冷水魚固著類纖毛蟲PCR檢測方法探討及感染因素分析

王雨維 南匯珠 殷實 曹夢娟 劉莉雯 盧鑫 安瑞永 馬磊

摘 要：針對冷水魚養(yǎng)殖中固著類纖毛蟲檢測難和污染源不明確、種類鑒定難的問題，對冷水魚養(yǎng)殖環(huán)境中固著類纖毛蟲的主要寄生種類及感染因素進行調(diào)查分析，在不同季節(jié)于河北省內(nèi)采集冷水魚和水環(huán)境樣本。首先，采用形態(tài)學(xué)方法對魚體及水環(huán)境中的固著類纖毛蟲進行初步鑒定；然后，建立PCR方法進行分子水平鑒定，并進行系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析；最后，對冷水魚感染寄生蟲的原因進行分析。形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果表明，冷水魚寄生的固著類纖毛蟲主要有累枝蟲（Epistylis sp.）和鐘蟲（Vorticella sp.）2類；引物設(shè)計、敏感性和特異性試驗結(jié)果顯示，建立的寄生蟲PCR檢測方法有效，測序比對和系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果進一步驗證了其形態(tài)學(xué)結(jié)果；運用已建立的PCR方法檢測出固著類纖毛蟲在水環(huán)境中高達94.38%，魚體廣泛寄生，感染率達到了100%；且無季節(jié)差異，水體中的蟲體可能是造成魚長期感染的原因之一。研究數(shù)據(jù)可為冷水魚病害的科學(xué)預(yù)測、預(yù)防和治療提供依據(jù)，同時為冷水魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供疫病防治參考。

關(guān)鍵詞：動物寄生蟲學(xué)；冷水魚；纖毛蟲；形態(tài)學(xué)；系統(tǒng)發(fā)育分析

中圖分類號：Q959.17

文獻標(biāo)識碼：A DOI：10.7535/hbkd.2023yx03008

收稿日期：2023-05-25；修回日期：2023-06-09；責(zé)任編輯：王淑霞

基金項目：中國博士后面上項目（2019M651061）；河北省重點研發(fā)計劃項目（22326703D）；石家莊市廳市會商專項資金項目（225500395A）

第一作者簡介：王雨維（1997—），女，河北唐山人，碩士研究生，主要從事水生動物學(xué)方面的研究。

通信作者：馬 磊副教授。E-mail：lmahappy@hebtu.edu.cn

Discussion of PCR detection method and investigation of infection factors of sedentarius ciliates in cold-water fish

WANG Yuwei^1，2， NAN Huizhu^1，2， YIN Shi¹， CAO Mengjuan^1，2， LIU Liwen^1，2， LU Xin^1，2， AN Ruiyong¹， MA Lei^1，2

（1.Key Laboratory of molecular cell biology，Ministry of Education， College of Life Sciences， Hebei Normal University， Shijiazhuang， Hebei 050024， China; 2. Hebei Collaborative Innovation Center for Eco-Environment， College of Life Sciences， Hebei Normal University， Shijiazhuang， Hebei 050024， China）

Abstract：Aiming at the problem of difficult detection of sedentarius ciliates， unclear pollution sources and difficult identification of species in the cold-water fish farming， the major parasitic species of the parasites and the infective factors were investigated and analyzed. Samples of cold-water fish and water were collected in different seasons in Hebei Province. Firstly， the sedentarius ciliates on the fish body and in the water environment were initially identified by using morphology. Secondly， a PCR method was established for molecular level identification and phylogenetic analysis. Finally， the reasons for cold-water fish infecting the parasite were analyzed. Morphological identification reveals that the mainly parasitic species of sedentarius ciliates were Epistylis sp. and Vorticella sp.; A PCR method to test the parasites is successfully established. The results of sequences alignment and phylogenetic analysis verify the correctness of morphological test. The established PCR method is used to detect the prevalence of sessile ciliates in the water environment， which is as high as 94.38%， and the infection rate of the fish is up to 100% with no seasonal difference. The parasites in water may be one of the reasons for the long-term infection of the fish. The findings provide a scientific basis for predicting， preventing and treating cold-water fish diseases， as well as serving as a reference for disease prevention and control in the sustainable development of the cold-water fish farming industry.

