CRISPR/Cas9技術(shù)在工業(yè)微生物中的應(yīng)用*

張才達(dá) 祁永浩 米雅萱 張?zhí)N之 秦浩杰 劉東 李小兵 任麗梅**

（1）石家莊學(xué)院化工學(xué)院，河北省高校微生物制藥應(yīng)用技術(shù)研發(fā)中心，石家莊 050035；2）美邦美和生物科技有限公司，石家莊 050000）

基因編輯作為代謝工程、醫(yī)學(xué)、農(nóng)學(xué)等領(lǐng)域的重要技術(shù)，一直以來(lái)都是研究的熱點(diǎn)。傳統(tǒng)的基因編輯方法如同源重組，存在打靶效率低、操作煩瑣等問(wèn)題。隨后出現(xiàn)的鋅指核酶技術(shù)（zinc-finger nucleases，ZFN）［1］和轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)蛋白核酸酶技術(shù)（transcription activator-like effector nucleases，TALEN）［2］，雖一定程度上提高了編輯效率，簡(jiǎn)化了編輯步驟，然而這兩個(gè)技術(shù)也因難度較大、費(fèi)用較高等原因，應(yīng)用范圍受到限制。相對(duì)而言，近年來(lái)發(fā)展的CRISPR技術(shù)，具有操作難度小、編輯成本低、打靶效率高、無(wú)痕編輯等優(yōu)點(diǎn)，特別適用于微生物底盤細(xì)胞的編輯。改造后的或新創(chuàng)造的底盤細(xì)胞，更有利于實(shí)現(xiàn)特定的生物功能從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物的大量積累。本文主要簡(jiǎn)述以規(guī)律間隔成簇短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）/Cas9為基礎(chǔ)而衍伸出的各種基因編輯技術(shù)，提出了常用的工業(yè)微生物對(duì)應(yīng)底盤細(xì)胞的改造策略，以期為研究者在進(jìn)行微生物底盤細(xì)胞改造時(shí)提供參考。

1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)

CRISPR/Cas9系統(tǒng)由3個(gè)功能組分組成：crRNA（CRISPR RNA，crRNA）、tracrRNA（trans-activating CRISPR RNA，tracrRNA）及Cas9蛋白。三者結(jié)合為復(fù)合物，識(shí)別特定的NGG序列，即前間區(qū)序列鄰近基序（protospacer adjacent motif，PAM）區(qū)，crRNA通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)與附近間隔序列作用，Cas9蛋白負(fù)責(zé)對(duì)特定靶標(biāo)DNA進(jìn)行雙鏈斷裂，在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中crRNA和tracrRNA通常被結(jié)合在一起簡(jiǎn)化為小向?qū)NA（small guide RNA，sgRNA）［3］。圖1a和1b分別展示了CRISPR系統(tǒng)組成及Cas9核酸酶功能結(jié)構(gòu)域。不難發(fā)現(xiàn)該系統(tǒng)有兩個(gè)重要特點(diǎn)：一是crRNA可以通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則精確識(shí)別基因組靶位點(diǎn)；二是Cas9蛋白可以對(duì)靶DNA進(jìn)行切割，引發(fā)雙鏈斷裂。科學(xué)家正是直接或間接運(yùn)用了這兩點(diǎn)而發(fā)展出了以下的基因編輯技術(shù)。

Fig. 1 The composition of CRISPR （a） and Cas9 nuclease functional domain （b）圖1 CRISPR系統(tǒng)組成（a）和Cas9核酸酶功能結(jié)構(gòu)域（b）

2 CRISPR相關(guān)的基因編輯技術(shù)

目前CRISPR相關(guān)的基因編輯技術(shù)在微生物底盤細(xì)胞改造中的應(yīng)用具體表現(xiàn)在以下5個(gè)方面：CRISPR耦聯(lián)的非同源末端連接（nonhomologous end-joining，NHEJ）修復(fù)系統(tǒng)、CRISPR耦聯(lián)的同源定向修復(fù)（homology directed repair，HDR）系統(tǒng)、CRISPR耦聯(lián)轉(zhuǎn)錄抑制因子/激活因子（CRISPR interference/activate，CRISPRi/CRISPRa）、CRISPR耦聯(lián)脫氨酶單堿基編輯（base edit，BE）、CRISPR耦聯(lián)轉(zhuǎn)座。以下將對(duì)這5種CRISPR衍伸技術(shù)分別介紹。

