miR-146b-3p 通過(guò)靶向結(jié)合LCN1 抑制肺鱗癌生物學(xué)行為

丁曉霞,劉亞群,于小緯,楊 楠,張悅琪（河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院呼吸與危重癥監(jiān)護(hù)室，河北 張家口 075000）

肺癌是導(dǎo)致癌癥患者死亡的重要原因，肺鱗癌是常見(jiàn)的肺癌亞型之一，其化療和放療敏感性較低[1-2]。由于肺鱗癌容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，并且目前缺乏有效的診斷性生物標(biāo)志物，確診時(shí)患者往往已處于中晚期，導(dǎo)致患者預(yù)后較差[3-4]。因此，積極尋找用于肺鱗癌診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)的生物標(biāo)志物至關(guān)重要。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類不具有編碼能力的小分子RNA，在基因轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮重要作用，參與細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡等生物行為學(xué)過(guò)程[5-6]。脂質(zhì)運(yùn)載蛋白1(lipocalin-1，LCN1) 能夠間接導(dǎo)致肺組織基質(zhì)降解增加，造成肺組織結(jié)構(gòu)重塑，使病情加重。miRNA 可長(zhǎng)期穩(wěn)定存在，且其異常表達(dá)會(huì)影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展[7-8]。miRNA 既可以發(fā)揮抑癌作用，也可以發(fā)揮促癌作用，并且在多數(shù)人類惡性腫瘤中異常表達(dá)[9-10]。有研究顯示，miR-146b-3p 可作為診斷非小細(xì)胞肺癌的重要標(biāo)志物[11]。還有研究顯示，miR-146a 在肺鱗癌組織中表達(dá)下調(diào)，其異常表達(dá)能抑制肺鱗癌細(xì)胞的遷移和侵襲[12]?；谶@些研究結(jié)果，我們推測(cè)miR-146b-3p可能在肺癌中發(fā)揮重要作用。本研究探討miR-146b-3p差異表達(dá)對(duì)肺鱗癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，并初步分析其可能的作用機(jī)制，以期為肺鱗癌的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑與儀器

NCI-H226、NCI-H2170 細(xì)胞株購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心；RPMI 1640培養(yǎng)基、AnnexinV-FITC 凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司；胎牛血清購(gòu)于愛(ài)必信(上海)生物科技有限公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)儀購(gòu)于Invitrogen 有限公司；RNA 提取試劑TRIzol 及轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000 均購(gòu)自南京森貝伽生物科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒Prime-ScriptTMRT Master Mix 購(gòu)自上海妍琦生物科技有限公司，PCR 試劑盒Quanti Fast SYBR Green PCR Kit 購(gòu)自武漢極捷生物科技有限公司；BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒、SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒購(gòu)自北京伊塔生物科技有限公司；CCK-8 試劑盒購(gòu)自上海吉至生化科技有限公司；BCL2、BAX、CCNB1、CDK2 多克隆抗體、LCN1多克隆抗體以及HRP 標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白G（H+L）二抗購(gòu)自上?？泼羯锟萍加邢薰荆浑p熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)試劑盒購(gòu)自成都安森盛源科技有限公司；ST-360 型酶標(biāo)儀購(gòu)自上海晚成醫(yī)療器械有限公司；細(xì)胞周期試劑盒購(gòu)于杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司；ELx808 酶標(biāo)儀購(gòu)自北京澤平科技有限責(zé)任公司；FACS VantageTM流式細(xì)胞儀購(gòu)自南京華奧生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司。

1.2 生物信息學(xué)分析

通過(guò)TCGA 在線數(shù)據(jù)庫(kù)下載肺鱗癌臨床樣本數(shù)據(jù)，比較miR-146b-3p、LCN1在癌旁組織與肺鱗癌組織中的表達(dá)情況，并分析LCN1 與肺鱗癌患者臨床表型的關(guān)系。使用Kaplan-Meier Plotter 數(shù)據(jù)庫(kù)評(píng)估LCN1 mRNA水平對(duì)肺鱗癌患者總生存期的影響。利用Star-Base 數(shù)據(jù)庫(kù)在線預(yù)測(cè)靶基因數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)miR-146b-3p的靶基因。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

將NCI-H226、NCI-H2170 細(xì)胞接種至含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基，在37 ℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，胰酶消化液消化后傳代培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。