Keywords：animal parasitology; cold-water fish; sedentarius ciliate; morphology; phylogenetic analysis

冷水魚營養(yǎng)價值高，市場需求量逐年增加，野生捕撈量已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足人們的需求，因此，冷水魚養(yǎng)殖業(yè)正在不斷擴大^［1］。河北省西鄰太行山、北鄰燕山，冷泉水豐富，冷水魚養(yǎng)殖量位列全國第5，是該省的支柱型產(chǎn)業(yè)之一^［2-3］。隨著集約化養(yǎng)殖及養(yǎng)殖密度的增加，冷水魚的病蟲害問題不斷顯現(xiàn)，固著類纖毛蟲病害就是其中的一類^［4］。

固著類纖毛蟲隸屬于纖毛門（Ciliophora）、寡膜綱（Oligohymenophorea）、固著目（Sessilida）。這類纖毛蟲種類繁多且形態(tài)極其相似，包括鐘蟲、聚縮蟲、單縮蟲和累枝蟲等，常見于近海岸環(huán)境之中，經(jīng)常固著生活在惰性基質(zhì)或活的生物體上，也有部分生活在淡水環(huán)境之下，自由或營寄生生活

［5］，淡水中常見種類為累枝蟲和鐘蟲。該類原生動物自由生活時，主要攝食水中的微小生物，寄生時主要定植于宿主組織，對組織產(chǎn)生壓迫，寄生于鰓妨礙魚類呼吸，同時引起細(xì)菌、病毒的繼發(fā)感染^［6］。在眾多寄生蟲種類中，累枝蟲的危害最為巨大，大規(guī)模感染累枝蟲會使魚體表出現(xiàn)潰瘍或棉花樣的白斑，嚴(yán)重時造成鱗片脫落、脊柱出現(xiàn)紅色病變^［7］；其次是鐘蟲，其廣泛寄生在各種淡水魚的鰓部和皮膚上，大量寄生在魚體體表時能夠引起宿主鱗片被侵蝕，同時使體表產(chǎn)生坑狀的出血病變，降低其市場價值；大量寄生于鰓部時使鰓不能呼吸、影響排泄和滲透調(diào)節(jié)功能，最終導(dǎo)致魚體死亡，尤其對幼魚的危害極大，死亡率高^［8］。在有機質(zhì)含量較高、熱污染程度嚴(yán)重的水體中極易暴發(fā)此類寄生蟲病^［9］。

本研究通過調(diào)查分析河北省冷水魚中固著類纖毛蟲的感染情況和感染因素，旨在科學(xué)預(yù)防及生態(tài)化防治該類寄生蟲的感染，為保障冷水魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

2020-02—2022-07在河北省冷水魚養(yǎng)殖場采集60尾冷水魚（鱘魚、虹鱒魚、青海湖裸鯉），實驗共采集組織樣本143份（皮膚、體表黏液和鰓）和水樣320份，組織樣本采集后，取部分立即壓片進行形態(tài)學(xué)觀察，將部分樣本迅速冷藏保存，用于后續(xù)基因組提取，對于不能及時進行基因組提取的樣本應(yīng)盡快放置在-80 ℃冰箱中保存。

1.2 實驗儀器及材料

光學(xué)顯微鏡，購自Nikon公司；離心機，購自Thermo公司；凝膠成像系統(tǒng)和PCR儀，購自BioRad公司；恒溫培養(yǎng)箱，購自寧波樂電儀器制造有限公司；動物組織/細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒和質(zhì)粒小量提取試劑盒，均購自北京索萊寶生物科技公司；0.8 μm孔徑濾膜，購自上海興亞凈化材料公司；PCR mix等試劑，均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定

