桑芪益氣養(yǎng)陰方對(duì)胰島素抵抗大鼠肝臟ACC1/FASN/SCD1信號(hào)通路及GLUT2的影響

李麗 劉佳琪 馮穎童 扈覲璽 姜斯佳 高晶 賈嵐 王景霞

胰島素抵抗是2型糖尿病的重要發(fā)病機(jī)制,并貫穿疾病全程。肝臟是胰島素作用的重要靶器官,其對(duì)胰島素的低敏感性是推動(dòng)2型糖尿病發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[1]。正常生理狀態(tài)下,胰島素能調(diào)節(jié)肝臟中糖原、脂類、蛋白質(zhì)等生物大分子的合成,抑制糖異生,維持血糖穩(wěn)態(tài)[2];胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下肝臟糖異生抑制受損,而脂肪合成仍保持較高水平,表現(xiàn)為肝臟脂肪酸和甘油三酯水平升高[3]。肝臟內(nèi)脂質(zhì)積累造成肝臟氧化應(yīng)激和功能受損,進(jìn)一步加重胰島素抵抗,因此,緩解肝臟胰島素抵抗為防治2型糖尿病的重點(diǎn)。

中醫(yī)學(xué)以整體觀、辨證論治理念為指導(dǎo),在糖尿病等慢性病防治方面獨(dú)具優(yōu)勢(shì)。就中醫(yī)而言,2型糖尿病當(dāng)以消渴論治,其病機(jī)演變常遵循“陰虛-氣陰兩虛-陰陽(yáng)兩虛”這一規(guī)律,而氣陰兩虛是貫穿全病程的根本病機(jī),也是病理轉(zhuǎn)機(jī)的關(guān)鍵,故益氣養(yǎng)陰法當(dāng)為消渴病治療的基本大法[4]。桑芪益氣養(yǎng)陰方為結(jié)合中醫(yī)辨證理論及臨床經(jīng)驗(yàn),由黃芪、桑葉、玉竹、葛根、蜂膠粉組合而成,用于氣陰兩虛證消渴患者。前期課題組實(shí)驗(yàn)研究表明[5],該方除改善氣陰兩虛型糖尿病大鼠的證候表征外,還可使模型大鼠的空腹血糖和胰島素抵抗指數(shù)顯著降低,使空腹胰島素、胰島素敏感指數(shù)、胰島β細(xì)胞功能指數(shù)顯著升高,在改善高血糖大鼠糖脂代謝紊亂及胰島素抵抗方面療效顯著。

本研究進(jìn)一步探究桑芪益氣養(yǎng)陰方對(duì)胰島素抵抗大鼠的肝臟保護(hù)作用,并從乙酰輔酶A羧化酶1(Acetyl-coa carboxylase 1,ACC1)/脂肪酸合酶(fatty acid synthase,FASN)/硬脂酰-輔酶A去飽和酶1(stearoyl-CoA desaturase 1,SCD1)信號(hào)通路及葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2(glucose transporter2,GLUT2)表達(dá)等角度,探究其可能的作用機(jī)制,為臨床應(yīng)用提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠48只,體質(zhì)量(220±20)g。購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(京)2016-0006,本研究經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào):BUCM-4-2021052405-2038)。大鼠于北京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物房常規(guī)飼養(yǎng),飼養(yǎng)條件:室溫22～24℃、相對(duì)濕度60%～70%、光照節(jié)律12L:12D。由北京斯貝福生物技術(shù)有限公司提供特殊高脂飼料,配比為豬油10%、蔗糖15%、蛋黃粉15%、酪蛋白5%、膽固醇1.2%、膽酸鈉0.2%、碳酸氫鈣0.6%、石粉0.4%、鼠維持飼料52.6%。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

桑芪益氣養(yǎng)陰方由黃芪、桑葉、玉竹、葛根、蜂膠粉按照4∶2.5∶3∶4∶0.3配比而成,購(gòu)自安徽亳州市京皖中藥飲片廠。制備方法:全方飲片分別用10倍、8倍的加水量煎煮2次,每次2小時(shí),合并2次的濾液,加熱濃縮,真空干燥后打粉,使用前用蒸餾水配制成相應(yīng)濃度的藥液。十味消渴膠囊(天津中新藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司,國(guó)藥準(zhǔn)字號(hào):Z19990033)。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