1.4 RT-PCR檢測(cè)miR-146b-3p表達(dá)

采用TRIzol 法提取細(xì)胞或組織中的總RNA，采用紫外分光光度計(jì)法測(cè)定RNA 的濃度。按TaqMan?MicroRNA Reverse Transcription kit 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書以RNA 為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA 并置于4 ℃保存，進(jìn)行熒光定量PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火45 s，65 ℃延伸1 min，4 ℃ 10 min，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。以β-actin 為內(nèi)參，miR-146b-3p 上 游 引 物 序 列 ：5′-CCTGGCA CTGAGAACTGAAT-3′，下游序列：5′-GCACCAGAA CTGAGTCCACA-3′；β-actin 上游引物序列：5′-CATC CCTTCTCCCCACACAC-3′，下游序列：5′-AGTCCCAG GGCTTTGATTTG-3′。以2-ΔΔCt法計(jì)算miR-146b-3p 的相對(duì)表達(dá)水平。

1.5 構(gòu)建miR-146b-3p過(guò)表達(dá)細(xì)胞模型

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NCI-H2170 和NCI-H226 細(xì)胞分為miR-NC 組和miR-146b-3p 組，根據(jù)Lipofectamine 2000 說(shuō)明書分別轉(zhuǎn)染miR-146b-3p NC 和miR-146b-3p質(zhì)粒，24 h后更換完全培養(yǎng)基。采用G418篩選出能夠穩(wěn)定過(guò)表達(dá)miR-146b-3p的NCI-H2170和NCI-H226細(xì)胞系。采用RT-PCR 檢測(cè)miR-146b-3p 水平以評(píng)估轉(zhuǎn)染效率。

1.6 構(gòu)建LCN1敲低細(xì)胞模型

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NCI-H2170 和NCI-H226 細(xì)胞分為shNC 組、shLCN1 1#組、shLCN1 2#組和miR-146b-3p+LCN1 組，并根據(jù)Lipofectamine 2000 說(shuō)明書分別轉(zhuǎn)染shNC、shLCN1 1#、shLCN1 2#質(zhì)粒，24 h 后更換完全培養(yǎng)基。用嘌呤霉素篩選出穩(wěn)定敲低LCN1 的NCI-H2170 和NCI-H226 細(xì)胞系。采用Western blot 檢測(cè)LCN1 蛋白水平以評(píng)估轉(zhuǎn)染效率，篩選穩(wěn)定質(zhì)粒構(gòu)建miR-146b-3p+LCN1 組（共轉(zhuǎn)染miR-146b-3p+LCN1 2#質(zhì)粒）。

1.7 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

將miR-NC 組、miR-146b-3p 組、shNC 組、shLCN1 1#組、shLCN1 2#組和miR-146b-3p+LCN1 組細(xì)胞置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，分別于0、1、2、3、4、5 d 時(shí)對(duì)細(xì)胞增殖活性進(jìn)行檢測(cè)。每孔加入CKK-8 10 μL，在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1 h，隨后用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處的光密度（optical density，OD）值。

1.8 細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)

將miR-NC 組、miR-146b-3p 組、shNC 組、shLCN1 1#組、shLCN1 2#組和miR-146b-3p+LCN1 組細(xì)胞分別接種到6 孔板中，并輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)，使細(xì)胞分散均勻。用PBS 清洗3 次，再用40 g/L 多聚甲醛固定20 min。結(jié)晶紫染色液染色，光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞集落。

1.9 細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)

將miR-NC 組、miR-146b-3p 組、shNC 組、shLCN1 1#組、shLCN1 2#組和miR-146b-3p+LCN1 組細(xì)胞以1×105個(gè)/孔的密度接種于6 孔板，消化離心，棄去上清液，收集細(xì)胞團(tuán)塊，PBS 重懸細(xì)胞，離心，清洗1 次，振蕩，使細(xì)胞沉淀充分分散，先加入300 μL、4 ℃預(yù)冷PBS，再將上樣管置于渦旋振蕩器上振蕩，加700 μL、4 ℃預(yù)冷的純乙醇沉懸，4 ℃固定過(guò)夜。第2天，離心棄去上清液，PBS洗1次，加500 μL PI染液，室溫避光孵育15 min，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，用Flowjo 軟件分析細(xì)胞周期時(shí)相分布。

1.10 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)

取miR-NC 組、miR-146b-3p 組、shNC 組、shLCN1 1#組、shLCN1 2#組和miR-146b-3p+LCN1 組細(xì)胞進(jìn)行消化、離心、重懸。將細(xì)胞接種于6 孔板內(nèi)并置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。以1 500 r/min 離心10 min 去除上清液。加入5 μL AnnexinV-FITC 混勻，再加入5 μL PI混勻，隨后室溫下避光孵育15 min。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.11 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

