全杜仲膠囊在犬股骨頭壞死修復過程中對VEGF/bFGF 的調(diào)控作用和對Bcl-2/Bax 及Caspase-3 蛋白表達的影響

孫瑞妍，尹鵬開，魏 巍，鄧小磊，侯德才

（1.遼寧中醫(yī)藥大學，遼寧 沈陽 110000；2.遼寧中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院，遼寧 沈陽 110000；3.遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，遼寧 沈陽 110000）

股骨頭壞死（ONFH）又稱股骨頭缺血性壞死，是一種慢性多因素疾病，致殘率極高，預后較差，屬中醫(yī)學“骨痹”、“骨蝕”、“骨痿”等范疇。流行病學調(diào)查顯示男性發(fā)病率高于女性，體重超標者或長期從事體力勞動的人發(fā)病率較高［1］，好發(fā)于20～40 歲中青年人［2］。長期勞損、外力創(chuàng)傷、長期大量使用激素、長期飲酒、長期暴露于輻射、超重等都是造成股骨頭缺血性壞死的主要原因，如不及時處理，會造成關節(jié)功能障礙，從而降低患者的生存質(zhì)量，降低病人的預期壽命。多年來，臨床研究對ONFH 的機制不斷進行探索。祖國醫(yī)學認為“邪氣聚集，則氣機不足”。這表明機體的多種病因都會導致機體的臟腑機能、血液、津液的失調(diào)，從而導致機體的抵抗力下降。壞死后股骨頭下的軟骨會受到損傷，造成血液循環(huán)不暢，經(jīng)絡不通［3］。現(xiàn)代醫(yī)學理論按病因?qū)⒋瞬〔⒎譃? 類［4］：（1）因骨折引起的創(chuàng)傷性股骨頭壞死；（2）先天發(fā)育不良導致；（3）長期過大量應用激素、貧血、過度飲酒等導致的非創(chuàng)傷性股骨頭壞死。該病多見于患側(cè)髖關節(jié)疼痛，腹股溝區(qū)疼痛最常見，多見于在股骨頭的小動脈上，到了后期，由于過度勞累，疼痛加劇，甚至出現(xiàn)跛行的癥狀。當前，有大量的科學證據(jù)表明，中醫(yī)藥能延緩病情的發(fā)展過程，尤其是對早中期的患者療效甚好。因此，本研究擬通過構(gòu)建比格犬創(chuàng)傷性ONFH 模型，研究全杜仲膠囊對ONFH 的治療作用，為臨床上防治ONFH 提供新的方案。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

本實驗共選用12 只SPF 級雄性比格犬，年齡16～24 月，體重9.6～12.3 kg。實驗動物許可證號SCXK（遼）2014-0003。所有實驗動物均單獨飼養(yǎng)于3.5 m2的犬舍里，每日按時消毒、喂養(yǎng)，可自由活動。本實驗方案已通過遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院動 物 實 驗 倫 理 委 員 會 審 查（編 號 ：21000092019051）。

1.2 實驗藥物

造模用藥：鹽酸替來他明鹽酸唑拉西泮50（法國VirBac 集團，批號：83887902）；注射用滅菌用水（中國大冢制藥有限公司，國藥準字：H12020025）；液氮：青霉素（華北制藥股份有限公司，國藥準字：H20033934）；硫酸慶大霉素注射液（辰欣藥業(yè)股份有限有限公司，國藥準字：H37021973））；注射用阿托品（天津金耀藥業(yè)有限公司、國藥準字H12020382）；氯胺酮注射液（浙江九旭藥物有限公司，國藥準字H20023609）；頭孢曲松鈉（上海羅氏制藥有限公司，國藥準字H10983037）。

實驗用藥：全杜仲膠囊由遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院藥劑科提供，每粒裝0.48 g（相當于原藥材2.5 g）。仙靈骨葆膠囊由遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院藥劑科提供，規(guī)格：0.5 g/粒。

