高內(nèi)涵分析系統(tǒng)聯(lián)合激光掃描共聚焦顯微鏡觀察細胞間隧道納米管*

潘鵬宇 趙秋宇 王英 王建波 李想 劉春英 王淳**

（1）遼寧中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結(jié)合學院，沈陽 110847；2）遼寧中醫(yī)藥大學中醫(yī)臟象理論及應(yīng)用教育部重點實驗室，沈陽 110847；3）珀金埃爾默企業(yè)管理（上海）有限公司，上海 201203）

隧道納米管（tunneling nanotubes，TNTs）是存在于細胞間的細長膜管狀結(jié)構(gòu)，又稱膜納米管，主要由肌動蛋白、微絲和微管組成，直徑大多在50 nm至幾微米，長度約幾十到數(shù)百微米［1-2］。TNTs作為一種新的細胞間相互作用方式，可將不同細胞的質(zhì)膜和胞質(zhì)連接在一起，實現(xiàn)不同細胞成分的遠距離直接轉(zhuǎn)運，完成生物信息交換［3］。TNTs可轉(zhuǎn)運物質(zhì)多樣，包括如Ca2+、線粒體、高爾基囊泡、溶酶體、病毒、外泌體、蛋白質(zhì)、microRNA和siRNA等［4-8］。TNTs直接且精準的轉(zhuǎn)運功能使其在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫應(yīng)答、凋亡、納米與微米顆粒轉(zhuǎn)運、胚胎形成與發(fā)育、細胞分化、代謝重編程、病原體傳播、神經(jīng)退行性病變、腫瘤發(fā)生與發(fā)展等生理、病理過程中發(fā)揮重要作用［9-10］。對于腫瘤細胞而言，TNTs可提高其增殖和侵襲、遷移能力，促進腫瘤細胞存活，并可通過線粒體的轉(zhuǎn)運增加腫瘤細胞的氧化磷酸化和ATP生成以應(yīng)對不利的環(huán)境壓力［11］。此外，對于腫瘤血管生成、放化療耐藥，TNTs也發(fā)揮了重要作用［12］。其中，在肺腺癌的以往研究發(fā)現(xiàn)，利用轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡可探明TNTs內(nèi)轉(zhuǎn)運物質(zhì)包括囊泡、蛋白質(zhì)和線粒體，可測量TNTs長度及直徑（長度：大于70 μm；直徑：400~1 500 nm），該結(jié)果與本研究相一致［13-14］。

目前，可以利用激光掃描共聚焦顯微鏡（laser scanning confocal microscope，LSCM）、掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）測量TNTs長度、觀察TNTs表面結(jié)構(gòu)，也可以利用透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）觀察TNTs內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運種類，利用光電融合成像技術(shù)（correlative light and electron microscopy，CLEM）可更精細地觀察TNTs內(nèi)運輸物質(zhì)如囊泡等的超微結(jié)構(gòu)以及TNTs的超微結(jié)構(gòu)與轉(zhuǎn)運特點［15-17］。本研究利用高內(nèi)涵分析系統(tǒng)（high content analysis system，HCA）結(jié)合LSCM觀察TNTs形態(tài)學特征，捕獲TNTs動態(tài)形成過程，觀察經(jīng)由TNTs的細胞間物質(zhì)轉(zhuǎn)運動態(tài)過程，并探究TNTs轉(zhuǎn)運物質(zhì)在數(shù)量和分布上的特點。LSCM是傳統(tǒng)經(jīng)典的高分辨率顯微成像方法，其采用激光光源，結(jié)合單孔共聚焦成像方式，配合高數(shù)值孔徑（NA）物鏡成像可達到光學顯微鏡分辨率的極限，即200 nm左右。但LSCM也有不適用的情況，如普通的LSCM由于成像時間長、光毒性和光漂白作用強，應(yīng)用于活細胞動態(tài)成像效果不佳［18-19］。HCA是新興的顯微成像和分析技術(shù)，它結(jié)合了高通量篩選技術(shù)的效率和細胞影像學技術(shù)的成像與分析能力，能從復(fù)雜生物系統(tǒng)中快速收集豐富的定量數(shù)據(jù)［20］。HCA往往使用轉(zhuǎn)盤共聚焦光路結(jié)合水浸式物鏡系統(tǒng)以實現(xiàn)高分辨率成像，具有成像速度快（成像時間以毫秒為單位）并保證成像質(zhì)量和細胞活性特點，利用高NA物鏡成像也可達到光學顯微鏡分辨率的極限。同時，HCA搭載的環(huán)境控制系統(tǒng)更利于活細胞動態(tài)拍攝和追蹤［21-22］。因此，本研究選用HCA結(jié)合LSCM實現(xiàn)TNTs的形態(tài)、形成機制和功能的觀察。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑

人肺腺癌A549細胞、順鉑耐藥A549/DDP細胞購自中國醫(yī)學院腫瘤研究中心；順鉑（cisplatin，Cis-DDP）（貨號：PHR1624），德國Sigma公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）（貨號：FB25015），美國Clark公司；McCoy’s 5A培養(yǎng)液（批號：WG210224C），北京中生奧邦生物科技有限公司；DMEM/F12培養(yǎng)液（批號：20210301），賽文創(chuàng)新（北京）生物科技有限公司；0.25%胰蛋白酶（批號：25200-056），美國Gibco公司；青霉素和鏈霉素（批號：SV30010），美國Hyclone公司；小麥胚芽凝集素和Alexa Fluor 488偶聯(lián)物（wheat germ agglutinin Alexa Fluor 488 conjugate，WGA-488）（批號：2260867），美國Invitrogen公司；Vybrant DiD細胞標記溶液（Vybrant DID celllabeling solution，DID）（批號：2246612），美國Invitrogen公司；Hoechst 33342染色液（批號：20210507），中國北京索萊寶科技有限公司等。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

A549、A549/DDP細胞于37℃、濕度95%、CO2濃度5%條件下，分別在含10% FBS和100 U/ml青霉素、100 mg/L鏈霉素的DMEM/F12或McCoy’s 5A培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)。A549/DDP細胞于1 μmol/L順鉑環(huán)境下持續(xù)培養(yǎng)以保持其耐藥性，并于實驗前2周更換為無順鉑的完全培養(yǎng)液用于后續(xù)實驗［23］。

1.2.2 熒光染色、分組及藥物干預(yù)

收集A549或A549/DDP細胞，調(diào)節(jié)細胞密度至1.0×106/ml。A549細胞以WGA-488偶聯(lián)物+Hoechst 33342熒光染料染色（終濃度分別為8 mg/L、10 mg/L，37℃共孵育15 min）；A549/DDP細胞以DiD+Hoechst 33342熒光染料染色（終濃度分別為5 μmoL/L、10 mg/L，37℃共孵育15 min）；并互換熒光染料對A549與A549/DDP細胞進行染色。染色后的細胞經(jīng)不含鈣離子、鎂離子、酚紅的PBS洗滌，按下列方式接種于24孔TCT細胞培養(yǎng)板（Beaver公司）或15 mm共聚焦皿（NEST公司）中：a. A549細胞單獨培養(yǎng)，2.0×105/孔；b. A549/DDP細胞單獨培養(yǎng)，2.0×105/孔；c. A549與A549/DDP細胞按1∶1混合培養(yǎng)，細胞密度2.0×105/孔。繼續(xù)孵育4 h待細胞貼壁后活細胞上機觀察；固定細胞拍攝在染色后培養(yǎng)48 h結(jié)束時進行，采用4%多聚甲醛固定10 min，經(jīng)D-PBS洗滌并加入抗熒光衰減封片劑上機。