L-甲狀腺素鈉(美國(guó)BioRuler公司,批號(hào):r5703);鏈脲佐菌素(美國(guó)Sigma公司,批號(hào):102364684);Trizol(美國(guó)Ambion公司,批號(hào):15596-026),HiScript?II Q RT SuperMix for qPCR ,HiScript II Q Select RT SuperMix for qPCR,SYBR Green Master Mix購(gòu)于南京諾唯贊公司,批號(hào)分別為:R223-01、R223-01、Q111-02;Taq Plus DNA Polymerase,DL2000 DNA Marker,dNTP購(gòu)于北京天根生化科技有限公司,批號(hào)分別為:ET105-01、MD114-02、CD117。蛋白marker(10-250KD)(北京海利克思科技有限公司,批號(hào):P12103-2);蛋白marker(20-120KD)(南京金斯瑞生物科技有限公司,批號(hào):M00521);PVDF膜(0.45 μm)(美國(guó)Millipore公司,批號(hào):IPVH00010);兔多抗GAPDH(37KD)(杭州賢至生物有限公司,批號(hào):AB-P-R001);兔多抗ACC1(250KD)、兔多抗FASN(272KD)購(gòu)于武漢三鷹生物技術(shù)有限公司,批號(hào)分別為:21923-1-AP、10624-2-AP;兔單抗SCD1(42KD)(英國(guó)Abcam公司,批號(hào):ab236868);兔多抗GLUT2(57KD)(美國(guó)Affinity公司,批號(hào):DF7510)。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器

臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Centrifuge公司,TY2017005846),水浴鍋(姜堰市天力醫(yī)療器械廠有限公司,TL-420D),全自動(dòng)研磨儀(武漢塞維爾生物科技有限公司,KH-III),酶標(biāo)檢測(cè)儀(美國(guó)Biotek公司,Epoch2C),全自動(dòng)生化分析儀(深圳雷杜生命科技有限公司,Chemray 240),冰凍切片機(jī)(美國(guó)Thermo公司,Cryotome E),切片刀(上海徠卡儀器有限公司,Leica819),成像系統(tǒng)(日本尼康株式會(huì)社,Nikon DS-U3),電泳儀(DYY-7C)、垂直電泳槽(DYCZ-24DN)、電轉(zhuǎn)儀(DYCZ-40)購(gòu)于北京六一儀器廠。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 動(dòng)物分組及給藥 雄性SD大鼠48只,適應(yīng)性喂養(yǎng)5天后,禁食不禁水12小時(shí),測(cè)定給葡萄糖前(即0小時(shí))大鼠血糖值、給予2.5 g/kg 葡萄糖后大鼠0.5小時(shí)和2小時(shí)血糖值為基礎(chǔ)值,以0、0.5小時(shí)基礎(chǔ)血糖水平將48只大鼠平均分為6個(gè)組,即空白組、模型組、陽(yáng)性藥組(十味消渴膠囊)、桑芪益氣養(yǎng)陰方低、中、高劑量組,每組8只。連續(xù)30天進(jìn)行大鼠灌胃給藥,給藥體積為1 mL/100 g,陽(yáng)性藥組給藥劑量為十味消渴膠囊1.32 g/kg、桑芪益氣養(yǎng)陰方低、中、高劑量組灌胃藥物劑量分別為1.25、2.5、7.5 g/kg,空白組、模型組灌胃同等體積生理鹽水。

1.5.2 造模方法 建立由高脂飼料喂養(yǎng)、甲狀腺素(tetraiodothyronine,T4)皮下注射、聯(lián)合鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)注射造成胰島素抵抗糖脂代謝紊亂大鼠模型[6]。適應(yīng)性喂養(yǎng)5天后開始造模,造模周期維持30天,空白組給予維持料飼養(yǎng),其余各組均給予高熱能飼料;除空白組外,其余各組在實(shí)驗(yàn)第21～27天下午14﹕00進(jìn)行上頸部皮下注射T4混懸液(0.2 mg/kg);在實(shí)驗(yàn)第28天除空白組外,各組禁食24小時(shí)(不禁水),在實(shí)驗(yàn)第29天以1 mL/100 g體質(zhì)量的劑量一次性腹腔注射2%STZ溶液(30 mg/kg),注射后繼續(xù)給予高熱能飼料飼養(yǎng)5天,實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取材。