1.3 實驗試劑與儀器

1.3.1 實驗試劑 蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒（碧云天生物技術(shù)，批號：C0105）；無水乙醇（國藥集團化學試劑有限公司，批號：100092008）；二甲苯（國藥集團化學試劑有限公司，批號：10023418）；異丙醇（國藥集團化學試劑有限公司，批號：40049962）；過硫酸銨（北京索菜寶科技有限公司，批號：A8090）；犬血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)ELISA試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號：ml024667）；犬堿性成纖維細胞生長因子(b-FGF)ELISA 試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號：ml061095）；高靈敏度化學發(fā)光檢測試劑盒（康為世紀生物科技有限公司，批號：CW0049）；BCA 蛋白測定試劑盒（康為世紀生物科技有限公司，批號：CW0014）；PMSF（北京索菜寶科技有限公司，批號：P0100）；麗春紅染色試劑（康為世紀生物科技有限公司，批號：CW0057S）；RIPA 蛋白裂解液(強)（康為世紀生物科技在限公司，批號：CW2333）；2×SuperStain 上樣緩沖液（康為世紀生物科技有限公司，批號：CW2636）；Rabbit antibody（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；TRIzon Reagent（康為世紀生物科技有限公司，批號：CW0580）；ANti-Bcl2L2（博奧森，批號：bs-5903R）；ANti-Bax（博奧森，批號：hs-28034R）；ANti-Caspase-3（博奧森，批號：bs-0081R）。

1.3.2 實驗儀器 SHZ-88 型水浴恒溫振蕩器（其林貝爾儀器制造有限公司）；SpectraMaxi3 型多功能全波長酶標儀（由美國MD 公司制造）、ST16R 型冷凍高速離心機（由Thermo 公司制造）；TAB-120FR 型全自動生化分析儀（由日本東芝公司制造）；Leica（品牌）BOND-MAX（型號）全自動免疫組化染色劑；ASP 6025 型全自動脫水機（由Leica 公司制造）、RM2235 型手動石蠟切片機（由Leica 公司制造）、EG1150H 型包埋機（由Leica 公司制造）、HI1220 型烘片機（由Leica 公司制造）、全自動生化分析儀（日本日立7180 型）、M8 數(shù)字掃描顯微成像系統(tǒng)（Precipoint，德國）；垂直板電泳裝置（美國，Bio-Rad）；Trans-Blot SD 半干轉(zhuǎn)?。˙io-Rad，美國），化學發(fā)光成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司/5200）。

1.4 實驗方法

1.4.1 分組及造模 利用隨機數(shù)字表法，將12 只比格犬分成4 組，分別是正常組3 只、模型組3 只、全杜仲膠囊組3 只和仙靈骨葆膠囊組3 只。采用側(cè)臥位，將髂后上棘與大粗隆連線的中點為圓弧做切點，按順序切開皮膚、皮下組織以及筋膜，再將筋膜切開，使其在遠端完全展露出來。順著肌纖維的方向分開，使外旋肌群充分暴露，使股骨外側(cè)旋轉(zhuǎn)，切開外旋肌的一小段肌腱，在股骨節(jié)囊上套上無菌的漏斗套，用無菌紗布保護周圍的軟組織，每一次注入氮，直到液氮完全揮發(fā)，然后用生理鹽水復溫。

1.4.2 手術(shù)方法及給藥 手術(shù)區(qū)域常規(guī)酒精消毒，以一側(cè)大轉(zhuǎn)子為中心鋪無菌洞巾，于股骨干前緣作弧形切口；切開皮膚，暴露股三角區(qū)，將與關節(jié)囊連在一起的脂肪分離，將關節(jié)囊露出來，沿股骨頸向下暴露股骨大轉(zhuǎn)子，定好位并進針。使用骨科磨鉆將克氏針從股骨大粗隆下兩厘米左右位置進針，沿股骨頸方向鉆至股骨頭內(nèi)進行病灶清除術(shù)。術(shù)后沖洗，分層縫合，用無菌敷料覆蓋手術(shù)區(qū)域，繃帶重新固定，送回，并每日一次肌注頭孢美唑鈉預防局部感染。正常組和模型組造模期間不予任何干預。按《中藥藥理學研究方法學（第3 版）》中人體和動物表面積折算等效劑量比值表轉(zhuǎn)換。予以全杜仲膠囊組一日1 次，1 次2 粒全杜仲膠囊；仙靈骨葆膠囊組一日1 次，1 次2 粒仙靈骨葆膠囊，連續(xù)用藥12 周。開始造模的第一天即開始進行灌胃。