2.1 CRISPR耦聯(lián)NHEJ修復(fù)系統(tǒng)

NHEJ修復(fù)機(jī)制主要存在于高等真核生物中，修復(fù)的結(jié)果往往伴有宿主基因組核苷酸隨機(jī)的插入或刪除。因此NHEJ修復(fù)并不適用于對(duì)宿主基因組進(jìn)行精確地編輯，NHEJ誘導(dǎo)的核苷酸序列改變卻豐富了基因的多樣性。

遺憾的是，大多數(shù)細(xì)菌缺乏天然的NHEJ修復(fù)機(jī)制，可能原因是在這些宿主中缺乏參與修復(fù)系統(tǒng)的Ku蛋白，該蛋白質(zhì)通過(guò)結(jié)合斷裂DNA末端，從而防止DNA降解。事實(shí)上，NHEJ系統(tǒng)存在于諸如分枝桿菌、芽孢桿菌和鏈霉菌等類群。山東大學(xué)的科研人員Su等［4］通過(guò)在大腸桿菌中異源表達(dá)來(lái)自于結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）的Ku蛋白和LigD蛋白，重建出NHEJ途徑，具體機(jī)制參見圖S1a。通過(guò)該方法，研究者實(shí)現(xiàn)了大腸桿菌基因組3~17 kb長(zhǎng)片段的刪除。進(jìn)一步地，Zheng等［5］通過(guò)將來(lái)自恥垢分枝桿菌（Mycobacterium smegmatis）的NHEJ修復(fù)機(jī)制引入大腸桿菌，實(shí)現(xiàn)了更長(zhǎng)123 kb DNA片段的缺失?？梢?，NHEJ修復(fù)系統(tǒng)不依賴于模板及抗性標(biāo)記，便可實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)片段刪除，被廣泛應(yīng)用于宿主基因組的精簡(jiǎn)。表1列舉了CRISPR耦聯(lián)的NHEJ修復(fù)系統(tǒng)在各微生物細(xì)胞改造中的具體應(yīng)用。

Table 1 CRISPR coupled NHEJ in microbial modification application表1 CRISPR耦聯(lián)的NHEJ修復(fù)系統(tǒng)在微生物細(xì)胞改造中應(yīng)用

2.2 CRISPR耦聯(lián)HDR系統(tǒng)

上述提到NHEJ修復(fù)將導(dǎo)致基因組隨機(jī)插入或缺失片段，與之不同的是HDR可實(shí)現(xiàn)基因組的定向改造。HDR的機(jī)制具體參見圖S1b。

Jiang等［10］發(fā)現(xiàn)，CRISPR引發(fā)的雙鏈斷裂（double strand break，DSB）可以促進(jìn)同源重組，該過(guò)程可以作為一種壓力，篩選經(jīng)同源重組而存活下來(lái)的宿主。通過(guò)進(jìn)一步研究，Yang等［11］成功構(gòu)建了一個(gè)大腸桿菌CRISPR/Cas9雙質(zhì)粒系統(tǒng)基因編輯平臺(tái)，Cas9質(zhì)粒表達(dá)的Cas9蛋白，與CRISPR質(zhì)粒表達(dá)的sgRNA結(jié)合，引發(fā)基因組靶位點(diǎn)雙鏈斷裂。此外Cas9質(zhì)粒表達(dá)的Exo、Beta、Gam 3種蛋白質(zhì)協(xié)助與受體菌基因發(fā)生同源重組，最終實(shí)現(xiàn)了基因的斷裂、重組修復(fù)和質(zhì)粒的消除。Zhao等［12］將以上雙質(zhì)粒系統(tǒng)簡(jiǎn)化為單質(zhì)粒，使得編輯過(guò)程更為簡(jiǎn)單，但對(duì)供體片段（donor DNA）長(zhǎng)度有限制，且未能解決多位點(diǎn)同時(shí)編輯問(wèn)題。Shukal等［13］通過(guò)不對(duì)稱PCR構(gòu)建的供體片段，避免了需重疊PCR的繁瑣過(guò)程，簡(jiǎn)化了編輯的步驟。