1.3 高內(nèi)涵分析系統(tǒng)實驗參數(shù)設(shè)置

1.3.1 儀器型號

高內(nèi)涵分析系統(tǒng)：PerkinElmer High Content Analysis System Operetta CLS。

1.3.2 系統(tǒng)參數(shù)設(shè)置

明場拍攝儀器設(shè)置如下。物鏡：20×Air. NA 0.4；自動對焦：Two Peak（Default）；拍攝模式：Non-Confocal，Binning：2；通道：Brightfield、Digital Phase Contrasts；單孔視野數(shù)量：246 Field；拍攝首層：-9.0 μm；拍攝層數(shù)：3；層數(shù)間隔：1.5 μm；單次拍攝循環(huán)時間：30 min；拍攝總時長48 h。

熒光拍攝儀器設(shè)置如下。物鏡：20×Air. NA 0.4；自動對焦：One Peak（Default）；拍攝模式：Confocal，Binning：2；通道：Brightfield、DID（Ex644/Em665）、Alexa Fluor 488、Hoechst 33342；單孔視野數(shù)量：58 Field；拍攝首層：-7.0 μm；拍攝層數(shù)：3；層數(shù)間隔：1.5 μm；單次拍攝循環(huán)時間：7~8 min；拍攝總時長48 h。

1.4 激光掃描共聚焦顯微鏡實驗參數(shù)設(shè)置

1.4.1 儀器型號

激光掃描共聚焦顯微鏡：OLYMPUS FV10i。

1.4.2 參數(shù)設(shè)置

拍攝設(shè)置如下。物鏡：60× NA1.35油浸物鏡；通道選擇：Hoechst 33342、Alexa Fluor 488、DID、Phase contrast；Acquire Map Image成像通道：Alexa Fluor 488、DID；各通道光敏感度依次：49.6%、49.6%、41.6%、36.6%；各通道激光強度依次：68.3%、51.1%、27.9%、默認；掃描像素：1 024×1 024；掃描層數(shù)：15~20層；層間間隔1 μm；單通道掃描時間：約00:00:26.0；總掃描時間：約00:26:40.4。

1.5 TNTs 三維重構(gòu)

應(yīng)用IMARIS 9軟件對激光掃描共聚焦顯微鏡成像圖片進行細胞表面三維重構(gòu)，并對細胞核熒光信號進行透明化處理。利用Sport工具標記供體細胞經(jīng)TNTs轉(zhuǎn)運的熒光信號，觀察被轉(zhuǎn)運囊泡在受體細胞內(nèi)的分布情況。

1.6 TNTs統(tǒng)計分析

TNTs形成指數(shù)即每100個細胞的TNTs數(shù)［17］，TNTs直徑、長度和形成指數(shù)統(tǒng)計應(yīng)用高內(nèi)涵軟件Harmony 4.1采集5個隨機時間點視野進行記錄。整理數(shù)據(jù)，采用GraphPad Prism 9 軟件對其處理，計量資料以表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗（數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布且方差齊）。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 HCA觀察TNTs形成過程

應(yīng)用高內(nèi)涵分析系統(tǒng)拍攝到A549/DDP細胞間由細胞接觸-膜融合-細胞反向易位-胞膜融合區(qū)拉長變細機制形成TNTs的全過程（即接觸分離機制形成TNTs）（圖1）。同時，應(yīng)用高內(nèi)涵分析系統(tǒng)分別在5個隨機時間點采集圖像，觀察同種腫瘤細胞間TNTs形成情況。結(jié)果顯示：單獨培養(yǎng)的A549細胞，當細胞密度較高、距離較近時可觀察到TNTs形成，TNTs平均長度為14.71 μm，平均直徑為2.27 μm，TNTs形成指數(shù)為4；與A549細胞相比，單獨培養(yǎng)的A549/DDP細胞，在細胞密度較低、距離較遠時即可觀察到TNTs形成，且形成TNTs更多，TNTs形成指數(shù)為11（P<0.001），TNTs結(jié)構(gòu)更粗、長，平均長度為25.44 μm，平均直徑為2.59 μm（圖2）。

Fig. 1 Pattern diagram of formation mechanism of tunneling nanotubes

Fig. 2 Observation of intercellular TNTs by high content analysis system

Fig. 3 Observation on the dynamic formation of TNTs by high content analysis system

