dá)唑侖（批號：210913）購自江蘇恩華藥業(yè)公司；si-NC、si-circNOL10、pcDNA、pcDNA-circNOL10 購自南京金斯瑞生物公司；兔源E鈣黏蛋白（E-cadherin）多克隆抗體（AF0131）、兔源N-cadherin 多克隆抗體（DF3530）購自美國Affinity公司；羊抗兔IgG（ab205718）、CCK-8試劑盒、兔源GAPDH 多克隆抗體（ab245357）購自美國Abcam 公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green qPCR master mix購自北京Takara公司；Annexin V-FITC/PI凋亡雙染檢測試劑盒購自上海銳賽生物公司；Transwell室購自美國BD公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及分組

U2OS細(xì)胞置于含10%胎牛血清、1%青-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育。在24 孔板中接種對數(shù)期U2OS 細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞匯合達(dá)60%時，用脂質(zhì)體2000 將30 nmol/L 寡核苷酸（si-NC、si-circNOL10）或2 μg載體（pcDNA、pcDNA-circNOL10）轉(zhuǎn)染U2OS 細(xì)胞，分別記為si-NC 組、si-circNOL10 組、pcDNA組和pcDNA-circNOL10組。轉(zhuǎn)染48 h后，qRT-PCR檢測細(xì)胞中circNOL10的表達(dá)情況以驗證轉(zhuǎn)染效果，然后進(jìn)行后續(xù)實驗。

用含0 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L咪達(dá)唑侖[7]的培養(yǎng)液孵育U2OS細(xì)胞，分別記為對照組、低咪達(dá)唑侖組、中咪達(dá)唑侖組、高咪達(dá)唑侖組；轉(zhuǎn)染pcDNA-circNOL10、pcDNA 的U2OS 細(xì)胞分別記為pcDNA-circNOL10 組、pcDNA 組；用含100 μmol/L 咪達(dá)唑侖的培養(yǎng)液孵育轉(zhuǎn)染si-NC、si-circNOL10 的U2OS細(xì)胞，分別記為咪達(dá)唑侖+si-NC 組、咪達(dá)唑侖+si-circNOL10組。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測U2OS細(xì)胞凋亡率

用500 μL 結(jié)合緩沖液重懸1×106個U2OS細(xì)胞，加入10 μL Annexin-V FITC 溶液，室溫孵育30 min，再將5 μL PI 溶液加入到U2OS 細(xì)胞中混勻，采用流式細(xì)胞術(shù)評估細(xì)胞凋亡率。

1.5 CCK-8法檢測U2OS細(xì)胞增殖活性

將未經(jīng)轉(zhuǎn)染（對照組）或經(jīng)轉(zhuǎn)染的U2OS 細(xì)胞接種于96 孔板，貼壁后用含0 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L 咪達(dá)唑侖的培養(yǎng)液孵育48 h，然后用CCK-8檢測細(xì)胞在450 nm處的吸光度（absorbance,A）。抑制率（%）=（A對照細(xì)胞-A處理細(xì)胞）/A對照細(xì)胞×100%。

1.6 Transwell實驗檢測U2OS細(xì)胞遷移能力

RIPA 法提取蛋白后，通過SDS-PAGE 分離等量蛋白，然后濕轉(zhuǎn)到PVDF膜上。5%脫脂奶粉阻斷膜后，分別加入一抗E-cadherin（1:1 000）、N-cadherin（1∶1 000）和GAPDH（1∶2 000），于4 ℃孵育過夜，再與二抗（1∶1 000）室溫孵育膜2 h?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測蛋白條帶，用Image J軟件分析免疫反應(yīng)條帶的相對密度以表示蛋白水平。

1.7 qRT-PCR檢測circNOL10表達(dá)

與對照組比較，低咪達(dá)唑侖組、中咪達(dá)唑侖組、高咪達(dá)唑侖組U2OS 細(xì)胞E-cadherin 蛋白水平顯著升高（P＜0.05），遷移細(xì)胞數(shù)、N-cadherin 蛋白水平顯著減少/降低（P＜0.05），見圖3、4。