目前 CRISPR輔助的同源重組已被用于開發(fā)多種高效一步無(wú)疤基因組工程編輯，其中涵蓋傳統(tǒng)工業(yè)微生物的編輯，如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、谷氨酸棒狀桿菌、惡臭假單胞菌等。表2列舉了CRISPR耦聯(lián)的HDR系統(tǒng)在各微生物細(xì)胞改造中的具體應(yīng)用。

Table 2 CRISPR coupled HDR in microbial modification application表2 CRISPR耦聯(lián)的HDR系統(tǒng)在微生物細(xì)胞改造中應(yīng)用

2.3 CRISPR耦聯(lián)轉(zhuǎn)錄抑制/激活因子

Cas9蛋白包含2個(gè)核酸酶結(jié)構(gòu)域，分別為RuvC和HNH，這2個(gè)結(jié)構(gòu)域具有切割雙鏈DNA的功能。當(dāng)Cas9蛋白引入H840A和D10A突變時(shí)，其失去了內(nèi)切酶活性，形成所謂的失活Cas9（dCas9）。dCas9蛋白雖不能切割DNA，但其仍具有協(xié)助指引RNA結(jié)合DNA的功能。Qi等［22］在大腸桿菌中研究了CRISPR/dCas9系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)其具有特異性抑制基因表達(dá)的能力，并發(fā)展成為CRISPRi技術(shù)。研究者普遍認(rèn)為dCas9通過(guò)靶向啟動(dòng)子序列并阻斷轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物而有效地沉默轉(zhuǎn)錄。與前述的兩種改造底盤細(xì)胞代謝原理不同，CRISPRi系統(tǒng)無(wú)需誘導(dǎo)DSB，便實(shí)現(xiàn)了靈活的多路基因沉默，大大減少了代謝工程所需的時(shí)間。

當(dāng)dCas9蛋白與一個(gè)轉(zhuǎn)錄激活子融合時(shí)，通過(guò)dCas9/crRNA特異性的DNA結(jié)合活性，激活子可以被間接地放置在目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近，并招募轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物從而在轉(zhuǎn)錄水平上增強(qiáng)靶基因的表達(dá)。隨后該技術(shù)被稱為CRISPRa。Bikard等［23］通過(guò)將RNA聚合酶亞基RpoZ融合到dCas9蛋白的C端，并靶向大腸桿菌MG1655基因組中的一個(gè)轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游的弱啟動(dòng)子序列，使得其轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)了23倍。該團(tuán)隊(duì)還發(fā)現(xiàn)CRISPRa系統(tǒng)的激活效應(yīng)在弱啟動(dòng)子中尤為顯著，而對(duì)于強(qiáng)啟動(dòng)子的增強(qiáng)并不明顯。與CRISPRi轉(zhuǎn)錄抑制相比，dCas9-ω復(fù)合物轉(zhuǎn)錄激活作用較為有限。Hu等［24］研究使用改進(jìn)的噬菌體輔助連續(xù)進(jìn)化技術(shù)（phageassisted continuous evolution，PACE），篩選獲得的Cas9突變體，該突變體通過(guò)與ω亞基復(fù)合，使得轉(zhuǎn)錄激活效率增加了近100倍。表3列舉了CRISPRi/CRISPRa在各微生物代謝途徑編輯的具體應(yīng)用。CRISPRi/CRISPRa 的作用機(jī)制參見圖S1c和S1d。