1.5 觀察指標及方法

1.5.1 犬股骨頭組織 HE 染色 用4%多聚甲醛固定犬股骨頭標本 24 h 以上，按照蘇木素-伊紅（HE）染色常規(guī)方法進行。75%、85%、95%、100%梯度進行酒精脫水、二甲苯透明、石蠟浸泡包埋，組織塊切片、二甲苯脫蠟、100%、95%、85%、75%梯度酒精復水、蘇木精染色、70%鹽酸酒精分化，伊紅復染、中性樹膠封片后，在光學顯微鏡下進行組織形態(tài)觀察。

1.5.2 血清血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、成纖維生長因子（BFGF）檢測 各組造模12 周后，比格犬耳緣靜脈取血，采用ELISA 法，按標準操作。

1.5.3 Micro CT 檢測 應用Micro CT，對股骨頭掃描拍片，并用自帶軟件計算出骨密度（BMD）、骨體積分數(shù)（BV/TV）、單位體積骨組織的面積大?。˙S/BV）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁數(shù)量（Tb.N）、骨小梁空隙（Tb.Sp）。

1.5.4 免疫組化法檢測 bcl-2、bax、caspase-3 的表達量 取犬股骨頭病理的蠟塊切片，（先4%多聚甲醛/0.1 mol PBS （pH7.0～7.6）固定60 min，PBS 沖洗2 min，沖洗兩次，在5 ℃下進行組織脫水，用石蠟將樣品包埋并切片，厚度 8 μm，用玻片完成裱片，在75 ℃的烤片箱中烤1 h。將所要制備的一抗試劑容器放入試劑架中，再將二抗組合試劑架和一抗組合試劑架放在操作臺上。

使用 Image J 軟件對各組的平均光密度（average optical density，AOD）值分析，使用公式 AOD=IOD/Area 進行蛋白的定量比較分析，用平均光密度值（AOD）來表示各組中不同蛋白表達的相對含量。

1.6 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果

2.1 各組造模第12 周股骨頭組織病理學觀察

HE 染色結(jié)果顯示，正常組（A）犬股骨頭鈣化組織嚴密，骨小梁排列整齊。模型組（B）犬股骨頭鈣化組織比例低，骨小梁松散排列無規(guī)則。全杜仲組（C）、仙靈骨葆膠囊組（D）犬骨小梁組織多且排列緊密。并且全杜仲組比仙靈骨葆組的犬股骨頭骨小梁更加排列緊密。見圖1。

圖1 各組犬股骨頭組織HE 染色結(jié)果（×100）Fig 1 HE staining results of femoral head tissue in dogs of each group（× 100）

2.2 各組造模第12 周VEGF 水平

全杜仲膠囊能明顯上調(diào)狗股骨頭的血管內(nèi)皮生長因子；與正常組比較，模型組造模第12 周后血清VEGF 水平降低（P＜0.05）；正常組較模型組表達較高，但無明顯優(yōu)勢；與模型組比較，仙靈骨葆膠囊組、全杜仲膠囊組造模第12 周血清VEGF 水平均升高（P＜0.05），且2 個治療組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），全杜仲膠囊組水平最高，其次是仙靈骨葆膠囊組。見表1。

VEGF-A（pg/mL）477.50±33.06 359.80±31.16**525.40±35.82△△509.80±64.35△△組別正常組模型組全杜仲膠囊組仙靈骨葆膠囊組