1.8 Western blot 檢測E-cadherin 和N-cadherin 蛋白表達(dá)

用無血清培養(yǎng)液重懸各組U2OS 細(xì)胞，并接種200 μL 細(xì)胞懸液于Transwell 上室，下室加入完全培養(yǎng)液。孵育24 h后，用棉簽去除聚碳酸酯膜頂部的非遷移細(xì)胞，用1%多聚甲醛固定膜底部遷移30 min，用1%結(jié)晶紫染色。用倒置顯微鏡采集遷移圖像，以5個隨機(jī)視野細(xì)胞數(shù)均值表示遷移數(shù)量。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

骨肉瘤是常見的骨惡性腫瘤，患者病死率高，預(yù)后差。近年來研究發(fā)現(xiàn)，靜脈麻醉藥物對腫瘤細(xì)胞（包括骨肉瘤）的增殖、凋亡與轉(zhuǎn)移有直接作用；如丙泊酚可有效抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖和侵襲，誘導(dǎo)其凋亡[11]。咪達(dá)唑侖作為常用的靜脈麻醉藥物，已被用于腫瘤患者術(shù)前麻醉誘導(dǎo)和圍術(shù)期鎮(zhèn)靜，且研究證實其在多種癌癥中具有抗癌作用[5-7]。Shen 等[12]研究發(fā)現(xiàn)，咪達(dá)唑侖可抑制肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，低、中、高劑量的咪達(dá)唑侖處理U2OS細(xì)胞后，其凋亡率和增殖抑制率升高，且隨著劑量增加，咪達(dá)唑侖的效果逐漸增強(qiáng)，表明咪達(dá)唑侖可通過抑制U2OS 細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡而發(fā)揮抗骨肉瘤作用。

首先，要在危險品道路運(yùn)輸中引入衛(wèi)星定位系統(tǒng)、無線射頻技術(shù)以及地理信息系統(tǒng)等現(xiàn)代化的技術(shù)，實現(xiàn)對危險品道路運(yùn)輸?shù)倪^程監(jiān)督，并在發(fā)生事故時向有關(guān)部門提供應(yīng)急救援的基礎(chǔ)支持。但是，當(dāng)前這些現(xiàn)代化信息技術(shù)網(wǎng)絡(luò)都是單獨運(yùn)行的，只可以在企業(yè)內(nèi)部進(jìn)行的危險品裝載車輛信息進(jìn)行監(jiān)管。因此,必須采用信息化的技術(shù)手段，在長江三角洲內(nèi)部建立危險貨物運(yùn)輸管理信息系統(tǒng)并與各地區(qū)實現(xiàn)互通，來實現(xiàn)實時化、動態(tài)化、全過程的管理。

2 結(jié)果

2.1 circNOL10在骨肉瘤組織和細(xì)胞的表達(dá)情況

與正常組織比較，circNOL10 在骨肉瘤組織中的表達(dá)顯著降低（P＜0.05），見圖1a。此外，與正常成骨細(xì)胞系hFOB1.19 比較，骨肉瘤細(xì)胞系U2OS、MG63、SAOS2、HOS、143B 中circNOL10 的表達(dá)顯著降低（P＜0.05），其中U2OS細(xì)胞中circNOL10的表達(dá)水平最低，見圖1b。因此，選擇U2OS細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

圖1 circNOL10在骨肉瘤組織和細(xì)胞中的表達(dá)

2.2 咪達(dá)唑侖對骨肉瘤U2OS細(xì)胞增殖、凋亡的影響

與對照組比較，低咪達(dá)唑侖組、中咪達(dá)唑侖組、高咪達(dá)唑侖組U2OS 細(xì)胞circNOL10 表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），見圖5。