Table 3 CRISPR coupled CRISPRi/CRISPRa in microbial modification application表3 CRISPR耦聯(lián)的轉(zhuǎn)錄抑制/激活因子在微生物細(xì)胞改造中應(yīng)用

2.4 CRISPR耦聯(lián)脫氨酶單堿基編輯

堿基編輯器（base editor）是一種脫氨酶與受損的CRISPR/Cas核酸酶（無(wú)法切割DNA雙鏈）融合蛋白，由Komor等［33］首先構(gòu)建，常用于無(wú)模板基因編輯。受損的Cas核酸酶Cas9（SpCas9）可以是催化失活的dCas9，完全不能切割DNA雙鏈，或一個(gè)Cas9 nickase（nCas9，保留D10A突變），破壞未編輯鏈。通過(guò)sgRNA的引導(dǎo)，融合蛋白被招募到靶位點(diǎn)，但不引起DSB，其中胞嘧啶脫氨酶與受損的Cas9融合（pyrimidine base editor，CBE）將胞苷C轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶T，腺嘌呤脫氨酶與受損的Cas9融合（adenine base editor，ABE）將腺苷A轉(zhuǎn)化為鳥苷G。Kurt等［34］將尿嘧啶-DNA糖基化酶（Ung）與受損的Cas9融合，在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了胞苷C轉(zhuǎn)化為腺苷A。堿基編輯器的具體機(jī)制參見圖S2a和S2b。目前堿基編輯器主要用于傳統(tǒng)工業(yè)微生物如大腸桿菌、谷氨酸棒狀桿菌、釀酒酵母等基因的失活。Wang等［35］利用CBE對(duì)谷氨酸棒狀桿菌中3基因odhA、pyk和ldhA的組合失活，從而提高了谷氨酸產(chǎn)量。Zhong等［36］通過(guò)使用ABE突變天藍(lán)色鏈霉菌（S. coelicolor）中的actVB起始密碼子，使得放線氧?；╝ctinoperylone，ACPL）的產(chǎn)量提高。雖然關(guān)于編輯器的應(yīng)用在代謝工程上的報(bào)道較為有限，但將來(lái)可能出現(xiàn)直接應(yīng)用堿基編輯來(lái)改變一個(gè)啟動(dòng)子或其他轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，如操作子、增強(qiáng)子、激活子結(jié)合位點(diǎn)，或翻譯元件包括核糖體識(shí)別位點(diǎn)（Shine-Dalgamo，SD）序列、起始密碼子等，都將是極具有吸引力的基因表達(dá)調(diào)控策略。

2.5 CRISPR耦聯(lián)轉(zhuǎn)座

優(yōu)化特定基因的遺傳劑量使得目標(biāo)產(chǎn)物高效表達(dá)是制備高性能生物催化劑的關(guān)鍵步驟。但是傳統(tǒng)依賴質(zhì)粒方法在控制基因劑量上并不理想，原因是質(zhì)粒復(fù)制子和影響基因拷貝數(shù)的各種外部因素影響。因此，一個(gè)可編輯、快速、無(wú)標(biāo)記、定點(diǎn)染色體多拷貝集成系統(tǒng)將是一個(gè)強(qiáng)大的編輯工具應(yīng)用于工業(yè)微生物底盤細(xì)胞改造。染色體整合方法實(shí)現(xiàn)了精確基因劑量控制與重組基因穩(wěn)定性。最近研究發(fā)現(xiàn)，基于轉(zhuǎn)座子的CRISPR基因組編輯技術(shù)可以高效、準(zhǔn)確地整合基因元素進(jìn)入一個(gè)特定的位點(diǎn)，該過(guò)程并不涉及DNA雙鏈的斷裂。CRISPR耦聯(lián)轉(zhuǎn)座過(guò)程參見圖2a和2b。

Fig. 2 Transposable process （a） and insertion genomic location （b）圖2 轉(zhuǎn)座過(guò)程（a）及插入基因組位置（b）