2.3 各組造模第12 周堿性BFGF 水平

全杜仲膠囊能明顯上調(diào)狗股骨頭的BFGF；與正常組比較，模型組造模第12 周后血清BFGF 水平降低（P＜0.05）；正常組較模型組表達較高，但無明顯優(yōu)勢；與模型組比較，仙靈骨葆膠囊組、全杜仲膠囊組造模第12 周血清BFGF 水平均升高（P＜0.05），且2 個治療組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），全杜仲膠囊組水平最高，其次是仙靈骨葆膠囊組。見表2。

組別正常組BFGF（pg/mL）73.17±6.01模型組51.58±3.34**全杜仲膠囊組96.67±5.40△92.92±5.52△△仙靈骨葆膠囊組

2.4 各組造模第 12 周股骨頭 Micro CT 掃描情況比較參數(shù)指標

由表3 可得出，與正常組比較，模型組BMD、BS/BV、BV/TV、Tb.Th、Tb.N 均將低，Tb.Sp 升高，比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與模型組比較，仙靈骨葆膠囊組，全杜仲膠囊組BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th 升高，Tb.Sp、BS/BV 降低，比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

參數(shù)指標BMD（mg/cm^3）BS/BV（1/mm）BV/TV（%）Tb.Th（mm）Tb.Sp（mm）Tb.N（1/mm）正常組1042.360±47.280 18.670±2.590 75.320±5.680 0.480±0.040 0.120±0.030 1.710±0.060仙靈骨葆膠囊組958.357±83.280 11.630±1.870 68.290±5.810 0.370±0.050 0.160±0.030 1.670±0.080全杜仲膠囊組943.000±57.670 11.320±2.410 67.390±5.950 0.340±0.040 0.190±0.040 1.490±0.170模型組819.370±49.230 13.680±1.830 48.927±4.490 0.260±0.030 0.298±0.060 1.240±0.200

2.5 各組造模第12 周bcl-2 蛋白相對表達量比較

全杜仲膠囊組和仙靈骨葆膠囊組能顯著提高狗股骨頭中bcl-2 蛋白的表達，與模型組比較有差異，具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖2、表4。

BCL-2（pg/mL）1.426±0.138 0.562±0.0649**0.804±0.0952△0.827±0.130△△組別正常組模型組全杜仲膠囊組仙靈骨葆膠囊組

圖2 Bcl-2 免疫組化圖以及Bcl-2 在各組中平均光密度的表達Fig 2 Immunohistochemical map of Bcl-2 and expression of average optical density of Bcl-2 in each group

2.6 各組造模第12 周bax 蛋白相對表達量比較

全杜仲膠囊組和仙靈骨葆膠囊組能明顯降低狗股骨頭中bax 蛋白的表達，與模型組比較有差異，具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖3、表5。

圖3 Bax 免疫組化圖以及Bax 在各組中平均光密度的表達Fig 3 Immunohistochemical map of Bax and expression of average optical density of Bax in each group

組別正常組模型組caspase-3（pg/mL）0.9241±0.05142 1.7770±0.1630**全杜仲膠囊組1.0740±0.0915△1.0370±0.1517△△仙靈骨葆膠囊組

2.7 各組造模第12 周caspase-3 相對表達量比較

全杜仲膠囊組和仙靈骨葆膠囊組能明顯降低狗股骨頭中caspase-3 蛋白的表達，與模型組比較有差異，具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖4、表6。

圖4 caspase-3 免疫組化圖以及caspase-3 在各組中平均光密度的表達Fig 4 Immunohistochemical map of caspase-3 and expression average optical density of caspase-3 in each group