針對每尾魚進行以下組織樣本的采集，并進行形態(tài)學(xué)觀察。

1）皮膚

肉眼觀察魚體皮膚是否有擦傷或腐爛，肌肉是否浮腫，鰓蓋是否充血穿孔，魚鰭是否分叉或蛀爛等現(xiàn)象。如有病變情況，則將病變組織及時壓片，觀察并采集保存。

2）體表黏液

用解剖鑷刮取少量的體表黏液，壓片后置于顯微鏡下觀察。

3）鰓

用剪子剪取魚體左右兩側(cè)完整的鰓放在培養(yǎng)皿中，仔細(xì)檢查鰓片上是否有肉眼可見病變，剪取適量的鰓組織置于加有無菌生理鹽水的載玻片上，蓋上蓋玻片，在顯微鏡下進行觀察；將鰓瓣剪下，用解剖針把鰓絲逐條拉開檢查，或用鑷子將鰓的內(nèi)含物刮下，用無菌生理鹽水稀釋，然后用塑料滴管吸取少量稀釋液制成臨時裝片在顯微鏡下進行觀察。

1.3.2 PCR檢測方法的建立

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫（www.ncbi.nlm.nih.gov）中公布的寄生固著類纖毛蟲（ID： txid1974272）18S序列，利用軟件Primer Premier 5設(shè)計引物，F(xiàn)： 5′-GGAAACTCATCAGGRCAAGAAGATT-3′; R： 5′-GGGCGRTGTGTACATTTTG-3′，并送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行合成。合成固著類纖毛蟲褶累枝蟲Epistylis plicatilis的18S序列進行克隆后，以質(zhì)料作為陽性模板待后續(xù)實驗的使用^［10］。探索實驗條件：根據(jù)酶、引物退火溫度及DNA濃度等，摸索最佳的PCR擴增條件，預(yù)期擴增片段長度約為440 bp。

1）特異性試驗

為證明實驗過程中引物的特異性，以淡水魚類養(yǎng)殖中常見的原蟲：周叢小車輪蟲Trichodinella epizootica、剌鉤斜管蟲Chilodonella uncinata及尖前口蟲Frontonia acuminata的DNA為模板進行PCR擴增；此外，分別以累枝蟲和鐘蟲的DNA為模板進行二者的檢測，擴增后用1.5%的凝膠電泳進行檢測并觀察。

2）敏感性試驗

利用紫外分光光度計對褶累枝蟲Epistylis plicatilis的18S基因陽性質(zhì)粒進行濃度測定，按照公式：拷貝數(shù)（拷貝/μL）=［阿伏伽德羅常數(shù)×質(zhì)粒質(zhì)量濃度（ng/μL）×10^-9］/［片段長度（bp）×660］，阿伏伽德羅常數(shù)為6.02×10²³，計算出DNA的拷貝數(shù)，用ddH₂O對標(biāo)準(zhǔn)品以10倍梯度進行稀釋，以稀釋的質(zhì)粒為模板進行PCR擴增，并進行結(jié)果觀察。

1.3.3 組織和水中固著類纖毛蟲的檢測

本研究將獲得的魚體表黏液、魚鰓和外表皮組織在液氮中充分研磨；向裝有水樣濾膜的EP管中加入1 mL的丙酮溶液充分溶解濾膜，再根據(jù)動物組織/細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒的操作說明提取DNA后，即用或冷凍保存?zhèn)溆?。采?.3.2中建立的PCR方法進行上述樣品檢測，將陽性樣本送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，并對測序結(jié)果進行比對分析。

1.3.4 固著類纖毛蟲的系統(tǒng)發(fā)育分析

選取GenBank中固著目生物的18S序列，使用MAFFT（version 7）進行序列校對；使用BioEdit （version 7.2.5）人工裁剪對齊的序列。使用ModelFinder尋找最適模型用于后面分析，選擇低BIC值模型；使用IQ-TREE （version 1.6.8）構(gòu)建ML樹，模型為K2P+R3，Bootstrap次數(shù)為100。使用MrBayes構(gòu)建BI樹，模型為K2P+I+G4，起始4條鏈，并行2個，運行1 000 000代，每500代取樣1次，舍棄初始25%次取樣。以ML樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，分別標(biāo)注每個節(jié)點的標(biāo)準(zhǔn)自展值及后驗概率。