Zhang等［37］研究了CRISPR相關(guān)霍氏雙岐藻（Scytonema hofmanni）轉(zhuǎn)座系統(tǒng)ShCAST的特征。ShCAST蛋白復(fù)合物由一個(gè)基因集群編碼的tn7樣轉(zhuǎn)位酶亞基（TnsB、TnsC以及TniQ）和Cas12k蛋白組成。TniQ和Cas12k識(shí)別目標(biāo)位點(diǎn)并負(fù)責(zé)招募TnsC， 通過(guò)TnsB和TnsC間的相互作用，TnsB發(fā)揮裂解DNA的功能，將貨物基因斷裂，并將其插入位于PAM序列下游60~66 bp處。研究人員將該系統(tǒng)應(yīng)用于大腸桿菌并成功插入了10 kb長(zhǎng)片段。另一方面，Sternberg等［38］對(duì)來(lái)自霍亂弧菌的CRISPR相關(guān)轉(zhuǎn)座酶進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)該系統(tǒng)中Cascade蛋白復(fù)合物由Cas6、Cas7和Cas8組成，結(jié)合TniQ蛋白引導(dǎo)轉(zhuǎn)座子將貨物基因插入到靶目標(biāo)基因組中。Yang等［39］比較了ShCAST和霍亂弧菌的向?qū)NA輔助靶向插入轉(zhuǎn)座系統(tǒng)（insert transposable elements by guide RNA-assisted targeting，INTEGRATE），并總結(jié)出一套應(yīng)用于大腸桿菌多基因同時(shí)敲入的CRISPR相關(guān)轉(zhuǎn)座酶多拷貝染色體整合（multicopy chromosomal integration using CRISPR-associated transposases，MUCICAT），該系統(tǒng)由三質(zhì)粒組成，通過(guò)設(shè)計(jì)8個(gè)間隔序列的微陣列，該團(tuán)隊(duì)將葡萄糖脫氫酶（GDH）基因同時(shí)整合到了BL21（DE3）基因組的8個(gè)位點(diǎn)，得到了一系列梯度拷貝的GDH基因，其中最優(yōu)6個(gè)拷貝的菌株酶活是傳統(tǒng)質(zhì)粒pET24a-GDH發(fā)酵的2.63倍。本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)將間隔序列靶向基因組的間隔序列（IS1），該IS1位點(diǎn)在BL21（DE3）基因組中存在29個(gè)拷貝，通過(guò)一輪轉(zhuǎn)座便實(shí)現(xiàn)了GDH基因在IS1位點(diǎn)的插入。Sternberg等［40］將三質(zhì)粒改進(jìn)為一個(gè)單質(zhì)粒系統(tǒng)，簡(jiǎn)化后的質(zhì)粒，貨物基因插入地方向一致，且長(zhǎng)片段插入效率接近100%，進(jìn)一步結(jié)合Cre-Loxp系統(tǒng)，通過(guò)同時(shí)靶向基因組的兩個(gè)位點(diǎn)分別實(shí)現(xiàn)了2.4 kb、10 kb、20 kb長(zhǎng)片段刪除。

以上內(nèi)容主要對(duì)5種編輯技術(shù)進(jìn)行了單獨(dú)的介紹，但應(yīng)該指出的是，即使是對(duì)一種特定的底盤細(xì)胞改造，根據(jù)最終要達(dá)到的效果，中間編輯的過(guò)程也有可能需要多種編輯方法聯(lián)合使用，如對(duì)基因組整合一個(gè)代謝途徑而言，首先可以通過(guò)轉(zhuǎn)座方法插入所涉及基因的長(zhǎng)片段，然后借助同源修復(fù)系統(tǒng)去除因轉(zhuǎn)座而存留在基因組兩端的重復(fù)序列，最后出現(xiàn)的單堿基突變或啟動(dòng)子等元件的優(yōu)化則用堿基編輯器進(jìn)行細(xì)調(diào)更為合適，這樣可能實(shí)現(xiàn)最短時(shí)間改造細(xì)胞的目的。隨著CRISPR技術(shù)的迅猛發(fā)展，新的技術(shù)也是層出不窮，除以上描述的衍伸技術(shù)外，最近發(fā)展出的CRISPR耦連系統(tǒng)包括易錯(cuò)DNA復(fù)制、引導(dǎo)編輯、表觀修飾等。雖然這些新工具還沒(méi)有成熟，尚未應(yīng)用于代謝工程，相信這些新技術(shù)必將豐富多個(gè)CRISPR調(diào)控系統(tǒng)在同一細(xì)胞中組合應(yīng)用，使得代謝途徑中基因的多重調(diào)控變得更方便高效。表4主要總結(jié)了以上CRISPR衍伸技術(shù)的特點(diǎn)。