自動化的電網(wǎng)調(diào)度系統(tǒng)已經(jīng)建立，但是與此相適應(yīng)的認(rèn)識上的發(fā)展和技術(shù)上的進(jìn)步卻沒有得到同步發(fā)展，電網(wǎng)調(diào)度員的自身素質(zhì)直接影響了電網(wǎng)的安全運(yùn)行。例如，電網(wǎng)調(diào)度系統(tǒng)已經(jīng)自動化了，但是許多調(diào)度員由于認(rèn)識的不到位和業(yè)務(wù)素質(zhì)的欠缺，仍然使用的是以前的手工操作的方法。現(xiàn)實中經(jīng)常會出現(xiàn)幾張申請票對應(yīng)一張操作票的現(xiàn)象，靠手工作業(yè)的方法有時候難免會有遺漏，申請票一旦遺漏將會出現(xiàn)申請票還在執(zhí)行中就給電的現(xiàn)象，結(jié)果將是造成惡性事故的發(fā)生，2004年華東網(wǎng)發(fā)生的惡性誤操作事故就是由于此原因。

圖2 咪達(dá)唑侖對骨肉瘤U2OS細(xì)胞增殖抑制率、凋亡率的影響

2.3 咪達(dá)唑侖對骨肉瘤U2OS細(xì)胞遷移的影響

用TRIzol 試劑從骨肉瘤組織和細(xì)胞以及各組U2OS 細(xì)胞中分離總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成互補(bǔ)DNA，以互補(bǔ)DNA 為模板進(jìn)行qRT-PCR 擴(kuò)增，檢測circNOL10 表達(dá)。以GAPDH 為內(nèi)參，用2-ΔΔCt方法評估circNOL10 表達(dá)水平。 circNOL10 上游引物為5'-CCCAACTCAGGCATGCTTCT-3'，下游引物為5'-CCCTCTATGGTTCCTGTGGC-3'；GAPDH 上游引物為5'-TCCCATCACCATCTTCCAGG-3'，下游引物為5'-GATGACCCTTTTGGCTCCC-3'。

圖3 咪達(dá)唑侖對骨肉瘤U2OS細(xì)胞遷移的影響

圖4 咪達(dá)唑侖對骨肉瘤U2OS細(xì)胞遷移的影響

2.4 咪達(dá)唑侖對骨肉瘤U2OS 細(xì)胞中circNOL10 表達(dá)的影響

與對照組比較，低咪達(dá)唑侖組、中咪達(dá)唑侖組、高咪達(dá)唑侖組U2OS 細(xì)胞抑制率、凋亡率顯著升高（P＜0.05），見圖2。

圖5 咪達(dá)唑侖對骨肉瘤U2OS細(xì)胞中circNOL10表達(dá)的影響

2.5 circNOL10轉(zhuǎn)染效率檢測

pcDNA-circNOL10 組U2OS 細(xì)胞中circNOL10 表達(dá)水平較pcDNA 組顯著升高（P＜0.05），提示pcDNA-circNOL10 轉(zhuǎn)染成功。si-circNOL10 組U2OS細(xì)胞中circNOL10 表達(dá)水平較si-NC 組顯著降低（P＜0.05），提示成功沉默circNOL10 可抑制circ-NOL10 表達(dá)，見圖6。

圖6 circNOL10轉(zhuǎn)染效率

2.6 circNOL10 對骨肉瘤U2OS 細(xì)胞增殖、凋亡、遷移的影響

與pcDNA 組比較，pcDNA-circNOL10 組U2OS 細(xì)胞抑制率、凋亡率、E-cadherin 蛋白水平顯著升高（P＜0.05），遷移細(xì)胞數(shù)、N-cadherin 蛋白水平顯著減少/降低（P＜0.05），見表1。

表1 circNOL10對骨肉瘤U2OS細(xì)胞增殖、凋亡、遷移的影響（±s，n=9）

表1 circNOL10對骨肉瘤U2OS細(xì)胞增殖、凋亡、遷移的影響（±s，n=9）

*：與pcDNA組比較，P＜0.05

組別pcDNA組pcDNA-circNOL10組t P抑制率（%）0.00±0.00 25.28±3.14*24.153＜0.001凋亡率（%）6.50±0.48 19.82±0.84*41.304＜0.001遷移細(xì)胞數(shù)（個）169.78±7.49 84.22±3.71*30.709＜0.001 E-cadherin 0.21±0.03 0.55±0.04*20.400＜0.001 N-cadherin 0.66±0.06 0.25±0.02*19.448＜0.001