3 討論

目前，在髖關節(jié)疾病中，ONFH 是最常見的一種。多種原因可造成股骨頭缺血，進而發(fā)生壞死、塌陷等病變，如果不及時治療，后期會發(fā)展成骨關節(jié)炎。此病發(fā)病率高，已日益成為全球健康問題，目前尚無理想療法。當疾病發(fā)展到晚期時，通常要進行髖關節(jié)置換術(shù)，雖手術(shù)效果顯著，但植入體的壽命是有限的，可能要進行翻修而且手術(shù)費用也很高［5］，所以這類患者在疾病晚期往往會對手術(shù)治療望而卻步。另一方面，也有部分患者因為自身基礎疾病的原因，無法進行手術(shù)。再加上手術(shù)帶來的繼發(fā)性創(chuàng)傷是不可避免的。故目前，對于治療青少年ONFH，髖關節(jié)置換手術(shù)并不是一個良好的治療方案。臨床需找到更好的預防和治療方法，逆轉(zhuǎn)早期的ONFH。

仙靈骨葆膠囊常被用于骨傷科疾病，含有淫羊藿、丹參、續(xù)斷、補骨脂、地黃以及知母等成分，具有補益肝腎、強筋壯骨、活血通絡的作用。趙丁巖等［6］通過實驗結(jié)果推測出淫羊藿苷可以干預股骨頭壞死的進展。賈丙申等［7］通過對大鼠實驗，發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷對股骨頭壞死有明顯的改善作用，可以修復壞死的組織。并有研究證明仙靈骨葆膠囊可以改善髖關節(jié)的血液循環(huán)及其功能，降低患者疼痛感，改善骨代謝的水平。所以本實驗將仙靈骨葆膠囊作為陽性藥物對照，來探討全杜仲膠囊對ONFH 的治療作用［8，9］。

《神農(nóng)本草經(jīng)》將杜仲稱為藥中上品。臨床上杜仲價值高，被廣泛應用。杜仲膠因其高抗拉的特點，能形成一種極佳的“骨骼粘合劑”?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》曾記載杜仲性溫，有強筋壯骨、補益肝腎、補益腰膝、祛除酸痛等作用［10］，其化學組成主要有木脂素類、環(huán)烯醚萜類、苯丙素類、黃酮類、多糖類、杜仲膠和抗真菌蛋白等［11］，能有效地治療骨折、骨質(zhì)疏松等骨疾病。劉東通過觀察數(shù)例膝骨關節(jié)炎患者，全杜仲膠囊能有效地改善膝關節(jié)功能，緩解疼痛［12］。張文博等［13］通過對M2 巨噬細胞上清液和杜仲總黃酮結(jié)合的研究，認為其可作為組織材料工程的輔助工具。

ONFH 動物模型的建立是實驗成功的基礎，目前已有很多實驗動物和造模方式，犬的生理特征、組織和解剖結(jié)構(gòu)與人類相似，可比性高，且液氮冷凍法備的犬股骨頭壞死模型被廣泛采用，利用液氮低溫能引起股骨頭周圍的血管痙攣，破壞內(nèi)皮細胞，進而導致ONFH［14］。故此次實驗選用12 只比格犬為模型動物，通過液氮灌注建立ONFH 模型并給予全杜仲膠囊進行干預。通過HE 染色，結(jié)果顯示：造模第12 周HE 染色顯示，正常組犬股骨頭鈣化組織嚴密，骨小梁排列整齊。模型組犬股骨頭鈣化組織比例低，骨小梁松散排列無規(guī)則［15］。以上結(jié)果均提示成功建立ONFH 模型。