Table 4 Comparison of CRISPR extension technology characteristics表4 CRISPR衍伸技術(shù)特點(diǎn)比較

上文主要介紹了微生物底盤細(xì)胞改造的具體技術(shù)，下文將對(duì)改造的對(duì)象——工業(yè)微生物底盤細(xì)胞以及CRISPR基因編輯方法如何在底盤細(xì)胞改造中具體應(yīng)用進(jìn)行重點(diǎn)描述。

3 CRISPR/Cas9在工業(yè)微生物底盤細(xì)胞改造中的應(yīng)用

3.1 CRISPR/Cas9技術(shù)在大腸桿菌中的應(yīng)用

大腸桿菌（Escherichia coli）因其培養(yǎng)方法簡(jiǎn)單、增殖周期短、耐受環(huán)境強(qiáng)的特點(diǎn)，被廣泛用于工業(yè)發(fā)酵。Jiang等［10］在大腸桿菌中利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行了基因組的編輯，研究者通過(guò)重組方法將一段突變序列替換了原始序列。Yang等［11］進(jìn)一步利用CRISPR同源重組技術(shù)同時(shí)對(duì)大腸桿菌多至3個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行了基因敲除。除該技術(shù)外，CRISPRi系統(tǒng)也被用于大腸桿菌工業(yè)發(fā)酵，Wu等［41］利用CRISPRi抑制丙二酰輔酶A消耗通路，使得丙二酸鹽前體物質(zhì)積累，從而提高2S構(gòu)型匹諾賽琳（（2S）-pinocembrin）滴度至525.8 mg/L。除CRISPRi外，CRISPRa體系也于2013年在大腸桿菌構(gòu)建成功。Bikard等［23］通過(guò)將dCas9的C端連入ω亞基，使得β半乳糖酶在轉(zhuǎn)錄水平上提高了2.8倍?？梢钥闯鯟RISPR耦連HDR、CRISPR耦連轉(zhuǎn)錄激活/抑制因子，在大腸桿菌合成代謝途徑中已有實(shí)際應(yīng)用。