Fig. 4 Structural Characteristics of TNTs Observed by LSCM

Fig. 5 The material transport through tunnel nanotubes observed by high content imaging system

Fig. 6 Observation on the bidirectional material transport Function of TNTs by LSCM imaging 3D reconstruction

Fig. 7 TNTs material transportation analyzed by LSCM imaging 3D reconstruction

Fig. 8 Observation of transported vesicles distribution in recipient cells by LSCM imaging 3D reconstruction

0~8 min時，標記了紅色熒光的兩個A549/DDP細胞彼此接近；16 min時，兩細胞胞膜接觸；16~72 min時，兩細胞胞膜接觸面積進一步增加；72~136 min時，兩細胞逐漸分離，并在144 min時形成TNT結(jié)構(gòu)；144~224 min時，TNT不斷拉長變細，直至232 min時消失。TNT全程存在80 min（圖3，圖S1）。圖3a說明了TNTs接觸分離的形成機制；圖3b，c說明了胞膜接觸面積增大之后再分離才能形成TNTs，我們在其他視野觀察中發(fā)現(xiàn)有細胞短暫、小面積的接觸并不會形成TNTs；圖3d展示了TNTs形成并消失后細胞的狀態(tài)。圖S1是從各個時間點或時間段的細胞接觸，胞膜接觸面積增加、減少，TNTs存在時間，以及TNTs消失是突然遠距離中斷等完整地呈現(xiàn)了TNTs形成全過程，可以使后續(xù)的研究者整體上把控TNTs形成階段并在早期區(qū)分是否有TNTs形成趨向。

2.2 LSCM觀察TNTs三維結(jié)構(gòu)及TNTs囊泡物質(zhì)運輸

進一步利用LSCM觀察不同亞型腫瘤細胞間形成的TNTs結(jié)構(gòu)。圖4a所示為A549/DDP細胞（綠色熒光）伸向A549細胞（紅色熒光）的TNTs結(jié)構(gòu)。為了排除不同熒光探針標記原理所產(chǎn)生的差異互換熒光標記物，圖4b所示為A549細胞（綠色熒光）伸向A549/DDP細胞（紅色熒光）的TNTs結(jié)構(gòu)。由此可見，不同亞型的腫瘤細胞間可以形成TNTs。此外，還觀察到了由A549細胞（紅色熒光）發(fā)出的絲狀偽足樣膜凸起正伸向A549/DDP細胞（綠色熒光），以細胞膜凸起-膜凸起絲狀偽足樣拉長-膜凸起與其他細胞膜融合機制形成TNTs（即以絲狀偽足樣膜凸起伸出后融合的方式形成TNT）（圖4c，圖1）。

進一步利用IMARIS軟件對TNTs結(jié)構(gòu)進行三維觀察，圖4所示yz視野下可觀察到懸浮于基質(zhì)的典型TNTs結(jié)構(gòu)特征，且通過xy與yz視野還可清晰地觀察到TNT中運送的囊泡物質(zhì)（圖4a，b）。

2.3 HCA聯(lián)合LSCM分析TNTs囊泡轉(zhuǎn)運功能

利用高內(nèi)涵分析系統(tǒng)進行延時拍攝，不僅可以觀察TNTs的形成，還可觀察TNTs內(nèi)囊泡物質(zhì)的動態(tài)轉(zhuǎn)運。圖5中觀察到由A549/DDP細胞（紅色熒光）發(fā)出TNT伸向A549細胞（綠色熒光），此時A549/DDP、A549細胞可分別被稱為供體細胞和受體細胞。7'32''~22'36''，可觀察到來源于供體A549/DDP細胞的紅色囊泡在TNT內(nèi)快速轉(zhuǎn)運至受體A549細胞，30'8''~45'12''，囊泡在TNT內(nèi)轉(zhuǎn)運速率大幅下降，這表明A549/DDP作為供體細胞向受體A549細胞轉(zhuǎn)運囊泡物質(zhì)的速率隨轉(zhuǎn)運過程由快至慢。由此可見，通過HCA延時拍攝成像可進一步在動態(tài)觀察中明確TNTs物質(zhì)轉(zhuǎn)運功能在物質(zhì)運送方向、運輸速率方面的特性。