1.5.3 血液及肝臟樣本制備 在實(shí)驗(yàn)第35天,各組大鼠禁食不禁水16小時(shí),第36天早晨,采用腹腔注射1%戊巴比妥鈉(0.5 mL/100 g)麻醉大鼠,腹主動(dòng)脈取血,室溫靜置2小時(shí)后4℃ 3 500 r/min,10分鐘離心,取上層血清,-80℃保存。取肝大葉分裝凍存管轉(zhuǎn)移至液氮凍存,-80℃冰箱存放。

1.6 指標(biāo)檢測(cè)

1.6.1 血清生化分析及肝臟中游離脂肪酸(free fat acid,FFA)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、肝糖原、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-Px)的測(cè)定 采用比色法在全自動(dòng)生化儀上測(cè)各組大鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Alanine aminotransferase,ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(Aspartate aminotransferase,AST)的濃度變化;采用比色法測(cè)各組大鼠肝臟中肝糖原、FFA、MDA、SOD、GSH-Px含量。

1.6.2 RT-qPCR檢測(cè)大鼠肝臟組織ACC1、FASN、SCD1、GLUT2的mRNA表達(dá) 從-80 ℃超低溫冰箱取大鼠肝臟組織,每組隨機(jī)選取3個(gè)大鼠肝臟樣本,Trizol法提取總RNA,將干燥后的RNA溶解于20 μL DEPC水中,取2 μL定量測(cè)試OD260、OD280,余量留待逆轉(zhuǎn)錄。以總RNA為模板合成cDNA,進(jìn)行聚合酶鏈鎖反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)反應(yīng)。擴(kuò)增條件:95°C 10分鐘;95°C 15秒,60°C 60秒,循環(huán)40次;95°C 15秒,60°C 1分鐘,95°C 15秒。在PCR擴(kuò)增結(jié)束后,以2-ΔΔCt表示mRNA相對(duì)表達(dá)量。引物序列見表1。

1.6.3 Western Blot檢測(cè)大鼠肝臟組織ACC1、FASN、SCD1、GLUT2蛋白表達(dá) 每組隨機(jī)選取3個(gè)大鼠肝臟樣本,按試劑盒法提取細(xì)胞總蛋白,蛋白定量法(Bicinchoninic acid,BCA)測(cè)定蛋白濃度。取蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)膜,封閉。用ACC1(1∶1 000、FASN(1∶1 000)、SCD1(1∶1 000)、GLUT2(1∶1 000)、GAPDH(1∶1 000)一抗,4 ℃孵育過夜,PBST洗膜5次,二抗(1∶10 000),室溫孵育2小時(shí),PBST洗膜5次,顯色曝光,image-pro plus分析膠片條帶灰度值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 桑芪益氣養(yǎng)陰方對(duì)胰島素抵抗大鼠血清ALT、AST的影響

與空白組相比,模型組大鼠ALT顯著升高(P<0.01)。與模型組比較,陽(yáng)性藥組大鼠ALT、AST顯著升高(P<0.01),桑芪益氣養(yǎng)陰方各劑量組ALT均顯著降低(P<0.01),桑芪益氣養(yǎng)陰方中、高劑量組AST顯著降低(P<0.01)。見表2。

表2 桑芪益氣養(yǎng)陰方對(duì)胰島素抵抗大鼠ALT、AST的影響

2.2 桑芪益氣養(yǎng)陰方對(duì)胰島素抵抗大鼠肝臟肝糖原和FFA的影響

與空白組相比,模型組大鼠肝臟肝糖原顯著降低(P<0.01),FFA顯著升高(P<0.05)。與模型組比較,陽(yáng)性藥組和桑芪益氣養(yǎng)陰方各劑量組大鼠肝臟肝糖原均顯著升高(P<0.05,P<0.01),桑芪益氣養(yǎng)陰方中、高劑量組大鼠肝臟FFA顯著降低(P<0.05,P<0.01)。見表3。

表3 桑芪益氣養(yǎng)陰方對(duì)胰島素抵抗大鼠肝臟肝糖原和FFA的影響

2.3 桑芪益氣養(yǎng)陰方對(duì)胰島素抵抗大鼠肝臟MDA、SOD、GSH-Px的影響

與空白組相比,模型組大鼠肝臟SOD、GSH-PX顯著降低,MDA顯著升高(P<0.01)。與模型組比較,陽(yáng)性藥組大鼠肝臟MDA顯著降低,SOD、GSH-PX顯著升高(P<0.01)。桑芪益氣養(yǎng)陰方各劑量組大鼠肝臟SOD、GSH-PX顯著升高,MDA顯著降低(P<0.01)。見表4。