3.2 CRISPR/Cas9技術(shù)在谷氨酸棒狀桿菌中的應(yīng)用

谷氨酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum）是一種革蘭氏陽(yáng)性土壤細(xì)菌，作為重要的微生物，過(guò)去常用于工業(yè)生產(chǎn)氨基酸，現(xiàn)已被改造合成各種化合物，包括高分子亞基、醫(yī)藥中間體和生物燃料等。目前已開發(fā)的谷氨酸棒狀桿菌基因編輯系統(tǒng)主要集中在同源重組介導(dǎo)的CRISPR/Cpf1和CRISPR/Cas9技術(shù)。新兇手弗朗西絲菌（Francisella novicida）來(lái)源的CRISPR/Cpf1系統(tǒng)，由于其中的Cpf1相對(duì)于Cas9蛋白分子質(zhì)量小，細(xì)胞毒性較低，利于構(gòu)建到載體中提高轉(zhuǎn)化效率，因此該系統(tǒng)被應(yīng)用于較難編輯的谷氨酸棒狀桿菌。2017年，楊晟團(tuán)隊(duì)［18］在谷氨酸棒桿菌中成功建立CRISPR/Cpf1系統(tǒng)，研究者將Cpf1蛋白和CRISPR RNA構(gòu)建在同一個(gè)質(zhì)粒中，以單鏈DNA為供體，實(shí)現(xiàn)了近90%編輯效率。CRISPR/Cas9系統(tǒng)方面，Liu等［42］采用雙質(zhì)粒共轉(zhuǎn)方法以減少Cas9質(zhì)粒在宿主中復(fù)制機(jī)會(huì)，避免Cas9質(zhì)粒突變而產(chǎn)生假陽(yáng)性。此外，研究者還將Cas9和gRNA質(zhì)粒分別采用更為嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膹?qiáng)啟動(dòng)子Ptac和P11F（一種PcspB衍生啟動(dòng)子）優(yōu)化，優(yōu)化后的系統(tǒng)在分別以質(zhì)粒骨架和單鏈DNA（single strand DNA，ssDNA）為供體時(shí)，達(dá)到60%和80%的編輯效率。為實(shí)現(xiàn)更長(zhǎng)片段的刪除和插入，Wang等［19］先將Cas9整合入宿主基因組，單轉(zhuǎn)化gRNA質(zhì)粒以此提高轉(zhuǎn)化效率，研究者發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于載體形式表達(dá)Cas9蛋白，基因組表達(dá)的Cas9對(duì)宿主毒性更低，更有利于菌體生長(zhǎng)。通過(guò)該方法作者實(shí)現(xiàn)了長(zhǎng)20 kb片段刪除以及7.5 kb片段插入，進(jìn)一步通過(guò)對(duì)丙二醇合成途徑相關(guān)基因改造，編輯后的菌株實(shí)現(xiàn)了丙二醇6.75 g/L產(chǎn)量。

3.3 CRISPR/Cas9技術(shù)在枯草芽孢桿菌中的應(yīng)用

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是革蘭氏陽(yáng)性菌芽孢桿菌的模式菌株，具有強(qiáng)大的蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)。目前，已在枯草芽孢桿菌中建立了CRISPR/Cas9、CRISPRi和CRISPR/Cpf1等編輯系統(tǒng)。Liu等［43］在枯草芽孢桿菌中應(yīng)用CRISPRi系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了乳糖-N-新四糖（LNnT）在搖瓶產(chǎn)量中達(dá)到2.30 g/L。Altenbuchner等［44］利用穿梭質(zhì)粒在枯草中誘導(dǎo)表達(dá)Cas9蛋白，耦連HDR系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了amyE基因的25.1 kb長(zhǎng)片段缺失。Wu等［45］通過(guò)CRISPR/Cpf1系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)雙精度框內(nèi)基因敲除、多點(diǎn)突變。 隨后利用該系統(tǒng)研究者在枯草芽孢桿菌中實(shí)現(xiàn)了N-乙酰氨基葡萄糖的生物合成途徑。

3.4 CRISPR/Cas9技術(shù)在酵母菌中的應(yīng)用

酵母是單細(xì)胞真核生物，由于其清晰簡(jiǎn)單的遺傳學(xué)背景以及易操作性與安全性，常被用于工業(yè)發(fā)酵。2015年，Horwitz等［46］在釀酒酵母應(yīng)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)將6個(gè)基因片段共24 kb整合到基因組，建立了莽草酸合成途徑。在基因敲除而實(shí)現(xiàn)代謝流調(diào)控方面，Xu等［47］在酵母中運(yùn)用Cas9及優(yōu)化后的sgRNA，對(duì)酵母基因組進(jìn)行了4個(gè)位置基因突變并成功構(gòu)建了乙醇耐受型酵母菌株。以上實(shí)例都是基于CRISPR/Cas9耦連同源重組在有供體DNA情況實(shí)現(xiàn)基因的敲入或敲除，可見同源重組修復(fù)系統(tǒng)用途之廣。除此之外，dCas9也被用于酵母基因組轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控。Gilbert等［48］通過(guò)dCas9抑制TEF1啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄，從而降低基因的表達(dá)豐度。