利用LSCM拍攝圖像進行三維重建，可觀察到TNTs的雙向物質(zhì)轉(zhuǎn)運功能。例如，對圖6a（即圖4b）中層掃的細胞圖像進行三維重建：a. 首先，開放Hoechst 33342通道并重構(gòu)細胞表面，可見藍色熒光標記的細胞核及由胞膜包裹的細胞輪廓（圖6b），此時可清晰觀察到連接兩細胞間（A549及A549/DDP）懸浮于基質(zhì)的TNT結(jié)構(gòu)；b. 開放Hoechst 33342及WGA-488通道，可見供體A549細胞（WGA-488偶聯(lián)物標記，綠色熒光）內(nèi)的物質(zhì)（綠色熒光）通過TNT進入受體A549/DDP細胞中（圖6c）；c. 開放Hoechst 33342及DID通道，可見供體A549/DDP細胞（DID標記，紅色熒光）內(nèi)的物質(zhì)（紅色熒光）通過TNT進入受體A549細胞中（圖6d）；d. 開放所有通道（即Hoechst 33342、WGA-488及DID通道），則全面觀察到TNT形成后細胞間雙向的物質(zhì)運輸情況（圖6e）。

利用IMARIS軟件進一步量化TNTs囊泡轉(zhuǎn)運功能，比較LSCM圖像中TNT直徑與不同點狀熒光信號斑直徑大小，根據(jù)兩者比值選擇合適直徑熒光信號斑作為實際可被轉(zhuǎn)運的囊泡。本次研究對圖6進行分析，選擇熒光信號直徑為2.0 μm，并用軟件Quality功能過濾雜信號，最終將兩種熒光信號量化成數(shù)目不等的球體（紅色球體代表DID熒光標記的囊泡、綠色球體代表WGA-488熒光標記的囊泡）（圖7a~d）。量化結(jié)果顯示，a. 供體A549細胞向受體A549/DDP細胞的物質(zhì)運輸：圖7a，c顯示，源于供體A549細胞的綠色小球體共109個，其中在TNT管內(nèi)15個，占總綠色球體的14%，轉(zhuǎn)運進受體A549/DDP細胞內(nèi)38個，占總綠色球體的35%，剩余在供體A549細胞中56個，占總綠色球體的51%。通過上述三維建模分析，可知供體A549細胞內(nèi)約49%（即35%+14%）的物質(zhì)已轉(zhuǎn)運/正轉(zhuǎn)運至受體A549/DDP細胞中（圖7e，f，c）。b. 供體A549/DDP細胞向受體A549 細胞的物質(zhì)運輸：圖7b，d顯示，源于供體A549/DDP細胞的紅色小球體共82個，其中在TNT管內(nèi)4個，占總紅色球體的5%，轉(zhuǎn)運進受體A549細胞內(nèi)17個，占總紅色球數(shù)的21%，剩余在供體A549/DDP細胞內(nèi)61個，占總紅色球體的74%。通過上述三維建模分析，可知供體A549/DDP細胞內(nèi)約26%（即21%+5%）的物質(zhì)已轉(zhuǎn)運/正轉(zhuǎn)運至受體A549 細胞中（圖7e，f，d）。綜合上述三維建模分析可知，在A549與A549/DDP細胞的雙向轉(zhuǎn)運中，以供體A549 細胞向受體A549/DDP 細胞的轉(zhuǎn)運方向為優(yōu)勢轉(zhuǎn)運方向，相比于A549/DDP細胞，A549細胞在囊泡物質(zhì)轉(zhuǎn)運的數(shù)量和比例上更高。