構(gòu)建野生型報(bào)告基因載體LCN1-WT 與突變型報(bào)告基因載體LCN1-MT，將載體分別與miR-NC 或miR-146b-3p 共轉(zhuǎn)染到肺鱗癌細(xì)胞中。置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h，用雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒測(cè)量各組細(xì)胞中的熒光素酶活性。

1.12 裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)

16 只裸鼠購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(川)2020-030，在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境中飼養(yǎng)，自由采食飲水。將小鼠分為對(duì)照組和觀察組，每組8 只，對(duì)照組裸鼠于右側(cè)腹股溝皮下注射0.2 m L(1×107/mL）轉(zhuǎn)染miR-NC 的NCI-H2170 細(xì)胞懸液，觀察組裸鼠于右側(cè)腹股溝皮下注射0.2 mL(1×107/mL）已轉(zhuǎn)染miR-146b-3 的NCI-H2170 細(xì)胞懸液。待成瘤后，每2 d 用微米卡尺測(cè)量腫瘤體積，于第2 周末處死小鼠，剝離移植瘤并稱重，RT-PCP 檢測(cè)移植瘤組織中miR-146b-3p的表達(dá)。

1.13 Western blot檢測(cè)

收集miR-NC組、miR-146b-3p組、shNC組、shLCN1 1#組、shLCN1 2#組、miR-146b-3p+LCN1組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NCI-H2170 和NCI-H226 細(xì)胞，加入SDS Loading buffer，沸水浴中煮沸10 min，電泳后轉(zhuǎn)至PVDF 膜，用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h。加入用封閉液稀釋的抗體(1∶5 000)，4 ℃孵育過(guò)夜。次日PBS 洗滌6 min，重復(fù)3 次，然后加入封閉液稀釋的HRP 標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶1 000)，室溫孵育60 min，PBS 洗滌6 min，重復(fù)3 次，ECL 化學(xué)發(fā)光液進(jìn)行顯影，以β-actin 作為內(nèi)參，利用BCA 蛋白檢測(cè)試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，具體操作遵照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.14 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2 組間的表達(dá)差異采用t檢驗(yàn)分析，多組間比較采用單因素方差分析。Kaplan-Meier生存曲線分析患者總生存期。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-146b-3p 過(guò)表達(dá)抑制肺鱗癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡

GEO數(shù)據(jù)庫(kù)分析顯示，肺鱗癌組織中miR-146b-3p表達(dá)水平明顯低于癌旁組織（P＜0.05）。RT-PCR 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-146b-3p 組中miR-146b-3p 表達(dá)明顯高于miR-NC 組（P＜0.05）。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與miR-NC 組相比，miR-146b-3p 組增殖能力明顯降低（P＜0.05）。細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與miR-NC 組相比，miR-146b-3p 組克隆細(xì)胞數(shù)明顯減少（P＜0.05）。細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與miR-NC組相比，miR-146b-3p組G0/G1 期細(xì)胞數(shù)明顯增加（P＜0.05），S 期細(xì)胞數(shù)明顯減少（P＜0.05）。細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與miRNC 組相比，miR-146b-3p 組細(xì)胞凋亡率明顯增高（P＜0.05）。Western blot結(jié)果顯示，與miR-NC組相比，miR-146b-3p 組細(xì)胞BCL2、CCNB1 和CDK2 蛋白減少（P＜0.05），BAX蛋白增加(P＜0.05)，見(jiàn)圖1。

圖1 miR-146b-3p抑制肺鱗癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡

2.2 miR-146b-3p過(guò)表達(dá)抑制移植瘤生長(zhǎng)

裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，觀察組移植瘤體積（468.57±50.63）mm3和體質(zhì)量（0.38±0.04）g明顯小于對(duì)照組的體積（287.91±50.63）mm3和體質(zhì)量（0.19±0.02）g（P＜0.05）。隨著時(shí)間的推移，移植瘤體積不斷增大，但是觀察組的增長(zhǎng)速度明顯慢于對(duì)照組（P＜0.05）。RT-PCR 結(jié)果顯示，在裸鼠移植瘤組織中，觀察組中miR-146b-3p mRNA 相對(duì)表達(dá)量明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），見(jiàn)圖2。