表4 桑芪益氣養(yǎng)陰方對(duì)胰島素抵抗大鼠MDA、SOD、GSH-Px的影響

2.4 桑芪益氣養(yǎng)陰方對(duì)胰島素抵抗大鼠肝臟ACC1、FASN、SCD1、GLUT2 mRNA表達(dá)的影響

與空白組比較,模型組大鼠ACC1、FASN、SCD1 mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.01),GLUT2 mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.01)。與模型組比較,陽(yáng)性藥組和桑芪益氣養(yǎng)陰方低、中劑量組大鼠ACC1、FASN、SCD1 mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.01),GLUT2 mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.01)。見表5。

表5 桑芪益氣養(yǎng)陰方對(duì)胰島素抵抗大鼠ACC1、FASN、SCD1、GLUT2基因表達(dá)的影響

2.5 桑芪益氣養(yǎng)陰方對(duì)胰島素抵抗大鼠肝臟ACC1、FASN、SCD1、GLUT2蛋白表達(dá)的影響

與空白組比較,模型組大鼠ACC1、FASN、SCD1蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01),GLUT2蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.01)。與模型組比較,陽(yáng)性藥組大鼠ACC1、FASN、SCD1蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.01),GLUT2蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01);桑芪益氣養(yǎng)陰方各劑量組大鼠FASN、SCD1蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.01),桑芪益氣養(yǎng)陰方中、高劑量組大鼠ACC1蛋白表達(dá)顯著降低,GLUT2蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01)。見表6,圖1。

注A空白組;B模型組;C陽(yáng)性藥組;D桑芪益氣養(yǎng)陰方低劑量組;E桑芪益氣養(yǎng)陰方中劑量組;F桑芪益氣養(yǎng)陰方高劑量組。圖1 各組胰島素抵抗大鼠肝臟ACC1、FASN、SCD1、GLUT2蛋白條帶表達(dá)情況圖

表6 桑芪益氣養(yǎng)陰方對(duì)胰島素抵抗大鼠ACC1、FASN、SCD1、GLUT2蛋白表達(dá)的影響

3 討論

胰島素抵抗是導(dǎo)致2型糖尿病的重要病理機(jī)制之一,同時(shí)也是非酒精性脂肪肝、高脂血癥、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病的共同危險(xiǎn)因素。胰島素抵抗的分子機(jī)制主要有糖毒性、脂毒性、氧化應(yīng)激等,導(dǎo)致胰島素受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)異常。肝臟作為胰島素作用的主要靶器官及糖脂代謝的重要器官,肝臟胰島素抵抗在2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展中起著舉足輕重的作用[7]。GLUT2是一種跨膜載體蛋白,是肝臟和血液之間葡萄糖轉(zhuǎn)移的主要轉(zhuǎn)運(yùn)體,可調(diào)節(jié)葡萄糖跨細(xì)胞膜運(yùn)動(dòng),維持血糖穩(wěn)定。胰島素抵抗情況下,GLUT2蛋白表達(dá)減少,肝細(xì)胞葡萄糖攝取減少,可導(dǎo)致血糖升高[8];反之,肝臟GLUT2表達(dá)水平上調(diào)可促進(jìn)肝組織對(duì)血液中葡萄糖的攝取,降低血糖水平[9]。前期研究顯示,桑芪益氣養(yǎng)陰方能顯著降低氣陰兩虛型糖尿病大鼠的胰島素抵抗指數(shù),本研究結(jié)果顯示桑芪益氣養(yǎng)陰方還能顯著抑制胰島素抵抗環(huán)境下肝臟GLUT2蛋白的減少,增加肝糖原合成,從而降低血糖水平。