1.3.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

經(jīng)過測序和系統(tǒng)發(fā)育分析確定物種的樣本并進行統(tǒng)計、利用SPSS軟件，采用單因素方差分析對不同季節(jié)魚體內(nèi)固著類纖毛蟲的感染率與水體中該類寄生蟲的分布進行統(tǒng)計分析，所得數(shù)據(jù)均用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的方式表示。

2 結(jié)果分析

2.1 固著類纖毛蟲的形態(tài)學(xué)觀察

固著類纖毛蟲種類豐富，構(gòu)造大致相同，近似倒鐘罩型，具有運動功能的反口纖毛環(huán)在顯微鏡下清晰可見。累枝蟲與鐘蟲最大的區(qū)別在于柄是否能收縮，且在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，鐘蟲呈獨立生存狀態(tài)，不成群，累枝蟲成群生活。顯微鏡下進行動態(tài)觀察可見，各種固著類緣毛亞綱纖毛蟲口圍唇收縮，口圍唇和口圍盤可作為固著類緣毛亞綱纖毛蟲分類的主要依據(jù)（見圖1）。調(diào)查雖然顯示出固著類纖毛蟲存在于冷水魚養(yǎng)殖環(huán)境中，然而該類寄生蟲廣泛生活在有機質(zhì)含量高、熱污染程度高的水環(huán)境中^［11］，間接說明了調(diào)查的冷水魚養(yǎng)殖環(huán)境中有機質(zhì)含量偏高。一般來說，養(yǎng)殖場中有機質(zhì)的降解需要大量氧氣的參與，當(dāng)水中的溶解氧含量較低時，會造成缺氧環(huán)境，還原性物質(zhì)會大量積累，惡化水質(zhì)，影響魚體的生長甚至造成魚體死亡；當(dāng)水體中有機質(zhì)含量過高時，會引起病原微生物的大量繁殖，機體損傷、機能下降的養(yǎng)殖魚類，極易被病原微生物感染，造成流行病暴發(fā)^［12-13］。有報道顯示，有機物質(zhì)含量過高產(chǎn)生的原因有：1）養(yǎng)殖過程中過多投放餌料且在魚進食后未能及時清理；2）養(yǎng)殖魚類的排泄物未及時清理，導(dǎo)致大量積累；3）養(yǎng)殖池中的死魚未及時撈出，池塘中動植物尸體通過微生物的分解會產(chǎn)生大量的有機物；4）淤泥與污水過多^［14-15］。因此，加強養(yǎng)殖管理，如合理投放飼料、清除淤泥、增加水中溶氧量、及時清理池中的死魚、雜草等，不僅能降低疾病暴發(fā)的風(fēng)險，更有利于保證魚類養(yǎng)殖業(yè)長久穩(wěn)定發(fā)展。

2.2 PCR檢測方法的建立

根據(jù)擴增體系，PCR檢測最佳擴增條件確定為：預(yù)變性94 ℃，3 min；變性94 ℃，30 s，退火63 ℃，30 s，延伸72 ℃，30 s，共30個循環(huán)；終延伸72 ℃， 5 min；12 ℃保存。擴增結(jié)果顯示，條帶長度與預(yù)期條帶大小441 bp相符，測序比對正確。敏感性試驗結(jié)果顯示，PCR反應(yīng)的最低檢測量為10³拷貝/μL，表明所建立的PCR方法敏感性良好（見圖2 A）。特異性試驗結(jié)果顯示，該方法對以車輪蟲、斜管蟲和尖前口蟲為代表常見淡水原生動物擴增結(jié)果為陰性，只有固著類纖毛蟲擴增出了約440 bp的目的條帶（見圖2 B），并且分別在累枝蟲和鐘蟲的模板中擴增出了與預(yù)期大小相符的約440 bp特異性條帶（見圖2 C），試驗結(jié)果表明該檢測方法的特異性較好。PCR方法的建立為后續(xù)對冷水魚中該類寄生蟲的調(diào)查提供了技術(shù)便利。