細胞凋亡是細胞的主動性死亡，為了維持機體平衡。成骨細胞在骨組織的形成、代謝及礦化中起著關鍵作用。當骨骼被損傷時，成骨細胞會迅速生成新的骨組織，來對骨損傷進行修復。如果成骨細胞壞死，這個過程受阻，就會導致ONFH，進而導致其功能受到影響。成骨細胞和破骨細胞之間存在著一種復雜的凋亡平衡，若失衡會影響一系列的反應，所以維持二者的動態(tài)平衡極其重要。因此，控制成骨細胞死亡是抑制股骨頭壞死的關鍵一步。細胞凋亡是受多種基因調(diào)控，目前，bcl-2 和bax 是一對調(diào)控凋亡的基因，bcl-2 可以抑制凋亡，而bax 則可以抑制bcl-2 發(fā)揮作用。bcl-2 與 bax 結(jié)合，從而形成同源二聚物［16］。大部分研究發(fā)現(xiàn)這兩種蛋白之間的比例在一定程度上是決定細胞凋亡的重要因素。在細胞凋亡信號的刺激下，bax 活化，在線粒體上形成一種二聚體，提高了線粒體的膜通透性，從而導致了細胞的凋亡。caspase-3 在細胞凋亡過程中同樣起著關鍵作用。研究證明降低caspase-3 的激活，就可以有效地抑制細胞凋亡的進行。通過檢測全杜仲膠囊對bcl-2、bax、caspase-3 表達的影響，發(fā)現(xiàn)全杜仲膠囊能升高bcl-2，降低bax，降低caspase-3 從而抑制了凋亡過程。從實驗結(jié)果可以推測全杜仲膠囊可抑制破骨細胞的活性，增強骨細胞存活，從而促進骨的增生。

ONFH 是因為血液供應減少，從而缺氧導致壞死。要延緩ONFH 的進程，可以通過釋放VEGF，導致血管生成和成骨來實現(xiàn)［17］。VEGF 最早名為血管通透因子，在1983 年由Senger 等［18］從腫瘤細胞中分離出來的。VEGF 具有促進血管內(nèi)皮生成、提高通透性和增殖的作用，是最強的促血管形成因子。骨與血管的關系十分密切，且血管發(fā)育早于骨［19］。楊操等［20］的實驗結(jié)果表明，基因轉(zhuǎn)染可促進骨組織中的血管再生，從而使骨骼的再生得到進一步的改善。同時，VEGF 具有促進血管通透性的作用，可作為一種促進骨折修復的新方法［21］。畢鍇等［22］通過對家兔實驗，證明在骨折治療過程中，不同組織表達都有促進VEGF、bFGF 的表達作用，分期治療骨折。進一步的臨床應用將為骨折的治療提供一種可行的、無創(chuàng)的治療方法。并且研究表明，VEGF 可以明顯提高骨內(nèi)微循環(huán)的面積和數(shù)量，從而提高骨內(nèi)血液供應，為骨代謝提供必需的營養(yǎng)［23］。bFGF 同樣在骨細胞增殖、局部血液重建方面起著重要的作用。這些生長因子都可以促進新生的血管再生，促進修復壞死部位。仙靈骨葆膠囊的藥理學研究結(jié)果顯示，仙靈骨葆膠囊能促進骨生成［24］，加快骨痂礦物化的重塑速度，對VEGF 水平進行上調(diào)來修復股骨頭微血管，從而保護骨細胞來抑制ONFH 發(fā)生的情況。通過ELISA 法檢測犬股骨頭內(nèi)VEGF 含量，明顯看出VEGF、bFGF 在模型組壞死的狗股骨頭中低于全杜仲組和仙靈骨葆組。全杜仲膠囊與仙靈骨葆膠囊具有類似的作用，可以有效抗骨壞死，改善股骨頭局部血運情況來治療ONFH。

綜上所述，全杜仲膠囊可以通過升高血清中VEGF、bFGF 表達含量，提高bcl-2 蛋白，抑制bax蛋白，并且降低caspase-3 蛋白，減少細胞凋亡的發(fā)生，穩(wěn)定機體內(nèi)環(huán)境，從而延緩股ONFH 的進展。后續(xù)實驗將在此基礎上，進一步結(jié)合臨床治療效果，為更有效地預防和治療ONFH 提供新的思路。

作者貢獻度說明：

孫瑞妍、尹鵬開：實驗操作、數(shù)據(jù)收集及撰寫文章；鄧小磊、魏巍：實驗設計、造模指導；侯德才：提出實驗方案，文章修改。

所有作者聲明不存在利益沖突關系。