胰島素抵抗加速脂肪組織分解并刺激肝臟脂肪合成,引起脂質(zhì)代謝紊亂。脂肪組織加速分解,血液中大量游離脂肪酸流入肝臟,肝臟游離脂肪酸含量增加[10];另外,胰島素抵抗過度刺激脂質(zhì)的從頭合成(de novo lipogenesis,DNL)并使肝臟脂質(zhì)合成長(zhǎng)期亢進(jìn)[11]。DNL是肝臟脂質(zhì)合成的重要途徑,在維持血清甘油三酯穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要作用[12]。ACC1、FASN和SCD1是DNL的三個(gè)關(guān)鍵酶。葡萄糖經(jīng)糖酵解,在三羧酸循環(huán)中產(chǎn)生檸檬酸鹽,CoA在ATP檸檬酸裂解酶的作用下釋放,后經(jīng)ACC1催化并轉(zhuǎn)化生成丙二酰輔酶A,FASN以丙二酰輔酶A為底物合成棕櫚酸酯,SCD1催化棕櫚酸酯發(fā)生去飽和反應(yīng)并延長(zhǎng),產(chǎn)生復(fù)雜脂肪酸[13],造成肝臟內(nèi)甘油三酯過度沉積。本研究顯示,桑芪益氣養(yǎng)陰方可減少肝臟游離脂肪酸含量,并通過下調(diào)胰島素抵抗大鼠肝臟組織的ACC1、FASN、SCD1mRNA和蛋白表達(dá),抑制DNL的過度激活,減少肝臟脂質(zhì)沉積,改善脂代謝紊亂。

氧化應(yīng)激為肝臟糖脂代謝紊亂與肝臟胰島素抵抗、肝功能受損中間環(huán)節(jié)。高血糖狀態(tài)下氧化應(yīng)激,一方面葡萄糖自身氧化作用增加,產(chǎn)生大量自由基;另一方面長(zhǎng)期高血糖使多種蛋白質(zhì)發(fā)生糖基化,形成糖基化終產(chǎn)物,過程中有大量自由基產(chǎn)生,其中SOD、GSH-Px等抗氧化酶的糖基化及活性下降加劇了氧化與抗氧化作用的失衡[14]。此外,過量游離脂肪酸在肝細(xì)胞線粒體內(nèi)發(fā)生β氧化,影響線粒體的活性,使脂肪酸轉(zhuǎn)化為甘油三酯沉積在肝細(xì)胞中,肝臟脂質(zhì)過量沉積加劇肝細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng),產(chǎn)生過多的自由基與活性氧,導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化反應(yīng)[15],并在反應(yīng)末端產(chǎn)生MDA,并消耗SOD、GSH-Px等多種抗氧化酶,從而引起蛋白質(zhì)、核酸等生命大分子的交聯(lián)聚合,使細(xì)胞喪失功能,引起肝臟細(xì)胞凋亡,從而導(dǎo)致肝臟功能紊亂[16]。本研究結(jié)果顯示桑芪益氣養(yǎng)陰方可緩解肝臟氧化應(yīng)激,從而改善胰島素抵抗并保護(hù)肝功能。

從中醫(yī)角度看,在2型糖尿病的發(fā)展過程中,脾虛氣少,津不上承則氣陰兩虛,脾失健運(yùn),不能轉(zhuǎn)谷為精,則濕濁內(nèi)停,這與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中促進(jìn)胰島素抵抗“糖毒”“濁毒”“氧化應(yīng)激產(chǎn)物”等相似[17]。中醫(yī)在健脾益氣養(yǎng)陰的同時(shí),必注重激濁揚(yáng)清,化濕還津。桑芪益氣養(yǎng)陰方中黃芪健脾補(bǔ)氣,益氣養(yǎng)陰;桑葉清熱潤(rùn)燥養(yǎng)陰,生津止渴;葛根健脾益氣,升舉清陽(yáng);玉竹甘寒質(zhì)潤(rùn),益胃生津;蜂膠補(bǔ)虛弱,化濁脂,止消渴。諸藥合用,中州得健,納運(yùn)有常,清陽(yáng)得升,濁陰得降,濕濁得化,津液得復(fù),則消渴得愈?，F(xiàn)代藥理研究顯示,黃芪[18]、桑葉[19]、葛根[20]、玉竹[21]、蜂膠[22]均有確切的降糖作用。

本實(shí)驗(yàn)研究顯示,桑芪益氣養(yǎng)陰方能通過增加肝糖原合成,降低血糖水平,減少糖毒;還能減少肝臟游離脂肪酸含量,減少肝臟脂質(zhì)沉積,改善脂代謝紊亂,從而降低脂毒;尚能緩解肝臟氧化應(yīng)激,從而改善肝臟胰島素抵抗并保護(hù)肝功能,其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)ACC1/FASN/SCD1通路和GLUT2基因和蛋白表達(dá)有關(guān)。桑芪益氣養(yǎng)陰方既能減少糖毒、又能降低脂毒,還能保護(hù)肝臟,體現(xiàn)了中醫(yī)辨證論治,標(biāo)本兼治的特點(diǎn),為高糖高脂人群的疾病防治提供了方向。