2.3 miR-146b-3p與LCN1的靶向關(guān)系

生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，miR-146b-3p 序列3′-UTR 區(qū)與LCN1 存在結(jié)合位點(diǎn)。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示，miR-146b-3p mimic 與LCN1-WT 共轉(zhuǎn)染致熒光素酶活性降低（P＜0.05）。Western blot 和RTPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與miR-NC組相比，miR-146b-3p組中LCN1 mRNA 和蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05），見(jiàn)圖3。

圖3 miR-146b-3p與LCN1的靶向關(guān)系

2.4 LCN1 在肺鱗癌不同臨床特征患者癌組織中的表達(dá)水平

TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)分析顯示，肺鱗癌組織中LCN1 表達(dá)高于癌旁組織（P＜0.05），M1 期患者LCN1 表達(dá)高于M0 期患者（P＜0.05），預(yù)后不良患者LCN1 表達(dá)高于預(yù)后良好患者（P＜0.05），LCN1 高表達(dá)患者總生存率明顯低于LCN1低表達(dá)患者（P＜0.05），見(jiàn)圖4。

圖4 LCN1在肺鱗癌不同臨床特征患者癌組織中的表達(dá)水平

2.5 敲低LCN1表達(dá)抑制肺鱗癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡

Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與shNC 組相比，shLCN1 1#組和shLCN1 2#組中LCN1 蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05）。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與shNC組相比，shLCN1 1#組和shLCN1 2#組中細(xì)胞增殖能力降低（P＜0.05）。細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與shNC 組相比，shLCN1 1#組和shLCN1 2#組中克隆細(xì)胞數(shù)明顯減少（P＜0.05）。細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與shNC組相比，shLCN1 1#組和shLCN1 2#組G0/G1 期細(xì)胞數(shù)明顯增加，S 期細(xì)胞數(shù)明顯減少（P＜0.05）。細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與shNC 組相比，shLCN1 1#組和shLCN1 2#組中凋亡率明顯增高（P＜0.05），見(jiàn)圖5。

圖5 敲低LCN1表達(dá)抑制肺鱗癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡

2.6 miR-146b-3p 靶向LCN1 抑制肺鱗癌增殖并促進(jìn)其凋亡

Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與miR-NC 組及miR-146b-3p+LCN1組相比，miR-146b-3p組中LCN1蛋白相對(duì)表達(dá)水平下降（P＜0.05）。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與miR-NC 組及miR-146b-3p+LCN1 組相比，miR-146b-3p 組中增殖能力降低（P＜0.05）。細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與miR-NC 組及miR-146b-3p+LCN1 組相比，miR-146b-3p組中克隆細(xì)胞數(shù)明顯減少（P＜0.05）。細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與miR-NC 組及miR-146b-3p+LCN1 組相比，miR-146-3p 組中G0/G1 期細(xì)胞數(shù)量明顯增加，S 期細(xì)胞數(shù)量明顯減少（P＜0.05）。細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與miR-NC 組及miR-146b-3p+LCN1組相比，miR-146b-3p組中凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增加（P＜0.05），見(jiàn)圖6。

圖6 miR-146b-3p靶向LCN1抑制肺鱗癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡

3 討論

肺鱗癌是非小細(xì)胞肺癌的常見(jiàn)類型，早期并無(wú)明顯特異性，確診時(shí)大多已處于中晚期，錯(cuò)過(guò)了最佳手術(shù)時(shí)機(jī)，因而通常采取化療等保守治療，但長(zhǎng)期使用各種類型的抗癌藥物會(huì)導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)耐藥性，從而影響治療效果[13-17]。隨著腫瘤精準(zhǔn)治療的快速發(fā)展，對(duì)腫瘤生物學(xué)行為和基因的調(diào)控成為了研究重點(diǎn)。其中miRNA 在腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、分化、凋亡、化療耐藥等多種生理過(guò)程中起到關(guān)鍵作用[18-19]。本研究旨在尋找影響肺鱗癌生物學(xué)行為的潛在標(biāo)志物，為臨床治療提供理論依據(jù)。