此外，對LSCM成像進行三維重建進行后續(xù)處理，還可觀察轉(zhuǎn)運物質(zhì)在受體細胞內(nèi)的分布情況。在圖8a的三維圖像基礎(chǔ)上對細胞核進行透明處理（圖8b），并沿TNT長軸與兩細胞核中心相交做斜切面分為上、下兩個空間，觀察轉(zhuǎn)運物質(zhì)在兩受體細胞內(nèi)的分布情況：a. 受體A549/DDP細胞中，由A549細胞轉(zhuǎn)運來的物質(zhì)（綠色球體）主要分布在細胞膜膜下、細胞質(zhì)以及核膜周圍（圖8c，d）；b. 受體A549細胞中，由A549/DDP細胞轉(zhuǎn)運來的物質(zhì)（紅色球體）僅分布于細胞膜膜下（圖8e，f）。

綜上，HCA可觀察到TNTs動態(tài)的形成機制和物質(zhì)轉(zhuǎn)運，LSCM成像進行三維重建與建模分析，可獲知物質(zhì)在TNTs內(nèi)雙向轉(zhuǎn)運的特點，可量化轉(zhuǎn)運物質(zhì)的數(shù)量與比例，并可觀察被轉(zhuǎn)運物質(zhì)在受體細胞內(nèi)的分布情況。因此，HCA聯(lián)合LSCM可以更好地進行TNTs觀察與分析。

3 討論

TNTs是近幾年發(fā)現(xiàn)的一種遠距離連接細胞的膜管樣結(jié)構(gòu)，其由脂雙層包裹并以F肌動蛋白（F-actin）單獨構(gòu)成或與微管共同組成基本骨架，使被連接的同種或異種細胞間產(chǎn)生遠距離的直接細胞通訊。在形態(tài)上，TNTs的直徑從幾十納米到幾微米，長度可跨越幾個細胞達到100微米以上。由于目前尚沒有明確的TNTs形成分子標志，因此懸浮于基質(zhì)是TNTs區(qū)別于其他不同細胞膜樣凸起結(jié)構(gòu)（如絲狀偽足等）的顯著特征［24］。TNTs形成機制有2種：a. 相互靠近的兩個細胞，細胞膜彼此接觸，胞膜發(fā)生融合，隨后兩細胞反向易位分離，膜融合區(qū)域拉長、變細，最終形成TNTs；b. 由一個細胞單獨伸出或兩細胞共同伸出絲狀偽足樣膜凸起，當接觸到對方細胞膜或絲狀偽足樣膜凸起后發(fā)生膜融合，形成TNTs［25］。本研究中，利用HCA清晰地捕捉到兩個同種細胞（A549/DDP細胞）通過第一種方式，即接觸分離機制形成TNTs的完整過程（圖3，圖S1），利用LSCM觀察到第二種以絲狀偽足樣膜凸起發(fā)出再融合機制形成的TNTs，構(gòu)成不同亞型腫瘤細胞間的TNT形成機制，這表明腫瘤細胞間有著兩種不同的TNTs形成方式（圖1）。

作為一種新的細胞間通訊方式，不僅要觀察TNTs的形態(tài)學特征，還要分析TNTs的功能。TNTs長度、直徑以及形成指數(shù)均可作為分析TNTs物質(zhì)傳遞功能的評價基礎(chǔ)，如直徑大、延伸長的TNTs有利于細胞間較大物質(zhì)（線粒體、高爾基體囊泡等）的遠距離轉(zhuǎn)運［15，26］。本研究利用HCA測量了腫瘤細胞間形成的TNTs長度、直徑及形成指數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與親本人肺腺癌A549細胞形成的TNTs（平均長度14.71 μm、平均直徑2.27 μm、TNTs指數(shù)4）相比，順鉑耐藥的A549/DDP細胞間形成的TNTs（平均長度25.44 μm、平均直徑2.59 μm、TNTs指數(shù)11）更長、更粗，且更廣泛。該結(jié)果表明，耐藥的腫瘤細胞可能具備更強的TNTs相關(guān)細胞間物質(zhì)轉(zhuǎn)運能力或細胞通訊功能。