通過已經(jīng)建立的PCR檢測方法，對河北省冷水魚寄生固著類纖毛蟲在魚體及水體中的分布進行調(diào)查結(jié)果顯示，固著類纖毛蟲在養(yǎng)殖魚中感染較為普遍，主要寄生于魚體的鰓部及體表，水體中分布廣泛（見圖3）。測序比對結(jié)果初步顯示，魚體寄生和水中分布的固著類纖毛蟲主要是累枝蟲和鐘蟲2類，初步顯示出本研究建立的PCR檢測方法可應(yīng)用于固著類纖毛蟲的檢測。

2.3 基于18S基因的系統(tǒng)發(fā)育分析

根據(jù)Lynn （2008）分類系統(tǒng)，累枝蟲屬（Epistylis）與鐘蟲屬（Vorticella）均隸屬于寡膜綱（Oligohymenophorea）、固著目（Sessilida）詳見表1。

以累枝蟲為例，累枝蟲屬（Epistylis）因其獨特的生物特性而被作為水質(zhì)指示生物。在以往分類中，常以銀浸染色法所顯示出來的銀線系統(tǒng)區(qū)分其種類，但這對于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，尤其是構(gòu)建基于真實演化進程的分類系統(tǒng)來說，是不方便進行量化及聚類的。本文采用核糖體18S基因部分序列，綜合GenBank序列數(shù)據(jù)和研究中所測序列數(shù)據(jù)，構(gòu)建了Sessilida目的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系?；赟essilida目33個種和Hymenostomatida目4個種（作為外群）的核18S-rDNA序列395個位點，依據(jù)最大似然法（ML）及貝葉斯法（BI）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。結(jié)果顯示，所采樣品中存在固著類纖毛蟲中有累枝蟲（Epistylis sp.）和鐘蟲（Vorticella sp.）2類固著類纖毛蟲（見圖4和圖5）。枝上方的值為ML標(biāo)準(zhǔn)自展值，枝下方的值為BI后驗概率。字母F代表魚體樣本，字母W代表水樣。

綜合形態(tài)學(xué)、PCR及系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果證實了冷水魚養(yǎng)殖水環(huán)境中存在固著類纖毛蟲，本次調(diào)查的冷水魚中寄生有累枝蟲和鐘蟲，但宿主魚并未表現(xiàn)出異常狀態(tài)（呼吸困難、游動遲緩、冒頭、擦邊等），也未發(fā)生大量染病與死亡，可能與之前報道的關(guān)于水生動物疾病的產(chǎn)生原因有關(guān)，即寄生蟲的感染率高但是感染強度并不大，且池塘中無致病性細(xì)菌和病毒的存在不易引起魚類疾病的暴發(fā)^［16］。由于固著類纖毛蟲并不會產(chǎn)生溶解酶，且不具備穿刺或穿透組織的能力。因此，長期以來人們都認(rèn)為固著類纖毛蟲不會對宿主產(chǎn)生機械性損傷，即使誘導(dǎo)了宿主的慢性炎癥反應(yīng)，也可能是由魚與外界環(huán)境不斷接觸摩擦所產(chǎn)生的^［17-18］，直到20世紀(jì)70年代，固著類纖毛蟲造成美國魚類大量死亡事件之后，

才確定該類寄生蟲是魚類疾病重要的體外寄生蟲之一，且固著類纖毛蟲繼發(fā)的細(xì)菌性疾病是造成魚體大量死亡的真正原因，危害魚類養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展^{［9，19-21］}。由圖4和圖5可知，在同一養(yǎng)殖環(huán)境中魚和水中的累枝蟲具有較近的親緣關(guān)系，表明累枝蟲在養(yǎng)殖環(huán)境和魚體之間存在相互傳播的可能性及水質(zhì)對魚類養(yǎng)殖環(huán)境的重要性。有研究顯示，寄生蟲的豐度越大。對魚體的危害越高，對于食源性寄生蟲來說，能夠傳播到人體中的寄生蟲的豐度急劇增加^［22］。采取相同體積的水樣并使用