本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，miR-146b-3p在肺鱗癌組織中低表達(dá)；LCN1 在肺鱗癌組織中高表達(dá)，且LCN1 差異表達(dá)與肺鱗癌臨床預(yù)后不良及M 分期有關(guān)。構(gòu)建miR-146b-3p 過(guò)表達(dá)細(xì)胞模型進(jìn)行一系列體外功能試驗(yàn)，結(jié)果顯示，肺鱗癌細(xì)胞過(guò)表達(dá)miR-146b-3p后，miR-146b-3p表達(dá)水平增加，細(xì)胞增殖和克隆能力降低，細(xì)胞周期受到阻滯，細(xì)胞凋亡明顯增加，提示miR-146b-3p 過(guò)表達(dá)可抑制肺鱗癌細(xì)胞增殖，阻滯細(xì)胞周期，并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步行Western blot分析顯示，肺鱗癌細(xì)胞過(guò)表達(dá)miR-146b-3p后，細(xì)胞BCL2、CCNB1和CDK2蛋白減少，BAX 蛋白增加，表明過(guò)表達(dá)miR-146b-3p 可調(diào)節(jié)肺鱗癌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)。促凋亡蛋白BAX 和抗凋亡蛋白BCL2在凋亡信號(hào)介導(dǎo)的凋亡過(guò)程中起關(guān)鍵作用，BAX 過(guò)表達(dá)可拮抗BCL2 表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。因此，上調(diào)BCL2 表達(dá)、下調(diào)BAX 表達(dá)可抑制細(xì)胞凋亡。眾所周知，miRNA 通過(guò)抑制或降解靶基因mRNA 發(fā)揮生物學(xué)功能[14]。既往研究顯示，miR-146b-5p 可通過(guò)靶向調(diào)節(jié)ZNRF2 表達(dá)誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[20]。因此，結(jié)合本研究結(jié)果推測(cè)miR-146b-3p 可抑制肺鱗癌細(xì)胞增殖，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，進(jìn)而阻滯細(xì)胞周期，并通過(guò)上調(diào)BAX 和下調(diào)BCL2蛋白表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究通過(guò)裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，miR-146b-3p 過(guò)表達(dá)可抑制裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)，證實(shí)了miR-146b-3p 過(guò)表達(dá)在肺鱗癌中發(fā)揮抑制作用。

LCN1 是脂質(zhì)運(yùn)載蛋白家族的成員，是淚液中重要的脂質(zhì)結(jié)合蛋白，分布在多種組織和腺體中，并與多種疾病的發(fā)生有關(guān)[21-22]。既往研究顯示，LCN1 在乳腺癌中高表達(dá)，且其異常表達(dá)與臨床病理特征和生存率較低有關(guān)[23]。本研究通過(guò)miRNA 靶基因數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)miR-146b-3p 調(diào)控肺鱗癌細(xì)胞的靶基因，結(jié)果顯示，miR-146b-3p 存在與LCN1 靶向結(jié)合的位點(diǎn)，LCN1 是miR-146b-3p 的靶基因。Western blot 結(jié)果顯示，miR-146b-3p 組中LCN1 蛋白表達(dá)水平明顯低于miR-NC組，推測(cè)miR146b-3p 可以調(diào)控LCN1 蛋白表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，肺鱗癌組織中LCN1 表達(dá)高于癌旁組織，且與肺鱗癌患者M(jìn) 分期存在一定關(guān)聯(lián)。為進(jìn)一步分析LCN1 在肺鱗癌中發(fā)揮的生物學(xué)功能，本研究通過(guò)構(gòu)建LCN1 敲低細(xì)胞模型進(jìn)行體外功能實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，LCN1 敲低可以抑制肺鱗癌細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖，阻滯細(xì)胞周期，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。提示LCN1 在肺鱗癌中高表達(dá)，敲低LCN1表達(dá)可影響肺鱗癌生物學(xué)行為。

本研究結(jié)果顯示，miR-146b-3p 過(guò)表達(dá)降低了肺鱗癌細(xì)胞增殖能力，減少了克隆細(xì)胞數(shù)，阻滯了細(xì)胞生長(zhǎng)周期，增加了凋亡細(xì)胞數(shù)量；而miR-146b-3p 和LCN1 共轉(zhuǎn)染后，逆轉(zhuǎn)了miR-146b-3p 對(duì)肺鱗癌的抑制作用。故我們推測(cè)，miR-146b-3p 在肺鱗癌中發(fā)揮促癌作用，其可能通過(guò)靶向抑制LCN1 表達(dá)調(diào)控肺鱗癌生物學(xué)行為。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)miR-146b-3p 在肺鱗癌細(xì)胞中低表達(dá)，LCN1在肺鱗癌細(xì)胞中高表達(dá)，且miR-146b-3p與LCN1 存在靶向結(jié)合位點(diǎn)。上調(diào)miR-146b-3p 可以抑制肺鱗癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并影響細(xì)胞生長(zhǎng)周期。而miR-146b-3p 過(guò)表達(dá)可以抑制移植瘤生長(zhǎng)，其作用機(jī)制可能是通過(guò)靶向LCN1實(shí)現(xiàn)的。