對(duì)于利用CRISPR耦連轉(zhuǎn)座系統(tǒng)在酵母中實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)片段基因插入實(shí)例尚未報(bào)道，但已有科研人員提出開發(fā)真核生物轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)或細(xì)菌Tn7-CRISPRCas系統(tǒng)從而實(shí)現(xiàn)DNA長(zhǎng)片段的插入、多個(gè)基因控制的通路插入以及多個(gè)重要性狀的疊加等。

4 總結(jié)和展望

CRISPR技術(shù)的出現(xiàn)極大方便了微生物底盤細(xì)胞改造，但目前CRISPR技術(shù)還面臨以下問(wèn)題。

a. PAM序列的依賴性。目前的CRISPR/Cas9技術(shù)由于NGG序列限制，尚不能對(duì)任意位點(diǎn)編輯。CRISPR技術(shù)普適性的應(yīng)用，需要打破現(xiàn)有PAM序列，在識(shí)別位點(diǎn)上加以拓寬。

b. 編輯的脫靶率。對(duì)于減弱脫靶效率，目前研究者們已通過(guò)結(jié)構(gòu)優(yōu)化或者隨機(jī)突變的形式獲得高保真的突變體。但是這些突變體打靶效率通常較低，因此，在保持目標(biāo)編輯活性的同時(shí)提高Cas9特異性對(duì)于探索高保真和高效的Cas9工具至關(guān)重要。Sun等［49］最近在Cas9基礎(chǔ)上通過(guò)對(duì)7個(gè)殘基突變，得到一種新型SuperFi-Cas9，該突變蛋白質(zhì)裂解靶DNA的速度與野生型相當(dāng)，但具有更高的脫靶識(shí)別性能，SuperFi-Cas9的裂解活性只在體外進(jìn)行了測(cè)試，臨床應(yīng)用還需要進(jìn)一步研究，繼續(xù)優(yōu)化發(fā)展真正意義上的高保真突變體將是未來(lái)的研究重點(diǎn)。

c. 應(yīng)用廣泛性有待提升。雖然CRISPR技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于多種微生物，但在某些微生物中依然存在Cas9蛋白毒性問(wèn)題而難以應(yīng)用，雖然Cpf1可以緩解但依然存在較低毒性。

從底盤細(xì)胞構(gòu)建上看，該過(guò)程涉及大量基因的敲除，這首先要求對(duì)基因信息進(jìn)行注釋，以便決定編輯的位置?；蛐畔⒌淖⑨屝枰镄畔W(xué)分析，過(guò)程較為復(fù)雜。此外，盡管目前的模式微生物代謝特征很好，而且已有多種工具可對(duì)其基因快速修飾，在代謝工程中已取得廣泛的應(yīng)用，然而這些模式菌株仍是無(wú)法生產(chǎn)所有理想的產(chǎn)品，以滿足日益增長(zhǎng)的工業(yè)需求。相比之下，來(lái)自更復(fù)雜環(huán)境的非模式微生物已進(jìn)化到具有利用更便宜、更環(huán)保的碳源完成多種生理功能和代謝的能力，這對(duì)未來(lái)生產(chǎn)生物燃料以及藥物和新型抗生素都很重要。非模式微生物能忍受極端工業(yè)加工環(huán)境，如低pH、高鹽、高溫，已然成為代謝工程研究的熱點(diǎn)之一。然而，由于缺乏簡(jiǎn)單的基因編輯工具，阻礙了非模式微生物基因的表征和表達(dá)修飾。相信未來(lái)科學(xué)家根據(jù)不同微生物特點(diǎn)而開發(fā)出相應(yīng)的編輯工具，用于更多產(chǎn)品生產(chǎn)。這些問(wèn)題的解決必依賴于CRISPR技術(shù)的革新，在微生物底盤細(xì)胞改造方面取得更加廣泛應(yīng)用，從而實(shí)現(xiàn)更多附加值產(chǎn)品的底盤細(xì)胞。

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