相同的方法進行核酸檢測發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)殖水中的核酸富集量高于水源和尾水，說明冷水魚的生存環(huán)境有利于該類寄生蟲的繁殖。固著類纖毛蟲寄生于冷水魚，可能會威脅冷水魚的健康，需要引起養(yǎng)殖人員高度重視。

2.4 固著類纖毛蟲的季節(jié)性分布分析

對冷水魚養(yǎng)殖的水源、養(yǎng)殖水及尾水調(diào)查結(jié)果顯示，水源、養(yǎng)殖水及尾水中均有固著類纖毛蟲，推測養(yǎng)殖池中存在固著類纖毛蟲極有可能是因其水源受到了污染，因此，應(yīng)加強對引入水源及水質(zhì)的監(jiān)控。統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，在全年各個季節(jié)均能檢測到固著類纖毛蟲，其檢出率為100%；水體中平均檢出率為94.38%，其中春季為90%、夏季為100%、秋季為100%、冬季為94.44%（見圖6）。單因素方差分析結(jié)果顯示，固著類纖毛蟲的分布在各季節(jié)之間沒有顯著差異（見表2和表3），這可能是因為水體中有機質(zhì)含量過高對感染率與分布率的影響遠(yuǎn)遠(yuǎn)超越了季節(jié)變化對它們造成的影響。通過對養(yǎng)殖水的主要生化指標(biāo)進行監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)殖池塘中總氮含量為3.91 mg/L，遠(yuǎn)超于0.5 mg/L（對魚體產(chǎn)生毒害作用的臨界值），氨氮含量的增多會使水體富營養(yǎng)化，破壞水體的生態(tài)平衡。有人提出質(zhì)疑，水體中氨含量的大量增加會抑制纖毛蟲的生長與繁殖，使其種群快速減少甚至消失，但是喂養(yǎng)的飼料中含有豐富的淀粉，糖類C/N比相對更高，碳源代謝的酸性物質(zhì)與氮源代謝的堿性物質(zhì)就會中和，所以即使寄生蟲的種群密度達到峰值，外界pH值沒有明顯變化，種群密度也會在較長時間內(nèi)維持在較高的水平^［23］。一般養(yǎng)殖池塘水體的溶氧量應(yīng)保持在5～8 mg/L，最低也應(yīng)保持在4 mg/L^［24］，但是本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)水體溶氧量較低，檢測值僅為0.91 mg/L，會影響水體中有機質(zhì)的降解。綜上所述可以推測，與季節(jié)變化相比，養(yǎng)殖環(huán)境中的有機物質(zhì)對該類寄生蟲在魚體與水體中分布的影響較大。

3 結(jié) 語

通過形態(tài)學(xué)以及固著類纖毛蟲PCR檢測方法，對河北省養(yǎng)殖冷水魚類寄生固著類鐘蟲科纖毛蟲進行了初步調(diào)查。結(jié)果表明，固著類纖毛蟲在冷水魚中廣泛寄生，感染率可達100%，無季節(jié)性差異，水體中大量固著類纖毛蟲的存在可能會感染到魚體。對該類寄生蟲的危害性進行預(yù)測，研究此類寄生蟲病的病原危害和流行特點，為寄生蟲病的預(yù)防與診治提供了依據(jù)，對于促進河北省乃至中國冷水魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的穩(wěn)定發(fā)展具有重要參考價值。

但本研究僅確定了魚體和水環(huán)境中固著類纖毛蟲的存在，并未檢測寄生蟲的感染強度，而感染強度可能是影響魚類健康的重要因素。未來還需進一步探討固著類纖毛蟲對冷水魚養(yǎng)殖的危害，發(fā)現(xiàn)危害冷水魚養(yǎng)殖的其他寄生蟲。

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