在細胞培養(yǎng)過程中，如何確定細胞間形成的絲狀/管狀結(jié)構(gòu)是TNTs？目前認為觀察到細胞間形成懸浮于基質(zhì)的膜管結(jié)構(gòu)是確定TNTs形成的顯著特征［1］。2004年Rustom等［27］首先利用TEM結(jié)合SEM觀察到了TNTs結(jié)構(gòu)，這種觀察方法雖清晰地獲得了TNTs三維圖像，但無法區(qū)分細胞間TNTs的發(fā)出者。隨后很多學者采用CLEM觀察TNTs，但由于CLEM技術(shù)繁雜，存在耗時的操作步驟與交聯(lián)固定劑的使用等不利因素，加之TNTs本身具有形成的隨機性、形態(tài)的多變性以及結(jié)構(gòu)易破壞性等特點，因此該方法對TNTs結(jié)構(gòu)保存和動態(tài)觀察不利［28］。此外，多色受激輻射損耗超分辨顯微技術(shù)（stimulated emission depletion nanoscopy，STED Nanoscopy）也應(yīng)用于TNTs的研究，但其過強的激發(fā)光會造成細胞標記熒光基團快速漂白，亦不利于TNTs的長時間動態(tài)成像觀察［14，29］。本文嘗試利用質(zhì)膜探針染料標記細胞，采用HCA聯(lián)合LSCM進行觀察、拍攝，并應(yīng)用IMARIS軟件建模分析，觀察同種或不同亞型腫瘤間TNTs形成及物質(zhì)轉(zhuǎn)運情況。首先，使用不同的膜結(jié)合熒光染料（DID、WGA-488）有助于判斷細胞間TNTs結(jié)構(gòu)的發(fā)出者，以及觀察囊泡物質(zhì)在TNTs中的轉(zhuǎn)運及在受體細胞中的定位。其次，HCA具有通量高、成像迅速、延時拍攝時間長、光毒性低、可層掃并隨機調(diào)整拍攝視野、拍攝后批量化分析的優(yōu)點［30-31］。因此，利用該系統(tǒng)測量TNTs直徑、長度，并對TNTs指數(shù)進行統(tǒng)計，觀察到了活細胞TNTs形成機制（即接觸分離機制形成TNTs）及其內(nèi)部物質(zhì)實時轉(zhuǎn)運的動態(tài)過程。但HCA高分辨率成像時需要配備相對昂貴的水鏡成像系統(tǒng)，且因其通量高會造成孔板不必要的浪費，因此嘗試將HCA（用于活細胞成像）與LSCM（固定細胞成像）結(jié)合使用實現(xiàn)優(yōu)勢互補，以更有效、快速、經(jīng)濟的方式進一步觀察TNTs轉(zhuǎn)運過程并分析轉(zhuǎn)運功能。應(yīng)用IMARIS軟件對LSCM采集的圖像進行三維重建和建模分析，探明了TNTs的另一種形成機制（即以絲狀偽足樣膜凸起伸出后再融合形成TNT的機制），確定了經(jīng)TNTs的轉(zhuǎn)運優(yōu)勢方向、轉(zhuǎn)運效率及轉(zhuǎn)運物質(zhì)在受體細胞內(nèi)的空間分布情況。

4 結(jié)論

綜上所述，利用HCA聯(lián)合LSCM可有效觀察TNTs結(jié)構(gòu)、形成機制、內(nèi)部物質(zhì)（如囊泡）轉(zhuǎn)運特點及物質(zhì)被轉(zhuǎn)運后在受體細胞內(nèi)的分布特點。同時HCA聯(lián)合LSCM觀察TNTs結(jié)構(gòu)與功能還具有經(jīng)濟、便利的優(yōu)勢，有利于在細胞形態(tài)學實驗中推廣使用。

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數(shù)據(jù)可用性聲明本論文的關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)（DOI: 10.57760/sciencedb.06337/CSTR: 31253.11.sciencedb.06337）可在Science Data Bank數(shù)據(jù)庫（https://www.scidb.cn/）中訪問獲取。其中*.ims文件的打開軟件為Imaris，*.pzfx文件的打開軟件為Graphpad Prism。