2.7 抑制circNOL10 表達(dá)逆轉(zhuǎn)咪達(dá)唑侖對骨肉瘤U2OS細(xì)胞增殖、凋亡、遷移的影響

展開部長達(dá)120個小節(jié)（第95至214小節(jié)），在g小調(diào)上開始，使用了主部的主題材料。經(jīng)過一系列的離調(diào)（a小調(diào)、d小調(diào)、c小調(diào)、降b小調(diào)）之后，在第150小節(jié)上，以降b小調(diào)出現(xiàn)了“假再現(xiàn)部”。然后在第161小節(jié)持續(xù)強(qiáng)調(diào)低音的降B音，右手則以半音上升，達(dá)到升G音，形成增六和弦，以不斷增強(qiáng)的力度，強(qiáng)力返回到d小調(diào)的屬和弦，為再現(xiàn)部的出現(xiàn)作準(zhǔn)備。尾聲之前再次出現(xiàn)類似手法，第323小節(jié)起，貝多芬不斷地重復(fù)一個短小的音型，先是g小調(diào)，然后a小調(diào)，在第335小節(jié)，低音A持續(xù)了整整十六個小節(jié)，漸弱至pp，突然以ff返回主題，進(jìn)入尾聲，其效果極其富有戲劇性。

表2 抑制circNOL10對咪達(dá)唑侖處理的骨肉瘤U2OS細(xì)胞增殖、凋亡、遷移的影響（±s，n=9）

表2 抑制circNOL10對咪達(dá)唑侖處理的骨肉瘤U2OS細(xì)胞增殖、凋亡、遷移的影響（±s，n=9）

*：與咪達(dá)唑侖+si-NC組比較，P＜0.05

組別咪達(dá)唑侖+si-NC組咪達(dá)唑侖+si-circNOL10組t P抑制率（%）35.34±2.72 13.50±1.39*21.450 0.000凋亡率（%）22.22±1.21 12.12±0.60*22.435 0.000遷移細(xì)胞數(shù)（個）65.67±2.40 131.56±5.06*35.296 0.000 E-cadherin 0.74±0.05 0.40±0.05*14.425 0.000 N-cadherin 0.14±0.02 0.41±0.05*15.041 0.000

3 討論

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，2 組間比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

首先，旅游危機(jī)事件當(dāng)事人和利益攸關(guān)方是網(wǎng)絡(luò)輿情的主要發(fā)布者和傳播者。該主體發(fā)布的信息從根源上決定了旅游危機(jī)事件網(wǎng)絡(luò)輿情的傳播內(nèi)容和信息，其發(fā)布的關(guān)于旅游危機(jī)事件的網(wǎng)絡(luò)輿情信息比其他任何傳播主體發(fā)布的信息都更有說服力和煽動性，因而更能決定網(wǎng)絡(luò)輿情傳播的走向。相關(guān)管理部門要迅速、合理地解決旅游危機(jī)事件，盡量減小對旅游危機(jī)事件當(dāng)事人和利益攸關(guān)方帶來的負(fù)面影響，從而達(dá)到控制輿情擴(kuò)散的目的。

與咪達(dá)唑侖+si-NC 組比較，咪達(dá)唑侖+sicircNOL10 組U2OS 細(xì)胞抑制率、凋亡率、E-cadherin 蛋白水平顯著降低（P＜0.05），遷移細(xì)胞數(shù)、N-cadherin 蛋白水平顯著增加/升高（P＜0.05），見表2。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）是上皮細(xì)胞失去細(xì)胞間黏附并獲得遷移和侵襲能力的轉(zhuǎn)化，EMT 可促使癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲，是癌癥進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的必要條件[13]。E-cadherin是上皮標(biāo)志物，N-cadherin 是間質(zhì)標(biāo)記物，下調(diào)E-cadherin 和上調(diào)N-cadherin 可增強(qiáng)細(xì)胞的運(yùn)動能力，誘導(dǎo)上皮細(xì)胞向間質(zhì)狀態(tài)過度，促使骨肉瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移[14]。本研究顯示，咪達(dá)唑侖可減少U2OS 細(xì)胞遷移數(shù)量，同時降低U2OS 細(xì)胞N-cadherin 蛋白的表達(dá)，促進(jìn)E-cadherin 蛋白的表達(dá)，這與遷移檢測結(jié)果吻合，表明咪達(dá)唑侖通過逆轉(zhuǎn)EMT 來抑制U2OS 細(xì)胞遷移，提示咪達(dá)唑侖可能通過抑制癌細(xì)胞EMT、遷移、增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡在骨肉瘤中發(fā)揮抑制作用。

有研究報道，circRNA 在骨肉瘤中表達(dá)異常，并參與骨肉瘤惡性進(jìn)展[15-16]。circNOL10 在肺癌中表達(dá)下調(diào)，通過促進(jìn)sclm1 介導(dǎo)的人素多肽家族的轉(zhuǎn)錄而抑制肺癌細(xì)胞增殖和阻滯細(xì)胞周期[17]。circNOL10 低表達(dá)與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后不良相關(guān)，過表達(dá)circ-NOL10 可抑制乳腺癌細(xì)胞增殖、EMT 和遷移[18]。為了研究circNOL10 在骨肉瘤中的作用，本研究檢測了circNOL10 在正常組織、細(xì)胞與骨肉瘤組織、細(xì)胞中的表達(dá)，結(jié)果顯示，circNOL10 在骨肉瘤組織和細(xì)胞中的水平降低；功能實驗表明，過表達(dá)circNOL10 抑制了骨肉瘤細(xì)胞的增殖活力和遷移，加速了細(xì)胞凋亡，且上調(diào)了E-cadherin 蛋白表達(dá)，下調(diào)了N-cadherin 蛋白表達(dá)，與Wang 等[18]報道的circNOL10 在乳腺癌中的抑制作用吻合。本研究首次揭示了circNOL10 在骨肉瘤細(xì)胞惡性進(jìn)展中的作用。

5.3 檢查調(diào)整。對整機(jī)上各緊固螺絲、螺帽進(jìn)行檢查，發(fā)現(xiàn)松動要及時緊固;對主離合器、插秧離合器、秧針與導(dǎo)軌的間隙、秧針與苗箱的間隙等進(jìn)行檢查調(diào)整。

麻醉藥可通過調(diào)控circRNA 水平影響腫瘤進(jìn)展[19-20]。據(jù)報道，丙泊酚可通過調(diào)節(jié)肺癌中的circTADA2A/miR-455-3p 軸來抑制細(xì)胞癌變[21]；circ-HMGCS1低表達(dá)介導(dǎo)七氟醚抑制結(jié)腸癌細(xì)胞活力和侵襲，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[22]。此外，有研究顯示咪達(dá)唑侖可通過下調(diào)circASXL1 抑制胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[23]；表明咪達(dá)唑侖的抗癌作用可能與其調(diào)控circRNA 表達(dá)有關(guān)。本研究中，達(dá)唑侖處理后U2OS 細(xì)胞中circNOL10表達(dá)增加，過表達(dá)circNOL10和咪達(dá)唑侖對U2OS 細(xì)胞惡性潛能的抑制效應(yīng)一致，推測circ-NOL10 可能介導(dǎo)咪達(dá)唑侖的抗骨肉瘤作用。為了驗證此推測，本研究在咪達(dá)唑侖處理的基礎(chǔ)上采用小分子干擾技術(shù)敲低circNOL10 表達(dá)，結(jié)果顯示，抑制circ-NOL10 表達(dá)明顯減弱了咪達(dá)唑侖對U2OS 細(xì)胞惡性行為的抑制作用，提示咪達(dá)唑侖可能通過上調(diào)circ-NOL10表達(dá)來抑制骨肉瘤細(xì)胞惡性行為。

By combining Eqs.(2)and(17),we can establish the following Hadamard shift invariance relationships between the GAMs of sub-arrays Xa1,Xa2and sub-arrays Ya1,Ya2,respectively,

綜上所述，咪達(dá)唑侖可通過上調(diào)circNOL10 表達(dá)來誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡，并抑制其增殖和遷移，這為咪達(dá)唑侖在骨肉瘤進(jìn)展中的作用提供了新的見解，并可能為患者選擇更合理的麻醉藥物提供實驗依據(jù)。